乳汁中含有人生长激素乳汁中含有人生长激素的转基因牛的转基因牛( (阿根廷阿根廷) )转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄转基因抗虫棉转基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉DNA重组技术的基本工具基因工程的概念基因工程的概念基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基因工程的概念基因工程的概念基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与载体与载体与载体与载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) )上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与载体与载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的剪刀剪刀限制酶限制酶基因的基因的针线针线DNA连接酶连接酶基因的基因的运载工具运载工具载体载体DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具本节知识内容1 DNA1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 限制性内切酶作用过程限制性内切酶作用过程识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸序列序列序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位特定部位特定部位的两的两的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要是从主要是从主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的一的一的一的一种酶。能将外来的种酶。能将外来的种酶。能将外来的种酶。能将外来的DNADNA切断切断切断切断，由于这种，由于这种，由于这种，由于这种切割作用是在切割作用是在切割作用是在切割作用是在DNADNA分子内部进行的，故分子内部进行的，故分子内部进行的，故分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。4000种。种。 1、来源：、来源： 2、种类：、种类：3、作用：、作用：4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端一、一、 “分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶粘性末端粘性末端平末端平末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶EcoRI 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？限制限制限制限制酶酶酶酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫是平整的，这样的切口叫平末端平末端。二、二、 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的来，这样一个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。DNA连接酶的作用过程3、区别：、区别：E.coliDNA连接酶连接黏性末端连接黏性末端T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又可以连接连接酶既能连接黏性末端，又可以连接平末端（效率低）平末端（效率低） T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连连接酶。另一种是从接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链接双链DNA的缺口（的缺口（nick），而不能连接单链），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5位位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的板链互补的DNA链；而链；而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。组成和性质各不相同。三、三、 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体：基因进入受体细胞的载体：外源基因外源基因(胰岛素胰岛素基因基因)怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细胞胞(大肠杆菌大肠杆菌)？导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具载体载体。载体的作用有哪些？载体的作用有哪些？作用一作用一：作为运载工具，将外源基因：作为运载工具，将外源基因(胰岛素胰岛素基因基因)转移转移到受体细胞到受体细胞(大肠杆菌大肠杆菌)中去。中去。作用二作用二：利用载体在受体细胞：利用载体在受体细胞(大肠杆菌大肠杆菌)内，内，对外源基因对外源基因(胰岛素基因胰岛素基因)进行进行大量复制大量复制。作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中）能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。2）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以，以便与外源基因连接。便与外源基因连接。3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。的基因等。常用的载体主要有两类：常用的载体主要有两类： 1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒基因工程的基因工程的“专用工具专用工具”运载体运载体运载体运载体：常：常用用质粒、质粒、质粒、质粒、 噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒特点：质粒特点：质粒特点：质粒特点：1、细菌拟核外双链环状、细菌拟核外双链环状DNA分子分子2、能自我复制并在受体细胞、能自我复制并在受体细胞中稳定存在中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的标记基因、有特殊的标记基因练习答案2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（分子很多都是质粒（plasmid），），即独立于细菌拟核处染色体即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1） 载体载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。不至于因目的基因的插入而失活。（2） 载体载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体上随染色体DNA的复制而同步复制。的复制而同步复制。（3） 载体载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。选。（4） 载体载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5） 载体载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。太大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。行人工改造后才能用于基因工程操作。课本知识回顾基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术基因基因修饰改造修饰改造定向地定向地DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” “分子运输车分子运输车” 限制酶限制酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要是从主要是从 的一种酶。的一种酶。识别双链识别双链DNA 分子的某种分子的某种 ，并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的的 断开。断开。形成两种末端形成两种末端原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端平末端平末端二、二、 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体通常有三种:在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在基础上进行过的质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造