临床生化检验方法的选临床生化检验方法的选择和评价择和评价 临床生化检验方法的选择和评价，临床生化检验方法的选择和评价，是临床生化检验质量控制的重要基础工是临床生化检验质量控制的重要基础工作。当建立一个新的方法，或引进新的作。当建立一个新的方法，或引进新的方法、都应对它们的技术性能作出评价，方法、都应对它们的技术性能作出评价，以便科学的选择和应用。以便科学的选择和应用。12一一 检验方法和标准品的分级检验方法和标准品的分级v（一）方法的分级（一）方法的分级 临床生化检验方法根据其准确度与精密临床生化检验方法根据其准确度与精密度的不同可以分为决定性方法、参考方度的不同可以分为决定性方法、参考方法、常规方法等三级。法、常规方法等三级。3v1 1决定性方法决定性方法（definitive methoddefinitive method） 是指准确度最高，系统误差最小，经过是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。用于发或在某些方面不够明确的方法。用于发展及评价参考方法和一级标准品。展及评价参考方法和一级标准品。 4v2 2参考方法参考方法（reference methodreference method） 是是指准确度与精密度已经充分证实的分析指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。这类方法在条件许可的实验室中应经常这类方法在条件许可的实验室中应经常使用。用于评价常规方法和试剂盒，鉴使用。用于评价常规方法和试剂盒，鉴定二级标准品。定二级标准品。53 3常规方法（常规方法（routine methodroutine method） 指性指性能指标符合临床或其他目的的需要，有能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。这类方法的分析范围，而且经济实用。这类方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法（recommended methodrecommended method），推荐方法应），推荐方法应具有足够的实验证据具有足够的实验证据6 三级方法的相互关系三级方法的相互关系常规方法常规方法参考方法参考方法 决定性方法决定性方法准准确确度度增增加加应应用用范范围围增增加加7（二）标准品的分级（二）标准品的分级v国际标准化委员会将标准品（参考物）国际标准化委员会将标准品（参考物）的的定义定义为：为：一类具有一种或多种成分、一类具有一种或多种成分、且含量均匀确定的物质。且含量均匀确定的物质。 ；被用于校正；被用于校正仪器或用于评价一种测定方法的物质，仪器或用于评价一种测定方法的物质，并将其分成三级。并将其分成三级。8（二）标准品的分级（二）标准品的分级1 1一级标准品一级标准品（原级参考物，（原级参考物，primary reference material ） 是一种稳定而均一是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，且有证书；用于校正决质也已经定量，且有证书；用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为定性方法，评价及校正参考方法以及为二级标准品定值。二级标准品定值。9v2 2二级标准品二级标准品（次级参考物，（次级参考物， secondary reference material ） 包括用于包括用于常规分析的标准液。这类标准品可由实常规分析的标准液。这类标准品可由实验室自已配制或为商品，它的示值必须验室自已配制或为商品，它的示值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素用一级标准品和参考方法并由训练有素的，能熟练掌握参考方法的操作者确定；的，能熟练掌握参考方法的操作者确定；主要用于常规方法的评价或为控制物定主要用于常规方法的评价或为控制物定值和常规测定的结果计算。值和常规测定的结果计算。103 3校准品校准品（calibrator） 用二级标准品和常用二级标准品和常规方法测定得到校准品，用于常规测定中规方法测定得到校准品，用于常规测定中的标准的标准4 .4 .控制物控制物（control materialcontrol material） 具有与具有与检测过程相适应的特性，其成分及基质与检测过程相适应的特性，其成分及基质与检测样本相同或相似，且均匀、稳定。检测样本相同或相似，且均匀、稳定。用于质量控制，控制患者样本的测定误差用于质量控制，控制患者样本的测定误差11各级实验方法与参考物的相互关系各级实验方法与参考物的相互关系决定性方法决定性方法决定性方法决定性方法用途：评价参考方法用途：评价参考方法用途：评价参考方法用途：评价参考方法及为一级参考物定值及为一级参考物定值及为一级参考物定值及为一级参考物定值一级参考物一级参考物一级参考物一级参考物用途：发展和评价参考方法，用途：发展和评价参考方法，用途：发展和评价参考方法，用途：发展和评价参考方法， 校正决定性方法和参考方法，校正决定性方法和参考方法，校正决定性方法和参考方法，校正决定性方法和参考方法， 产生二级参考物产生二级参考物产生二级参考物产生二级参考物参考方法参考方法参考方法参考方法用途：为二级参考物及控制物定值，用途：为二级参考物及控制物定值，用途：为二级参考物及控制物定值，用途：为二级参考物及控制物定值，评价常规方法（标准化、偏差、干扰评价常规方法（标准化、偏差、干扰评价常规方法（标准化、偏差、干扰评价常规方法（标准化、偏差、干扰因素）因素）因素）因素） 二级参考物二级参考物二级参考物二级参考物用途：常规方法的工作用途：常规方法的工作用途：常规方法的工作用途：常规方法的工作标准及为控制物定值标准及为控制物定值标准及为控制物定值标准及为控制物定值12二二 常规方法选择的原则常规方法选择的原则v（一）（一）适适用性用性 vv微量快速微量快速vv方法简便方法简便vv安全可靠安全可靠vv成本低廉成本低廉v（二）可靠性（二）可靠性vv较高精密度、准确度较高精密度、准确度vv较好检测范围较好检测范围13（二）方法选择的步骤（二）方法选择的步骤v（一）（一）提出要求提出要求v（二）（二）获取资料获取资料v（三）（三）选定候选方法选定候选方法v（四）（四）候选方法的初步试验候选方法的初步试验v标准曲线的线性范围和重复性；标准曲线的线性范围和重复性；v重复试验重复试验精密度；精密度；v对比试验对比试验准确度；准确度；14第二节第二节 临床生化检验方法学评价临床生化检验方法学评价v方法学评价（方法学评价（evaluation of evaluation of methodologymethodology）通过实验途径测定分析通过实验途径测定分析方法的技术性能，并评价其是否能接受。方法的技术性能，并评价其是否能接受。评价实验的过程就是对误差的测定。评价实验的过程就是对误差的测定。 一、方法学评价的意义和内容一、方法学评价的意义和内容15主要的方法技术性能指标：主要的方法技术性能指标：准确度准确度(accuracy) (accuracy) 灵敏度灵敏度(sensitivity) (sensitivity) 特异度特异度(specificity)(specificity)分析测量范围分析测量范围(analytical measure (analytical measure range, AMR)range, AMR)评价实验的过程就是对误差评价实验的过程就是对误差的测定。的测定。 161.1.确定方法的质量目标确定方法的质量目标2.2.选定及进行适当的揭示分析误差类选定及进行适当的揭示分析误差类型的实验型的实验3.3.收集试验数据，进行统计学分析收集试验数据，进行统计学分析4.4.判断方法判断方法 的可接受性的可接受性二、方法学评价的基本步骤二、方法学评价的基本步骤17三、误差的分类和表示三、误差的分类和表示1.系统误差（系统误差（SE）定义：定义： 指测定值与真值存在的同一倾向的偏指测定值与真值存在的同一倾向的偏差。系统误差或正或负，即具有单向性，差。系统误差或正或负，即具有单向性，一般由恒定的因素引起，并在一定条件一般由恒定的因素引起，并在一定条件下多次测定中重复出现。下多次测定中重复出现。18三、误差的分类和表示三、误差的分类和表示2.系统误差分类系统误差分类 恒定系统误差（恒定系统误差（CE） 指测定值与真值之间存在恒定的指测定值与真值之间存在恒定的误差，其大小与干扰物浓度相关，而与误差，其大小与干扰物浓度相关，而与被测物浓度无关。被测物浓度无关。 比例系统误差（比例系统误差（PE） 误差大小与被测物浓度成正比。误差大小与被测物浓度成正比。19三、误差的分类和表示三、误差的分类和表示3.随机误差（随机误差（RE）定义：定义： 多次重复测定某一物质时出现的误多次重复测定某一物质时出现的误差，误差无一定的大小和方向，数据差，误差无一定的大小和方向，数据呈正态分布。呈正态分布。20 误差类型示意图误差类型示意图比较方法结果比较方法结果试试验验方方法法结结果果比例系统误差比例系统误差恒定系恒定系统误差统误差随机误差21揭示误差类型的实验揭示误差类型的实验 误差类别误差类别 实验实验随机误差（随机误差（RERE） 重复性重复性 比例误差（比例误差（PEPE） 回收回收 恒定误差（恒定误差（CECE） 干扰干扰 系统误差（系统误差（SESE） 方法对比方法对比总误差总误差 （TETE） 重复性和方法对比重复性和方法对比22一、方法评价方案v（一）精密度评价1目的要求 v反映精密度好坏的指标是变异系数CV，CV越小精密度越好，反之则差，故有人称其为不精密度。v变异系数CV包括：批内、批间、日间和总CV，其中总CV最重要，它代表整个分析体系的可重复程度。23v2评价前的准备 v对于评价对象和评价方案均应熟悉。v实验试剂应是同批次配制，或同一批号的商品试剂盒和参考物，仪器也应处于良好的工作状态v实验用标本一般选择2个（亦可更多），一个在正常范围或在医学决定水平附近，另一个为异常值，实验标本的介质应与临床标本一致。v先作一个初步的批内精密度测定，即一个标本重复测定20次，计算出均值，标准差和变异系数24v3评价步骤 用2个标本每天测定2次（2次测定间隔不得少于2小时），每次测定均作双份，共测定20天。每次测定至少做一个质控。 25（二）准确度评价v1 1方法比较试验方法比较试验 将试验方法（待评价或待验证的方法）与将试验方法（待评价或待验证的方法）与比较方法（参考方法或准确度已知的方比较方法（参考方法或准确度已知的方法）进行比较，用于评价试验方法的恒法）进行比较，用于评价试验方法的恒定和比例系统误差。定和比例系统误差。26（二）准确度评价（二）准确度评价v1 1方法比较试验方法比较试验 v(1)(1)要求要求 比较方法应是参考方法或推荐比较方法应是参考方法或推荐方法，如该测定没有参考方法或推荐方方法，如该测定没有参考方法或推荐方法亦可用公认的常规方法。法亦可用公认的常规方法。v但须具备：但须具备：v比较试验方法有更好的精密度。比较试验方法有更好的精密度。v干扰影响已知。干扰影响已知。v与试验方法使用相同的计算单位。与试验方法使用相同的计算单位。27v(2)(2)比较前准备比较前准备 v实验者应熟悉所用的仪器、试验方法、实验者应熟悉所用的仪器、试验方法、比较方法和评价方案。比较方法和评价方案。v实验标本应收集新鲜的正常和异常的实验标本应收集新鲜的正常和异常的临床标本，应有足够宽的浓度范围，各临床标本，应有足够宽的浓度范围，各浓度应有合适的比例。如不能及时测定，浓度应有合适的比例。如不能及时测定，标本应妥善保存并应在分析物的稳定期标本应妥善保存并应在分析物的稳定期内测定。内测定。28v(3)(3)方法比较步骤方法比较步骤 v样本数至少为样本数至少为4040个标本，每个标本用个标本，每个标本用2 2种方法分别作双份测定，如临床标本的种方法分别作双份测定，如临床标本的量太少可将量太少可将2 2份含量相近的标本混合。份含量相近的标本混合。v每天测定每天测定8 8个标本，双份测定时第一个标本，双份测定时第一次按顺序次按顺序1 1，2 27 7，8 8，第二次，第二次8 8，7 72 2，1 1，共测试，共测试5 5天。天。29结果分析结果分析 (1)(1)作图分析作图分析 1)1)差异分析差异分析 2)2)对比分析对比分析 差异图差异图: : Y Y轴轴: :试验方法与比较方法之差试验方法与比较方法之差 X X轴轴: :比较方法的测定值比较方法的测定值 对比图对比图: : Y Y轴轴: :试验方法测定值试验方法测定值 X X轴轴: :比较方法的测定值比较方法的测定值30差异分析图差异分析图对比分析图对比分析图比较方法结果零线差异（试验比较）比较方法结果测定方法结果31v2 2回收试验回收试验 所谓回收即分析方法正确所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。量候选方法的准确度。（1 1）方法：将被分析的纯品标准液加入）方法：将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品，原样品加入同样品中，成为分析样品，原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品，然后量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。为回收量。32v（2 2）回收率计算：理想的回收率为）回收率计算：理想的回收率为100%100%，如某法测血钙的回收率为，如某法测血钙的回收率为95.7%95.7%，有，有4.3%4.3%的比例误差，表明一个含钙真值为的比例误差，表明一个含钙真值为2.5mmol/l2.5mmol/l的标本的标本, ,若用该方法测定若用该方法测定, ,约为约为2.39mmol/l(2.52.39mmol/l(2.595.79% )95.79% )，误差为，误差为0.11mmol/L(2.50.11mmol/L(2.54.3%)4.3%)。33v（3 3）注意事项：）注意事项： 准确吸量准确吸量, ,因为被分析因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果；影响结果； 样品中加入标准液后样品中加入标准液后, ,总的总的浓度必须在方法的分析范围内，一般须加浓度必须在方法的分析范围内，一般须加入高、中、低不同浓度做回收试验，计算入高、中、低不同浓度做回收试验，计算平均回收率；平均回收率； 加入标准液后，最好使实加入标准液后，最好使实验样品的被测浓度达到医学决定浓度；验样品的被测浓度达到医学决定浓度； 加入标准液的体积一般在加入标准液的体积一般在10%10%以内。若稀释以内。若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。过大，误差将发生改变，甚至消失。34（三）线性评价（三）线性评价v1 1目的要求目的要求 线性范围是分析方法的一线性范围是分析方法的一个重要技术指标，它能判断对某一分析个重要技术指标，它能判断对某一分析方法测得的浓度或活性值与设定的浓度方法测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。常规或活性值之间的比例关系的范围。常规方法应具有较宽的分析范围，一般应覆方法应具有较宽的分析范围，一般应覆盖临床可能出现的高值。盖临床可能出现的高值。35v2 2评价前准备评价前准备 v熟悉仪器、评价方案和试剂。熟悉仪器、评价方案和试剂。v评价标本的介质应与实际测定的标本评价标本的介质应与实际测定的标本相一致，理想的标本是病人的低值或高相一致，理想的标本是病人的低值或高值标本，这往往不易收集到，亦可用病值标本，这往往不易收集到，亦可用病人的混合标本加入分析物作为高值标本，人的混合标本加入分析物作为高值标本，用正常人标本作为低值标本。用正常人标本作为低值标本。v浓度范围应以分析项目的线性要求为浓度范围应以分析项目的线性要求为准。准。36v线性评价应有线性评价应有5 5个不同浓度，可选择低个不同浓度，可选择低值和高值标本各一个，低值标本为值和高值标本各一个，低值标本为1 1号，号，高值标本为高值标本为5 5号，二者号，二者3 3：1 1混匀为混匀为2 2号，号，等份混匀为等份混匀为3 3号，号，1 1：3 3混匀为混匀为4 4号，号，2-42-4号号标本的浓度按下式计算：标本的浓度按下式计算：标本浓度标本浓度 = = （C1V1 + C5V5C1V1 + C5V5）/ /（V1 + V1 + V5V5）vC C ：浓度，：浓度，V V ：体积。：体积。37（四）干扰试验（四）干扰试验v1 1目的要求目的要求 v判断评价方法给出的结果是否受非分析物判断评价方法给出的结果是否受非分析物影响及影响程度。影响及影响程度。v干扰是指在测定某分析物的浓度或活性干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时，受另一非分析物影响而导致测定结果时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。增高（正干扰）或降低（负干扰）。v干扰物质可分为内源性（标本中存在的）干扰物质可分为内源性（标本中存在的）和外源性（外界污染的）两类。和外源性（外界污染的）两类。38干扰的机理，可有物理作用、化学作用干扰的机理，可有物理作用、化学作用以及非特异反应等。以及非特异反应等。干扰可能是造成误差的一个重要原因，干扰可能是造成误差的一个重要原因，如果干扰物是恒定的将引起恒定误差，如果干扰物是恒定的将引起恒定误差，如干扰物随病理生理因素影响，将引起如干扰物随病理生理因素影响，将引起随机误差。随机误差。因此，实验室应了解各种测定方法的干扰因此，实验室应了解各种测定方法的干扰情况情况 39v2 2试验前准备试验前准备v 应做的主要干扰物为病人标本中常应做的主要干扰物为病人标本中常常出现的黄疸，脂血和溶血；某些药物常出现的黄疸，脂血和溶血；某些药物如维生素如维生素C C等；实验常用的抗凝剂，防腐等；实验常用的抗凝剂，防腐剂和稳定剂。剂和稳定剂。v质量保证，不存在系统误差；批内精质量保证，不存在系统误差；批内精密度在可接受范围内；应不存在前后结密度在可接受范围内；应不存在前后结果的交叉污染；实验过程有质控监督。果的交叉污染；实验过程有质控监督。40v3 3干扰试验方法干扰试验方法 (1)(1)配对差异配对差异 试验试验: :即将不同浓度的干即将不同浓度的干扰物加入到实验标本中，然后分别测定扰物加入到实验标本中，然后分别测定加与不加干扰物的标本，比较二者有无加与不加干扰物的标本，比较二者有无偏差，并了解干扰物浓度与偏差程度的偏差，并了解干扰物浓度与偏差程度的关系。关系。(2) (2) 用病人标本作偏差分析用病人标本作偏差分析: :41第三节第三节 方法学评价实验（举例）方法学评价实验（举例）v一、批内重复性实验一、批内重复性实验v重复性试验依据时间间隔可分为批内、重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内价重复性试验应由实验者作批内( (或天内或天内) ) 及天间重复性试验。及天间重复性试验。42【目的与要求】v掌握方法学重复性实验的设计原理和基本方法及统计分析；v熟悉重复性实验的注意事项和评价标准。客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小。43【原理】v批内重复性试验是指在相同条件下对同批内重复性试验是指在相同条件下对同一标本在尽可能短的时间内进行一标本在尽可能短的时间内进行m m轮，每轮，每轮轮n n次重复测定，以获得批内精密度数据次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价果相互接近的程度，用于客观评价GOD-GOD-PODPOD法测血糖随机误差的大小。法测血糖随机误差的大小。【操作步骤操作步骤】 将血清标本用将血清标本用GOD-PODGOD-POD法作法作5 5轮，每轮轮，每轮4 4次次血糖测定，即可获得血糖测定，即可获得2020个测定数据。个测定数据。 44【结果计算】v1 1检验检验2020次测定数据中的离群值（用次测定数据中的离群值（用GrubbsGrubbs检验准则，检验离群值检验准则，检验离群值 ）v2 2按照批内精密度的计算公式计算按照批内精密度的计算公式计算5 5轮轮每轮每轮4 4次测定值的平均数次测定值的平均数( )( )、标准差、标准差(S)(S)和变异系数和变异系数(CV%)(CV%)。 454647【评价标准】 v如试验求得的血清葡萄糖如试验求得的血清葡萄糖GOD-PODGOD-POD测定测定法的法的CVCV值值WHOWHO对中等实验室提出的对中等实验室提出的OCV(OCV(3%)3%)标准，即表明实验条件的控制标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按达到最佳条件，试验结果可按OCV%OCV%报告。报告。作为方法探讨实验，其变异系数应该作为方法探讨实验，其变异系数应该OCVOCV标准。标准。48【注意事项】v1. 1. 血糖的医学决定水平值为血糖的医学决定水平值为2.82.8、6.76.7、8.9mmol/L8.9mmol/L。分析物浓度应选择医学决定水。分析物浓度应选择医学决定水平值才更具价值。平值才更具价值。2.2.为了缩小测定值的离散程度，操作中必为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数。反应时间，准确读数。3 3计算批内标准差计算批内标准差(Sw)(Sw)时不可误用连续测时不可误用连续测定精密度的统计学公式。否则会使定精密度的统计学公式。否则会使SwSw的估的估计值明显偏低。计值明显偏低。49【思考题】v1. 1. 重复性试验依据时间间隔可分为几种重复性试验依据时间间隔可分为几种？哪种最符合临床实际？哪种最符合临床实际？2. 2. 重复性试验结果反映了什么误差？重复性试验结果反映了什么误差？3. 3. 方法评价的批内重复性试验在标本浓方法评价的批内重复性试验在标本浓度、样本数、测试方法及统计方法方面度、样本数、测试方法及统计方法方面有什么要求？有什么要求？ 50二、 回收试验v回收即分析方法正确测定加入常规分析回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。用于测定实样品中的纯分析物的能力。用于测定实验方法的比例系统误差。这种误差常随验方法的比例系统误差。这种误差常随分析物的浓度增加而增加，常因样品中分析物的浓度增加而增加，常因样品中其它物质与分析物竞争分析试剂并与之其它物质与分析物竞争分析试剂并与之发生反应而引起。发生反应而引起。51【目的与要求】v掌握方法学回收实验的设计原理和基本掌握方法学回收实验的设计原理和基本方法及统计分析；方法及统计分析；v熟悉回收实验的注意事项和评价标准。熟悉回收实验的注意事项和评价标准。客观评价客观评价GOD-PODGOD-POD法测血糖比例系统误差法测血糖比例系统误差的大小。的大小。52【原理】 v回收试验是发现分析方法比例系统误差回收试验是发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。通过测定的有效评价方法。通过测定GOD-PODGOD-POD法测法测血糖的回收率，能较确切地判断该分析血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，可以方法比例系统误差的有无或大小，可以对方法的准确性作出可靠评价。对方法的准确性作出可靠评价。53【操作步骤】v1 1样品制备样品制备基础样品：基础样品：血清血清0.9ml + 0.1ml0.9ml + 0.1ml生理盐水。生理盐水。回收样品回收样品：血清血清0.9ml0.9ml0.01ml 80mmol/L0.01ml 80mmol/L葡葡萄糖标准液萄糖标准液 0.09ml0.09ml生理盐水。生理盐水。回收样品回收样品：血清血清0.9ml0.9ml0.06ml 80mmol/L0.06ml 80mmol/L葡葡萄糖标准液萄糖标准液 0.04ml0.04ml生理盐水。生理盐水。回收样品回收样品：血清血清0.9ml0.9ml0.09ml 80mmol/L0.09ml 80mmol/L葡葡萄糖标准液萄糖标准液 0.010.01生理盐水。生理盐水。2 2血糖浓度测定血糖浓度测定 按按GOD-PODGOD-POD法测定各制备样法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取平均值。平均值。54【结果计算】5556【注意事项】v1 1分析物浓度应选择医学决定水平，分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水为平血糖测定的医学决定水为平2.82.8、6.76.7、8.9mmol/L8.9mmol/L。2 2纯标准品溶液的加入体积不得超过血纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的清样品的10%10%，避免将血清稀释过度，引，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。起误差的改变或消失。3 3准确加量是最主要的技术关键。准确加量是最主要的技术关键。57【结果判断】 v一般检验方法要求回收率在一般检验方法要求回收率在95%-105%95%-105%之之间，最为理想的回收率应是间，最为理想的回收率应是100%100%。【思考题思考题】1. 1. 什么叫回收试验？在回收试验的样品什么叫回收试验？在回收试验的样品制备中应注意哪些事项？制备中应注意哪些事项？2. 2. 回收试验反映的是方法的哪种误差？回收试验反映的是方法的哪种误差？3. 3. 回收率怎样计算？回收率怎样计算？58三、 干扰试验v干扰试验用于测定某物质加到样品中产干扰试验用于测定某物质加到样品中产生的系统误差，干扰物浓度一定时，产生的系统误差，干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。干扰试验既大小随干扰物的浓度而异。干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。析方法的准确性。59【目的与要求】v掌握方法学干扰实验的设计原理和基本掌握方法学干扰实验的设计原理和基本方法及统计分析；方法及统计分析；v熟悉干扰实验的注意事项和评价标准。熟悉干扰实验的注意事项和评价标准。客观评价客观评价GOD-PODGOD-POD法测血糖恒定系统误差法测血糖恒定系统误差的大小。的大小。60【原理原理】v干扰试验是测定特异性和干扰二者引起的误差。干扰试验是测定特异性和干扰二者引起的误差。在具体方法学评价实验中，首先要确定被试可疑在具体方法学评价实验中，首先要确定被试可疑物质是否引起误差；若能引起误差，再进一步探物质是否引起误差；若能引起误差，再进一步探讨其误差的来源是因方法特异性差还是干扰，若讨其误差的来源是因方法特异性差还是干扰，若加入的物质本身和分析试剂反应并产生读数，这加入的物质本身和分析试剂反应并产生读数，这是特异性差，若加入物质并不与分析试剂反应，是特异性差，若加入物质并不与分析试剂反应，但它改变了分析物和分析试剂间的反应，这是干但它改变了分析物和分析试剂间的反应，这是干扰。本实验选用尿酸做扰。本实验选用尿酸做GOD-PODGOD-POD法测血糖的干扰法测血糖的干扰试验，尿酸可以和试验，尿酸可以和GODGOD反应生成的反应生成的H H2 2O O2 2发生反应，发生反应，使部分使部分H H2 2O O2 2不能参与第二步不能参与第二步PODPOD的偶联反应，从而的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。因此，尿酸降低显色强度，产生负的测定误差。因此，尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。61【操作步骤】v1 1样品制备样品制备基础样品：基础样品：血清血清0.9ml0.9ml蒸馏水蒸馏水0.1ml0.1ml。干扰样品干扰样品：血清血清0.9ml0.9ml9.0mmol/L9.0mmol/L尿酸尿酸标准液标准液0.05ml+0.05ml+蒸馏水蒸馏水0.05ml0.05ml。干扰样品干扰样品：血清血清0.9ml0.9ml9.0mmol/L9.0mmol/L尿酸尿酸标准液标准液0.1ml0.1ml。尿酸样品：尿酸样品：蒸馏水蒸馏水0.9ml0.9ml9.0mmol/L9.0mmol/L尿酸尿酸标准液标准液0.1ml0.1ml。2 2血糖值测定血糖值测定 取各样品按取各样品按GOD-PODGOD-POD法操作。法操作。62【结果计算】6364【注意事项注意事项】 1 1可疑干扰物浓度可疑干扰物浓度 加入可疑干扰物的浓度应加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有可能时应达到明显高于通常所见浓度的上限，有可能时应达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在0.42-0.9mmol/L0.42-0.9mmol/L之间。之间。2 2凡可疑干扰物都应做，这里仅是举例示范。凡可疑干扰物都应做，这里仅是举例示范。3 3无论是方法特异性差或是受干扰，都影响到无论是方法特异性差或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度无关，但与非分析物的量有关，所以产生的误差无关，但与非分析物的量有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差都是恒定系统误差，常以偏差BiasBias作为统计量。作为统计量。BiasBias指所有测定值系统性的偏离真值，表示系统指所有测定值系统性的偏离真值，表示系统误差的大小。在干扰试验中，偏差等于干扰样品误差的大小。在干扰试验中，偏差等于干扰样品测定值与基础样品测定值之差。测定值与基础样品测定值之差。其它注意事项与回收试验相同。其它注意事项与回收试验相同。65【结果判断】 vBiasBias允许误差允许误差(EA)(EA)的临界值，表明由的临界值，表明由干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，可被接受。血糖产生不良影响，可被接受。血糖2.82.8、6.76.7、8.9mmol/L8.9mmol/L时的时的EAEA为为0.56mmol/L0.56mmol/L。66【思考题】v1. 请阐述干扰和特异的概念，怎样用实验来加以区分？2. 干扰试验的样品制备与回收试验的样品制备有何相同点和不同点？3. 干扰试验反映的是何种误差？干扰率怎样计算？ 67四、 方法比较试验v方法比较试验是用两种方法同时测定一方法比较试验是用两种方法同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差批标本计算出两种方法间测定结果的差值，以此来估计被评价方法在实际测定值，以此来估计被评价方法在实际测定病人标本时可能引入的总系统误差的水病人标本时可能引入的总系统误差的水平。平。68【目的与要求】v掌握方法比较实验的设计原理和基本方掌握方法比较实验的设计原理和基本方法及统计分析；熟悉方法比较实验的注法及统计分析；熟悉方法比较实验的注意事项和评价标准。客观评价意事项和评价标准。客观评价GOD-PODGOD-POD法法测血糖系统误差的大小。测血糖系统误差的大小。69【原理】 v方法比较试验是将候选方法与准确度已知方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法的方法( (如参考方法如参考方法) )作对比分析，以评价作对比分析，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验。方法比较试验是用可被采用的重要试验。方法比较试验是用于检测候选方法系统误差的大小包括恒定于检测候选方法系统误差的大小包括恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分误差和比例误差，如对适当的数据进行分析，也可以提供误差的性质。本实验以析，也可以提供误差的性质。本实验以HKHK法测血糖的参考方法作对比来评价法测血糖的参考方法作对比来评价GOD-GOD-PODPOD法测定血糖的总系统误差。法测定血糖的总系统误差。70【数据处理】v1 1将对比试验数据作散点图，图中以将对比试验数据作散点图，图中以x x轴代表对轴代表对比方法的测定值，比方法的测定值，y y轴代表被评价方法的测定数轴代表被评价方法的测定数据，在方格纸上作图应散布于整个测定范围之内。据，在方格纸上作图应散布于整个测定范围之内。 散点图能够提供初步的印象。如果所有测定散点图能够提供初步的印象。如果所有测定值的对应点在直角坐标图中大致呈值的对应点在直角坐标图中大致呈4545角的直线角的直线分布，提示被评价方法与对比方法的测定结果之分布，提示被评价方法与对比方法的测定结果之间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这种情况下，候选方法被采用的可能性极小。种情况下，候选方法被采用的可能性极小。71v2如果如果x、y之间呈直线关系之间呈直线关系,即可用经典的即可用经典的直线回归分析法作统计处理，其结果可以显直线回归分析法作统计处理，其结果可以显示候选方法的测定结果有无系统误差存在，示候选方法的测定结果有无系统误差存在，这种误差可分为三类，即恒定系统误差、比这种误差可分为三类，即恒定系统误差、比例系统误差和例系统误差和(或或)兼有两种误差。兼有两种误差。72v在评价一个候选方法时，最理想的情况是回归直线通过零点，呈45角分布，这时 a 0，b (x/y比值) 1.0，表明既无恒定误差，又无比例误差存在。但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，是会有所波动的。如果a0，b的数值稍偏离1.0，但只要这种偏离程度比较小(可以忽略不计)，据经验判断这一候选方法可以被接受，就能适用于临床检验的常规分析。假如要对回归系数b作出较严密的统计判断， 就需要进一步作回归系数的显著性检验。73v3根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算出候选方法系统误差(SE)的大小，并与不同医学决定水平(Xc)的允许误差(EA)作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。74v4作相关分析 在方法比较试验中，相关系数(r)可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。相关系数(r)按下列公式计算：75【结果判断】v1. 回归方程计算出候选方法系统误差(SE)的大小，与不同医学决定水平(Xc)的允许误差(EA)作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。SE的可接受性判断指标为：v2. 试验方法（Y）与比较方法（X）相关性， r0.975或r20.95说明二法的相关良好。76【注意事项注意事项】v1 1选择试验样品选择试验样品 一般作一般作40-10040-100例，包括常规工例，包括常规工作中可能遇到的整个分析范围，选择合适的样品作中可能遇到的整个分析范围，选择合适的样品分析范围比增加样品的数目更为重要。分析范围比增加样品的数目更为重要。2 2试验方法试验方法 一般每个样品用两种方法各测一次，一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，不是平行最好每个样品用两种方法各测定两次，不是平行测定，而是分两批进行，最好在测定，而是分两批进行，最好在4h4h内进行。内进行。3 3对比方法对比方法 对比方法的选择十分重要，一般应对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法。析误差均可归于被评价的候选方法。77【思考题】v1. 方法比较试验反映的是何种误差？比较方法为何要用参考方法？ 2. 方法比较试验的样本有何具体要求？3.方法比较试验后尚需做哪些统计分析？这些统计结果分别说明方法的哪些性能？4. 做方法比较试验应注意哪些事项？78 分离纯化小麦胚芽中酸性磷酸酶 v【原理原理】 酸性磷酸酶酸性磷酸酶(ACP)(ACP)在自然界中广泛分布于在自然界中广泛分布于植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物种子中的种子中的ACPACP在发芽时含量最丰富。本实验选用新鲜在发芽时含量最丰富。本实验选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACPACP。vACPACP能溶解于稀缓冲液和水中；溶于能溶解于稀缓冲液和水中；溶于35%35%饱和度的硫酸饱和度的硫酸铵溶液中，在铵溶液中，在57%57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；在中性及高温条件下不稳定，在在中性及高温条件下不稳定，在7070时相对稳定；时相对稳定；pHpH小于小于6.56.5时稳定性增加，枸橼酸和乙酸可增加时稳定性增加，枸橼酸和乙酸可增加ACPACP酶溶液的稳定性；酶溶液的稳定性；Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+为为ACPACP激活剂，而激活剂，而Cu2+Cu2+、Hg2+Hg2+、Ag2+Ag2+、Zn2+Zn2+、Pb2+Pb2+、NaFNaF、酒石酸盐、草酸盐、酒石酸盐、草酸盐和甲醛等是和甲醛等是ACPACP的抑制剂。的抑制剂。 79小麦胚芽小麦胚芽100 g200ml 蒸蒸馏水水 捣碎，碎，纱布布过滤滤液液 弃去弃去纱布上固体物布上固体物 4 000 r/min10min弃去沉淀弃去沉淀 上清液上清液80 上清液上清液1 mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 4000 r/min10min弃去沉淀弃去沉淀 上清液上清液54ml饱和和(NH4)2SO4/100ml上清液上清液，达达35%饱和度，和度， 4000 r/min10min 上清液上清液 弃去沉淀弃去沉淀81上清液上清液水浴至水浴至622min622min，迅速冷却至，迅速冷却至6 68, 4000 r/min8, 4000 r/min10min10min 弃去沉淀弃去沉淀 上清液上清液 51ml饱和和(NH4)2SO4/100ml上清液上清液 达达57%饱和度和度 弃去上清液弃去上清液 沉淀沉淀82 沉淀沉淀用相当于用相当于1/3上清液上清液体体积的蒸的蒸馏水溶解沉淀，洗水溶解沉淀，洗涤4000 r/min10min弃去沉淀弃去沉淀 上清液上清液83上清液上清液EDTA和和-30预冷甲醇沉淀冷甲醇沉淀4000 r/min10min 沉淀沉淀 弃去上清液弃去上清液 蒸蒸馏水溶解、洗水溶解、洗涤，4000 r/min10min 弃去沉淀弃去沉淀 上清液上清液84v【注意事项注意事项】1 1制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，因麦粒和麦苗部分酸性制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，因麦粒和麦苗部分酸性磷酸酶活性较低，同时要弃去发霉变质的胚芽。磷酸酶活性较低，同时要弃去发霉变质的胚芽。2 21 mol/L MnCl21 mol/L MnCl2起稳定酶蛋白并除去杂蛋白的作用。起稳定酶蛋白并除去杂蛋白的作用。3 3ACPACP溶于溶于35%35%饱和度的饱和度的(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4溶液中，一些杂蛋白沉淀析溶液中，一些杂蛋白沉淀析出。当饱和度上升至出。当饱和度上升至57%57%时，时，ACPACP便沉淀析出，某些杂蛋白仍便沉淀析出，某些杂蛋白仍溶于上清液中。溶于上清液中。4 4ACPACP在在7070时稳定，加热至时稳定，加热至6262以去除一些不耐热的杂蛋白。以去除一些不耐热的杂蛋白。5 5甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱水析出，甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱水析出，从而除去杂蛋白。由于有机溶剂常引起蛋白质的变性，因此，从而除去杂蛋白。由于有机溶剂常引起蛋白质的变性，因此，此步的关键在于保持甲醇的低温。此步的关键在于保持甲醇的低温。858687