PCR引物设计及相关软件使引物设计及相关软件使用用主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction (Polymerase Chain Reaction ,PCR),PCR)是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, ,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。 PCR引物设计引物设计n n引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 n n如引物长度（如引物长度（primer lengthprimer length），），产物长度产物长度（product lengthproduct length），），序列序列Tm Tm 值值(melting (melting temperature)temperature)，引物与模板形成双链的内部引物与模板形成双链的内部稳定性稳定性(internal stability, (internal stability, 用用 G G 值反映值反映) )，形成引物二聚体，形成引物二聚体(primer (primer dimerdimer) )及发夹及发夹结构（结构（duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin）的的能值，在错配位点（能值，在错配位点（false priming sitefalse priming site）的引发效率，引物及产物的的引发效率，引物及产物的GC GC 含量含量（compositioncomposition），），等等。必要时还需对引等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。进突变等。具体因素具体因素一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 15-30 bpbp，常用的是常用的是18-24 18-24 bpbp，但不应大于但不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于长度大于16bp16bp是必要的（不容易引起错配）。是必要的（不容易引起错配）。n n例如：一个长度为例如：一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存的引物在人类基因组上存在在200200个潜在的退火位点个潜在的退火位点( (3 x 103 x 109 9/4/41212=200 ).=200 ).而一个而一个长度为长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的退火位点的引物在人基因组上存在的退火位点只有只有1/4001/400个个. .n n较长的引物（较长的引物（28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点于产生一些突变位点n nTm值的计算n n一般的公式n nTm = 4 (G+C) + 2(A+T) n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）一般原则一般原则2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 一般原则一般原则3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则一般原则4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%一般原则一般原则5. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） 一般原则一般原则6. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 一般原则一般原则7. 引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。 常用的引物设计软件常用的引物设计软件n nOligo 6 （引物评价）*n nPrimer Premier （自动搜索）*n nVector NTI Suitn nDnasisn nOmigan nDnastarn nPrimer3 （在线服务）*Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的使的使用技巧简介用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析简并引物设计简并引物设计n n根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 1、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（Ciliate Ciliate MacronuclearMacronuclear）2 2、无脊椎动物线粒体（无脊椎动物线粒体（Invertebrate MitochondrionInvertebrate Mitochondrion）3 3、支原体（支原体（MycoplasmaMycoplasma）4 4、植物线粒体（植物线粒体（Plant MitochondrionPlant Mitochondrion）5 5、原生动物线粒体（原生动物线粒体（Protozoan MitochondrionProtozoan Mitochondrion）6 6、一般标准（一般标准（StandardStandard）7 7、脊椎动物线粒体（脊椎动物线粒体（Vertebrate MitochondrionVertebrate Mitochondrion）8 8、酵母线粒体酵母线粒体（Yeast MitochondrionYeast Mitochondrion）Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)Preimer Premier 启动界面Load sequence基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main windowSome other useful function of PP5EnzymeMelting temperature graphPer 25-merGC% graphPer 25-merStability Per 5-merOligoOligo 6.44 6.44 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计软件Oligo 6.44 启动界面启动界面Open sequence file3个弹出窗口个弹出窗口Melting temperatureMelting temperatureG Internal StabilityFrq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用用Oligo 设计引物时的设计引物时的3个标准个标准n nTm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。n nFrq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。n nG 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析引物分析n n首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。引物分析引物分析n n二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。引物分析引物分析n n第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。n n第四False priming 检查引物分析引物分析Key information of primerHairpinDimer and cross DimerGC%Total PCR informationFinal PCR informationSearch for primer using Oligo 6.44Search primerOnline primer3 service n nhttp:/frodo.wi.mit.edu/