实实 验验 一一 蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离和等电点【原理】【原理】 【目的】验证蛋白质两性电离的性质【目的】验证蛋白质两性电离的性质, ,测定酪蛋白测定酪蛋白 的等电点。的等电点。碱负酸正碱负酸正【原理】【原理】当蛋白质溶液的当蛋白质溶液的pHpIpHpI时，蛋白质分子带时，蛋白质分子带 电电荷；当蛋白质溶液的荷；当蛋白质溶液的pHpIpHpI时蛋白质分子带时蛋白质分子带 电电荷。荷。在在p pH H值大于或小于值大于或小于pIpI的溶液中，由于存在电的溶液中，由于存在电荷膜的保护，蛋白质分子不易析出。当溶液荷膜的保护，蛋白质分子不易析出。当溶液pHpH等等于于pIpI时，溶液的溶解性时，溶液的溶解性最低最低，溶质容易析出。根，溶质容易析出。根据酪蛋白在不同据酪蛋白在不同pHpH溶液中的溶解度来观察蛋白质溶液中的溶解度来观察蛋白质的两性电离，并测定其等电点。的两性电离，并测定其等电点。负负正正【试剂】【试剂】 1. 5g/L1. 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液酪蛋白乙酸钠溶液 2. 0.01% 2. 0.01%溴甲酚绿（溴甲酚绿（BCGBCG）溶液（指示剂，）溶液（指示剂， ） 3. 0.04 mol/L 3. 0.04 mol/L盐酸溶液盐酸溶液 4. 0.04 mol/L 4. 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 5. 1.0 mol/L 5. 1.0 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 6. 0.1 mol/L 6. 0.1 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 乙酸溶液乙酸溶液 【器材】【器材】 试管试管 试管架试管架 毛滴管毛滴管 记号笔记号笔 蓝蓝 黄黄 pH3.85.4 【实践操作】【实践操作】1.1.取洁净大试管取洁净大试管1 1支，支，按表如下操作按表如下操作操操 作作 步步 骤骤结结 果果结结 果果 分分 析析加入加入5g/L5g/L酪蛋白乙酸酪蛋白乙酸钠溶液溶液2020滴，滴，BCGBCG指示指示剂5 5滴，混匀后，滴，混匀后，观察并察并记录溶液的溶液的颜色。色。缓慢滴加慢滴加0.04mol/L0.04mol/L盐酸溶液，酸溶液，边滴滴边摇，直至，直至产生明生明显的大量沉的大量沉淀，淀，观察并察并记录沉淀与溶液沉淀与溶液颜色色的的变化。化。继续滴入滴入0.04mol/L0.04mol/L盐酸溶液，直酸溶液，直至沉淀全部溶解，至沉淀全部溶解，观察并察并记录沉沉淀与溶液淀与溶液颜色的色的变化。化。滴入滴入0.04mol/L0.04mol/L氢氧化氧化钠溶液，溶液，边滴滴边摇，使之再度，使之再度产生明生明显的的颗粒。粒。 继续滴加滴加0.04mol/L0.04mol/L氢氧化氧化钠溶溶液，直至沉淀溶解，液，直至沉淀溶解，观察并察并记录溶液溶液颜色色变化。化。结论：颜色颜色滴数滴数滴数滴数滴数滴数颜色颜色滴数滴数颜色颜色颜色颜色颜色颜色蓝蓝 黄黄 pH3.85.4 【实践操作】【实践操作】2.2.取取3 3支支小小试管，在试管，在上端标注学号、管号，如下操作，注意混匀上端标注学号、管号，如下操作，注意混匀加入物体（加入物体（滴滴） 1 1 2 2 3 3 蒸馏水蒸馏水 16 30 34乙酸溶液乙酸溶液 6 0.1 mol/L0.1 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 10 1.0 mol/L1.0 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 24 5g/L5g/L酪蛋白乙酸钠溶液酪蛋白乙酸钠溶液 10 10 10溶液溶液PHPH值值 3.2 4.7 5.9 3.2 4.7 5.9 立即混匀各管，静置立即混匀各管，静置 10 10分钟，观察各管沉淀情况分钟，观察各管沉淀情况 【结果与分析】【结果与分析】沉淀情况沉淀情况 结果分析结果分析沉淀结果用沉淀结果用“-，+，+，+”表示并记录于表中。表示并记录于表中。 【注意事项】【注意事项】 1.1.沉淀符号，沉淀符号，“”表示无沉淀，表示无沉淀，“”表示浑浊无明显沉淀，表示浑浊无明显沉淀，“”有明显沉淀，有小颗粒；有明显沉淀，有小颗粒；“”表示大块沉淀。表示大块沉淀。 2. 2.四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。 3. 3.每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。 4. 4.添加各种试剂注意用相应的毛滴管，添加各种试剂注意用相应的毛滴管，不可混用！不可混用！ 5. 5.注意混匀试管，实验注意混匀试管，实验1 1中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管，中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管，接近接近PIPI时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏记入添加试剂记入添加试剂的滴数的滴数。 6.6.实验实验1 1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认（应两次出现沉淀）。认（应两次出现沉淀）。 7. 7.实验实验2 2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。 【实践操作】【实践操作】1.1.取洁净大试管取洁净大试管1 1支，支，按表如下操作按表如下操作操操 作作 步步 骤骤结结 果果结结 果果 分分 析析加入加入5g/L5g/L酪蛋白乙酸酪蛋白乙酸钠溶液溶液2020滴，滴，BCGBCG指示指示剂6 67 7滴，混匀后，滴，混匀后，观察察并并记录溶液的溶液的颜色。色。缓慢滴加慢滴加0.04mol/L0.04mol/L盐酸溶液，酸溶液，边滴滴边摇，直至，直至产生明生明显的大量沉的大量沉淀，淀，观察并察并记录沉淀与溶液沉淀与溶液颜色色的的变化。化。继续滴入滴入0.04mol/L0.04mol/L盐酸溶液，直酸溶液，直至沉淀全部溶解，至沉淀全部溶解，观察并察并记录沉沉淀与溶液淀与溶液颜色的色的变化。化。滴入滴入0.04mol/L0.04mol/L氢氧化氧化钠溶液，溶液，边滴滴边摇，使之再度，使之再度产生明生明显的的颗粒。粒。 继续滴加滴加0.04mol/L0.04mol/L氢氧化氧化钠溶溶液，直至沉淀溶解，液，直至沉淀溶解，观察并察并记录溶液溶液颜色色变化。化。结论：蓝色蓝色蓝色浅沉淀蓝色浅沉淀浅黄（白）浅黄（白）浅蓝色沉淀浅蓝色沉淀蓝色蓝色PH=PIPH=PI，达到等电点时，蛋，达到等电点时，蛋白质无电荷膜保护，彼此白质无电荷膜保护，彼此聚集，容易析出。聚集，容易析出。PHPHPIPI，此时蛋白质带，此时蛋白质带正正电荷，电荷，彼此排斥，不容易析出。彼此排斥，不容易析出。PHPI ，此时蛋白质带，此时蛋白质带负负电荷，电荷，彼此排斥，不容易析出。彼此排斥，不容易析出。PH=PIPH=PI，达到等电点时，蛋，达到等电点时，蛋白质无电荷膜保护，彼此白质无电荷膜保护，彼此聚集，容易析出。聚集，容易析出。酪蛋白具有两性电离的性质，酪蛋白具有两性电离的性质，PH=PIPH=PI时蛋白质容易沉淀，时蛋白质容易沉淀， PH PHPIPI或或PHPHPIPI时，蛋白质带正电荷或负电荷，彼此排斥，不容易沉淀。时，蛋白质带正电荷或负电荷，彼此排斥，不容易沉淀。PHPI ，此时蛋白质带，此时蛋白质带负负电电荷，彼此排斥，不容易析出。荷，彼此排斥，不容易析出。【小测试】【小测试】 名词解释名词解释 1. 1.蛋白质的等电点蛋白质的等电点 2. 2.蛋白质的变性蛋白质的变性请填写下表请填写下表方法方法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法常用试剂沉淀原理对蛋白质生物活性的影响 【实践操作】【实践操作】2.2.取取3 3支支小小试管，在试管，在上端标注学号、管号，如下操作，注意混匀上端标注学号、管号，如下操作，注意混匀加入物体（加入物体（滴滴） 1 1 2 2 3 3 蒸馏水蒸馏水 16 30 34乙酸溶液乙酸溶液 6 0.1 mol/L0.1 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 10 1.0 mol/L1.0 mol/L乙酸溶液乙酸溶液 24 5g/L5g/L酪蛋白乙酸钠溶液酪蛋白乙酸钠溶液 10 10 10溶液溶液PHPH值值 3.2 4.7 5.9 3.2 4.7 5.9 立即混匀各管，静置立即混匀各管，静置 10 10分钟，观察各管沉淀情况分钟，观察各管沉淀情况 【结果与分析】【结果与分析】沉淀情况沉淀情况 结果分析结果分析酪蛋白于酪蛋白于时最容易析出，其等电点为。时最容易析出，其等电点为。 沉淀结果用沉淀结果用“-，+，+，+”表示并记录于表中。表示并记录于表中。 2.2.加入班氏试剂的作用？加入班氏试剂的作用？酪蛋白的等电点是。酪蛋白的等电点是。【思考题】【思考题】 1. 1.加入班氏试剂的作用？加入班氏试剂的作用？ 蛋白质分子中肽链的两个末端，游离的蛋白质分子中肽链的两个末端，游离的羧基羧基可电离成带负电荷的阴离子，游离的可电离成带负电荷的阴离子，游离的氨基可氨基可电离成带正电荷的阳离子，此外多肽链中氨基酸电离成带正电荷的阳离子，此外多肽链中氨基酸残基的侧链中也有可以电离的酸性和碱性集团。残基的侧链中也有可以电离的酸性和碱性集团。