第八章第八章. 免疫免疫组化双重染色技化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry)用免疫用免疫组化方法在同一化方法在同一张组织切片上同切片上同时显示两种或两示两种或两种以上的抗原种以上的抗原, 以以发现其定位其定位, 形形态和功能上的相互关系和功能上的相互关系. 一一. 连续切片双重染色法切片双重染色法 A. 最最简单最可靠最可靠. 用同用同样的免疫的免疫组化方法化方法, 在两在两张相相邻切切片上各片上各显示一种抗原示一种抗原, 然后比然后比较. 由于每由于每张切片上只切片上只进行行一次染色一次染色, 所以不会互相干所以不会互相干扰或出或出现假性双假性双标记. B. 切片厚度切片厚度13 m. 如果如果较厚如神厚如神经组织切片切片(1020 m), 可以采用可以采用“镜像像”法法, 即相即相邻切片翻切片翻转后后贴在在载玻片上玻片上, 或利用或利用软件件PS. 1免疫组化双重染色技术二二. 免疫免疫荧光双重染色法光双重染色法: 用用不同的不同的荧光色素光色素标记不同的抗不同的抗体体, 染色后染色后观察察, 相相应的抗原物的抗原物质显示不同的示不同的颜色色. A. 直接法直接法: 1. 一步法一步法: 将将FITC (490495520530nm, 黄黄绿色色荧光光)和和TRITC (550620nm, 红色色荧光光)分分别标记的两种抗体按一的两种抗体按一定比例混合定比例混合, 使每个抗体均使每个抗体均为最适稀最适稀释度度, 然后孵育切片然后孵育切片. 2. 二步法二步法: 先后依次使用两种先后依次使用两种荧光抗体分光抗体分别孵育切片孵育切片. 2免疫组化双重染色技术3. 观察察: 同一个同一个视野里野里.a. 对每一种每一种荧光光标记物物(绿色或色或红色色)使用不同的使用不同的滤色板色板进行行观察和照相察和照相, 每每张照片照片显示一种示一种荧光光, 比比较两两张照片照片. b. 两种两种荧光重叠照相光重叠照相, 则在一在一张照片上可照片上可发现分分别含不同抗含不同抗原的原的细胞胞(呈呈绿色或色或红色色), 如果两种抗原存在于同一个如果两种抗原存在于同一个细胞胞或或结构构, 则呈呈现两种两种红绿荧光的混合色光的混合色, 如黄色如黄色. 免疫免疫荧光双重染色法光双重染色法: FITC绿色色, TRITC红色色, 混合色混合色为黄色黄色.3免疫组化双重染色技术B. 间接法接法: 1. 两种一抗不两种一抗不标记, 但来自但来自不同种属的不同种属的动物如兔和豚鼠物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于两种来源于同种同种动物或不物或不同种同种动物物的二抗的二抗(如羊抗兔如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗或羊抗兔兔IgG和猪抗豚鼠和猪抗豚鼠IgG)分分别以以FITC和和TRITC标记. 3. 染色程序染色程序:a. 先用第一种一抗和相先用第一种一抗和相应的的标记二抗依次孵育切片二抗依次孵育切片, 显示第示第一种抗原一种抗原; 然后再用第二种一抗和相然后再用第二种一抗和相应的的标记二抗依次孵育二抗依次孵育切片切片, 显示第二种抗原示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种再将两种标记的二抗混合后的二抗混合后孵育切片孵育切片, 最后用最后用荧光光显微微镜观察察. 4免疫组化双重染色技术免疫免疫荧光双重染色法光双重染色法: FITC绿色色, TRITC红色色, 混合色混合色为黄色黄色.5免疫组化双重染色技术Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue6免疫组化双重染色技术三三. 免疫免疫酶双重染色双重染色A. 单酶法法: 1. 原理原理: a. 用一种用一种酶如如 HRP标记显示两种不同的抗原示两种不同的抗原, 但用但用不同不同的的电子供体子供体如如 DAB和和CN呈呈现不同不同颜色的反色的反应终产物物. b. 两种一抗两种一抗来自同种属来自同种属动物物, 两重染色之两重染色之间需将第一次需将第一次染色反染色反应中的中的各各级抗体和抗体和酶或或各各级抗体抗体, 酶和反和反应产物物从从组织上上洗脱洗脱. c. 连续做两次染色做两次染色, 所所费时间较长. 7免疫组化双重染色技术抗体抗体, 酶和反和反应产物洗脱物洗脱8免疫组化双重染色技术2. 染色的最佳条件染色的最佳条件: 先先对两种待两种待检抗原分抗原分别染色染色, 以决定合适以决定合适的抗体稀的抗体稀释度和反度和反应条件等条件等. 3. 双重染色的先后次序双重染色的先后次序: a. 先先显示含量示含量较少的抗原少的抗原. b. 先先显示容易受染色示容易受染色过程和洗脱程和洗脱过程影响的程影响的组织抗原抗原.c. 先用不太敏感的抗体先用不太敏感的抗体.d. 先用先用DAB显色色. 4. 对照照试验: a. 单染染对照照.b. 在在进行第二次染色前行第二次染色前, 要要证明第一次染色的各明第一次染色的各级抗体和抗体和酶活活性被完全除去性被完全除去, 而且洗脱后而且洗脱后对第二个待第二个待检抗原无影响抗原无影响. 9免疫组化双重染色技术5. 抗体洗脱抗体洗脱:a. 酸洗法酸洗法: pH2.2甘氨酸甘氨酸-HCl缓冲液冲液(可加入适量二甲基甲可加入适量二甲基甲酰胺胺, DMF)14小小时使抗原使抗原-抗体复合抗体复合物解离物解离. b. 氧化法氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分分, 氧化除去抗体氧化除去抗体, 0.5% Na2S2O5漂白液脱色漂白液脱色. 第一次染第一次染色用色用CN显色色, 并注意并注意对第二种第二种抗原的影响抗原的影响.c. 甲甲醛蒸气法蒸气法: 1升容器升容器+3g多多聚甲聚甲醛+切片切片, 置置80烤箱烤箱14小小时, 蒸汽破坏抗体的蒸汽破坏抗体的Ig结合部位合部位.第一次用第一次用ABC法法, 氧化法洗脱抗氧化法洗脱抗体体. 对照照试验证实此此为假性双假性双标.10免疫组化双重染色技术6. 具体操作步具体操作步骤: a. 方法方法1: 第一次染色后第一次染色后, 除去抗体和除去抗体和酶而使有色反而使有色反应终产物留在抗原部位物留在抗原部位, 再用同再用同样方法方法进行第二次染色行第二次染色. *. 切片切片处理理, 抑制内源性抑制内源性酶及正常血清封及正常血清封闭同前同前. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色色. TBS洗两次洗两次, 每次每次510分分. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱. TBS洗如上洗如上. *. 用用PAP法完成第二次染色法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色色. TBS洗如上洗如上. 甘油胶封片甘油胶封片. 11免疫组化双重染色技术一抗来自同种一抗来自同种动物的物的单酶法免疫法免疫酶双重染色双重染色 12免疫组化双重染色技术大鼠垂体前叶促性腺激素大鼠垂体前叶促性腺激素细胞胞(蓝色色)和生和生长激素激素细胞胞(棕色棕色), 免疫免疫酶(PAP法法)双重染色双重染色.13免疫组化双重染色技术b. 方法方法2: 第一次染色后第一次染色后, 照相照相记录结果并果并记住照相住照相视野的部野的部位位. 用有机溶用有机溶剂将反将反应终产物溶解除去物溶解除去, 并将第一次染色形成并将第一次染色形成的的抗体复合物洗脱掉抗体复合物洗脱掉, 然后然后进行第二次染色行第二次染色. 对同一部位再一同一部位再一次照相次照相, 比比较先后照相所得照片先后照相所得照片. *. 切片切片处理同上理同上. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色色. TBS洗两次洗两次, 每每次次510分分. *. 以以TBS封片封片, 照相照相(注意随注意随时从盖片从盖片边缘补加加TBS, 防止切防止切片干燥片干燥). *. 去盖片去盖片, TBS洗洗, 再用酒精再用酒精-二甲苯二甲苯-酒精酒精处理理, 除去除去CN蓝色色反反应产物物, DDH2O洗洗. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱, 然后然后TBS洗两次如前洗两次如前. *. PAP法完成第法完成第2次染色次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或或CN-H2O2显色色. *. TBS洗同上洗同上, 封片封片. *. 找出第一次照相的部位找出第一次照相的部位, 再次照相再次照相. 14免疫组化双重染色技术大鼠垂体前叶大鼠垂体前叶GnRH相关相关肽阳性阳性细胞胞(左左, 蓝色色)与促性腺激素与促性腺激素细胞胞(右右, 棕色棕色)为同一种同一种细胞胞, 免疫免疫酶(PAP法法)双重染色双重染色.15免疫组化双重染色技术B. 双双酶法法: 1. 原理原理: a. 用两种无关的用两种无关的酶分分别标记显示两种抗原示两种抗原, 常用的常用的酶为HRP和和AKP, 或或HRP和葡萄糖氧化和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于两种一抗来源于不同种属的不同种属的动物物, 如兔和小鼠如兔和小鼠, 或同种或同种动物物(如小鼠如小鼠)的两种的两种单克隆克隆抗体抗体, 但其但其Ig亚类不同不同, 如如IgGl和和IgG2a. c. 两种二抗分两种二抗分别是抗兔是抗兔IgG和抗小鼠和抗小鼠IgG, 或抗小鼠或抗小鼠IgGl和和抗小鼠抗小鼠IgG2a. 可以来自可以来自同种属同种属动物或不同种属物或不同种属动物物, 可以可以是是酶标抗体抗体(一个用一个用HRP, 另一个用另一个用AKP标记), 也可以是未也可以是未标记抗体抗体(一个用兔一个用兔PAP, 另一个用小鼠另一个用小鼠APAAP).16免疫组化双重染色技术c. 可避免抗体残留而引起的假性双可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中不需中间洗脱洗脱处理理. 由于无交叉反由于无交叉反应, 可将两重染色的同一可将两重染色的同一层抗体混合同抗体混合同时使用并使用并先后先后显示示两种两种酶的活性的活性, 在同一在同一张切片上切片上获得不同得不同颜色的反色的反应终产物物, 如棕色和如棕色和蓝色色. 如两种抗原共存于同一个如两种抗原共存于同一个细胞胞, 则出出现灰紫色的混合色灰紫色的混合色. 17免疫组化双重染色技术2. 染色的最佳条件染色的最佳条件: 先先对两种待两种待检抗原分抗原分别染色染色, 以决定以决定合适的抗体稀合适的抗体稀释度和反度和反应条件等条件等. 3. 双重染色的先后次序双重染色的先后次序: 先先显示示HRP, 再再显示示AKP或葡萄或葡萄糖氧化糖氧化酶. 4. 对照照试验: a. 单染染对照照.b. 必需排除两套抗体系必需排除两套抗体系统之之间的的交叉反交叉反应. 如第二种羊如第二种羊抗兔抗兔IgG二抗可能与第一种小鼠二抗可能与第一种小鼠IgG一抗一抗结合而出合而出现假性假性双双标记, 因此因此应事先做抗体事先做抗体进行交叉染色行交叉染色实验. 18免疫组化双重染色技术5. 染色步染色步骤: 以先后使用以先后使用PAP法和法和APAAP法法为例例. a. 切片切片处理理, 抑制内源性抑制内源性酶及正常血清封及正常血清封闭如前如前. b. 两种一抗混合液两种一抗混合液(各自稀各自稀释度由度由单染色决定染色决定), 室温室温30分分或或4过夜夜. TBS洗两次洗两次, 每次每次510分分. c. 两种二抗混合液两种二抗混合液(各自稀各自稀释度由度由单染色决定染色决定), 室温室温30分分. TBS洗同上洗同上. d. PAP和和APAAP混合液混合液(各自稀各自稀释度由度由单染色决定染色决定), 室温室温30分分. TBS洗同上洗同上. e. 显示示HRP, 如用如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色下控制染色. TBS洗同上洗同上. f. 显示示AKP, 如用如用萘酚酚AS-MX磷酸磷酸盐加固加固蓝BB, 镜下控制下控制染色染色. TBS洗同上洗同上. g. 甘油胶封片甘油胶封片. 19免疫组化双重染色技术6. 注意事注意事项: a. 过厚厚切片切片(7 m)可能出可能出现混合色混合色(双双标记)的假象的假象. b. APAAP法中法中缓冲液用冲液用TBS而不用而不用PBS, 或至少在或至少在显示示酶活性的一步中用活性的一步中用TBS. c. 内源性内源性AKP一般不会引起一般不会引起问题. d. 正常血清封正常血清封闭用两种二抗来源用两种二抗来源动物的正常血清物的正常血清. 四四. 免疫免疫酶-免疫免疫荧光双重染色法光双重染色法: 首先用免疫首先用免疫酶法法显示示第一种抗原第一种抗原, 然后用然后用间接免疫接免疫荧光法定位第二种抗原光法定位第二种抗原. 若若两个一抗来自同一两个一抗来自同一动物物, 需要注意可能需要注意可能发生的生的交叉反交叉反应.20免疫组化双重染色技术五五. 免疫免疫酶-免疫金免疫金(银)双重染色法双重染色法: A. 免疫免疫酶-免疫金双重染色法免疫金双重染色法: 1. 用用PAP法法显示第一种抗原示第一种抗原, 为了加了加强与胶体金的与胶体金的红色色的的对比比, 用用CN显色色(蓝色色), 如如该抗原存在于神抗原存在于神经, 则用用DAB显色色. 2. 用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物, 继之用之用IGS法法显示第二种抗原示第二种抗原, 在光在光镜下下监视染色染色, 直到出直到出现满意意的的红色色为止止. 3. 用用PAP法后再用法后再用IGS法法, 可防止可防止标记在二抗的胶体金在二抗的胶体金颗粒与抗体一起洗脱掉粒与抗体一起洗脱掉. 金金标抗体穿透抗体穿透组织能力差能力差, 常常需用需用较大的一抗和金大的一抗和金标抗体抗体浓度并提高其穿透力度并提高其穿透力. 21免疫组化双重染色技术B. 免疫免疫酶-免疫金免疫金银双重染色法双重染色法: 1. 用用IGSS法法显示第一种抗原示第一种抗原, 用用5nm小小颗粒胶体金粒胶体金标记二二抗抗. 应用物理用物理显影液影液进行行银加加强后后, 在金在金颗粒周粒周围形成金属形成金属银壳壳, 不但增不但增强了金了金颗粒的可粒的可见度度, 而且封而且封闭了第一次染色了第一次染色的各的各级抗体抗体, 从而从而避免了避免了第二次染色第二次染色试剂发生生交叉反交叉反应. 因因银壳可能覆盖第二种抗原壳可能覆盖第二种抗原, 该法只适用于两种抗原存在于法只适用于两种抗原存在于不同不同组织结构构. 2. 缓冲液冲液彻底清洗后底清洗后, 再用免疫再用免疫酶法法(如如PAP或或ABC法等法等)显示第二种抗原示第二种抗原. IGSS法所得黑色可与免疫法所得黑色可与免疫酶法所得棕色法所得棕色, 蓝色等形成色等形成显明明对比比. 22免疫组化双重染色技术此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！23免疫组化双重染色技术