微生物的培养与应用微生物的培养与应用( (一一) )筛选分离分解尿素的细菌筛选分离分解尿素的细菌 （1 1）实验方法）实验方法: :选择培养选择培养 人为提供有利于目的微生物生长人为提供有利于目的微生物生长的条件的条件( (包括营养物质、温度、包括营养物质、温度、PHPH值等值等),),同时抑制其它微生物的生长同时抑制其它微生物的生长. .即微生即微生物的物的选择培养选择培养。 选择培养基选择培养基: :在微生物学中在微生物学中, ,将将允许特定种类允许特定种类的微生物生长的微生物生长, ,同时同时抑制或阻止其它抑制或阻止其它微生物生微生物生长的培养基长的培养基. . （2 2）实验原理）实验原理加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的培养基不加含碳有机物的培养基:分离自养微生物分离自养微生物不含碳、氮源的培养基：不含碳、氮源的培养基：分离自养固氮微生物分离自养固氮微生物改变某种条件改变某种条件:如温度、如温度、PH值等值等(3)(3)培养基成分分析培养基成分分析 在该培养基的配方中，在该培养基的配方中，葡萄糖是葡萄糖是C C源也是能源源也是能源; ;尿素尿素是培养基中的是培养基中的惟一氮源惟一氮源. . 因此，原则上该培养基因此，原则上该培养基只有能够利只有能够利用尿素用尿素的微生物才能够生长。具有选择作用的微生物才能够生长。具有选择作用, ,能够将能够将利用尿素的微生物利用尿素的微生物选择出来选择出来分析分析（二）微生物生长量的测定方法：（二）微生物生长量的测定方法：1 1 1、直接计数法、直接计数法、直接计数法、直接计数法、直接计数法、直接计数法: : :参见必修参见必修参见必修参见必修参见必修参见必修3 3 3 3 3 3注意：注意：注意：注意：注意：注意：接种接种接种接种接种接种一种微生物一种微生物一种微生物一种微生物一种微生物一种微生物，在，在，在，在，在，在液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基培养，培养，培养，培养，培养，培养，定期定期定期定期定期定期取样计数。取样计数。取样计数。取样计数。取样计数。取样计数。2 2 2、间接计数法、间接计数法、间接计数法、间接计数法、间接计数法、间接计数法: : :是根据微生物在培养基上所形成的菌落是根据微生物在培养基上所形成的菌落是根据微生物在培养基上所形成的菌落是根据微生物在培养基上所形成的菌落是根据微生物在培养基上所形成的菌落是根据微生物在培养基上所形成的菌落数来推测样品液中活细菌的数目。数来推测样品液中活细菌的数目。数来推测样品液中活细菌的数目。数来推测样品液中活细菌的数目。数来推测样品液中活细菌的数目。数来推测样品液中活细菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度稀释度是成功地统计是成功地统计菌菌落数目落数目的关键。为了保证结果准确，通常将的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度几个稀释度下的菌液都下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在涂布在平板上，培养后再选择菌落数在3030300300的平板进行计数。的平板进行计数。（1 1 1 11 1）理论依据：）理论依据：）理论依据：）理论依据：）理论依据：）理论依据：说明：说明：说明：说明：说明：说明： 1 1 1 1）间接计数中，恰当的稀释度是成功统计的）间接计数中，恰当的稀释度是成功统计的）间接计数中，恰当的稀释度是成功统计的）间接计数中，恰当的稀释度是成功统计的菌落数目的关键（参见实验设计部分）；菌落数目的关键（参见实验设计部分）；菌落数目的关键（参见实验设计部分）；菌落数目的关键（参见实验设计部分）； 2 2 2 2）间接计数统计的菌落数往往比活细菌数目）间接计数统计的菌落数往往比活细菌数目）间接计数统计的菌落数往往比活细菌数目）间接计数统计的菌落数往往比活细菌数目低。低。低。低。（2 2 2 22 2）操作：）操作：）操作：）操作：）操作：）操作：1)1)设置重复组设置重复组: :增强实验的说服力与准确性（至少增强实验的说服力与准确性（至少2 2个平板个平板););2)2)选择菌落数在选择菌落数在30-30030-300的平板计数。的平板计数。（3 3 3 33 3）计算公式：）计算公式：）计算公式：）计算公式：）计算公式：）计算公式：每亳升样品中的菌株数每亳升样品中的菌株数=CV MC C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)M M代表稀释倍数代表稀释倍数 1. 1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计最好能统计3 3个平板，计算出平板菌落数的平个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释同学的结果与其他同学不同，可能的解释有三种。有三种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误; ;三是实验组太少，缺乏可重复性三是实验组太少，缺乏可重复性。 （三）设置对照（三）设置对照对照实验对照实验是指除了被测条件是指除了被测条件( (实验变量或自变量实验变量或自变量),),其它条件其它条件( (无关变量无关变量) )完全相同的实验完全相同的实验. .分为分为: :空白对照、条件对照、相互对照和标准对空白对照、条件对照、相互对照和标准对照等照等. .另一种方案另一种方案( (空白对照空白对照) )：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染( (做四做四个平板个平板) )。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种实验方案有两种一种方案一种方案( (相互对照相互对照) )：可以由其他同学用与可以由其他同学用与A A同学一样的土样进行实验同学一样的土样进行实验, ,增加实验组数增加实验组数( (每同学做四个平板每同学做四个平板) )，如果结果与，如果结果与A A同同学一致，则证明学一致，则证明A A无误；如果结果不同，则证明无误；如果结果不同，则证明A A同学同学存在操作失误或培养基的配制有问题。存在操作失误或培养基的配制有问题。四、实验案例四、实验案例 实验的具体操作步骤如下实验的具体操作步骤如下: : 1.1.土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土层土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装（左右，再取样，将样品装（事先要事先要灭菌灭菌）入准备好的信封中。）入准备好的信封中。土壤中某样品细菌的分离与计数土壤中某样品细菌的分离与计数 准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基将将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照对照，用来，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为10103 310107 7。每个稀。每个稀释度下需要释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨培个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉膏蛋个牛肉膏蛋白胨培养基。白胨培养基。 2.2.制备培养基制备培养基 将将10 g10 g土样加入盛有土样加入盛有90 90 mLmL无菌生理无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 250 mLmL），），充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1 1 mLmL，转移至盛有，转移至盛有9 9 mLmL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至释至10107 7稀释度，并按照由稀释度，并按照由10107 710103 3稀释度按稀释度按照浓度照浓度从低到高从低到高的顺序的顺序涂布平板涂布平板，不必更换，不必更换移液管。移液管。 3.3.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30 30 温度下培养。温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图图2-102-10的颜色反应。的颜色反应。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株位：株/kg/kg）是不同的。）是不同的。 例如在干旱土壤中的上层样本中：例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧好氧及兼性厌氧细菌及兼性厌氧细菌数约为数约为2 1852 185万，万，放线菌数放线菌数约为约为477477万，万，霉菌数霉菌数约为约为23.123.1万。因此，为获得不同万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。4.4.细菌的计数细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数当菌落数目稳定时，选取菌落数在在3030300300的平板进行计数。在同一稀的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对释度下，至少对3 3个平板进行重复计数个平板进行重复计数，然后求出然后求出平均值平均值，并根据平板所对应，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。的稀释度计算出样品中细菌的数目。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。地等等，都是区分细菌的重要手段。 五、操作提示五、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基是鉴别培养基，可以是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的为的代谢产物与伊红代谢产物与伊红美蓝结合美蓝结合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并带有金属光泽深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。制其他微生物的生长。附：鉴别大肠杆菌培养基附：鉴别大肠杆菌培养基大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 七、例题解析七、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是种内斗争最显著最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在越来越激烈。由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，期，微生物的数目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。斗争主要是与无机环境的斗争。答案：答案：C C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是型是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，旺盛， 和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再，再计算发酵罐中菌体的总重量。计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重（称烘干后的重量）称菌体的湿重（称烘干后的重量）解析：解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型异养需氧型，而而青霉素青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是，另一种是测重量测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。科研的材料。