2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心2010年秋季学期分光光度法分光光度法分光光度法分光光度法2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心如何求被测物质的含量如何求被测物质的含量1.1.利用标准管计算测定物的含量利用标准管计算测定物的含量2.2.利用标准曲线计算测定物含量利用标准曲线计算测定物含量3.3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度利用标准系数法求出待测溶液的浓度4.4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度利用消光系数法求出待测溶液的浓度2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心1.1.利用标准管计算测定物的含量利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（C CS S）标准液的吸光度（）标准液的吸光度（A AS S），同），同时也测定末知浓度（时也测定末知浓度（C CU U）的吸光度（）的吸光度（A AU U），），标准管标准管(S)测定管测定管(U)2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心2.2.利用标准曲线计算测定物含量利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（们的吸光度。然后以各管吸光度（A A）为纵坐标，各管的浓）为纵坐标，各管的浓度（度（C C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即到一条通过原点的直线，即标准曲线标准曲线，亦称，亦称工作曲线工作曲线。以。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心标准曲线标准曲线(浓度浓度-吸光度曲线）吸光度曲线）对末知浓度对末知浓度物质测定时，物质测定时，无需再作标无需再作标准管，据测准管，据测定管吸光度定管吸光度从标准曲线从标准曲线上即可求得上即可求得测定物的浓测定物的浓度。度。 0.20.80.40.6AC2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心722722分光光度计的使用分光光度计的使用1. 1. 接通电源，调整波长。接通电源，调整波长。2. 2. 比色杯中加入空白及待测样品，并放入分光光度计中，比色杯中加入空白及待测样品，并放入分光光度计中，注意：加入样品量不超过比色杯体积的注意：加入样品量不超过比色杯体积的2/32/3。3. 3. 调模式为调模式为“ “透射比透射比” ”，对，对空白对照进行调空白对照进行调“ “0 0” ”（开盖）（开盖）和调和调“ “100100” ”（闭盖）。（闭盖）。4. 4. 调模式为调模式为“ “吸光度吸光度” ”，即，即空白对照吸光度为空白对照吸光度为“ “0 0” ”，测，测定待测样品的吸光度值。定待测样品的吸光度值。2010秋季学期秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心722722分光光度计使用的注意事项分光光度计使用的注意事项比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。盛液时达到比色杯的盛液时达到比色杯的2/32/3即可，不能太满，外即可，不能太满，外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。纸擦干净。测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。无误后方可倒掉。