生物工程概论 动物科技学院动物科技学院第一章绪论 第一节第一节 生物工程的概述生物工程的概述1.1 生物工程的产生及定义1.2 生物工程的种类1 .1生物工程的产生及定义生物工程概念的提出1917年匈牙利工程师提出： 用甜菜作为饲料进行大规模养猪,及利用生物将原料转化成为产品.19世纪：人类有意识的利用酵母进行大规模发酵生产：酒精、面包酵母、柠檬酸1928年 发现青霉素，同时以获取细菌的次级代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业成为当时生物技术的支柱产业。20世纪50年代氨基酸发酵工业成为生物工程的一个新成员20世纪60年代酶制剂工业的出现20世纪末、21世纪初 人类基因组测序酵母基因组测序、水稻基因组测序先后基本或全部完成，使生物技术发生了巨大的革命，逐步形成了以基因工程为核心的现代生物技术生物工程定义的充实1917：利用生物将原材料转化为产品1982：应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物作为反应器，将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术 生物工程的定义：生物工程的定义：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的，即现代生物工程技术。1.2 生物工程的种类基因工程细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程应用：农业、环境、食品、医药等多个方面 基因工程基因工程也叫基因操作、遗传工程或重组DNA技术，是20世纪70年代以后兴起的一门新技术。基因工程(gene engineering) 是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的 技术。即按照人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因(DNA 分子)在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复 制、转录和表达的操作，也称DNA重组技术。因此，由该技术构建的且具有 新遗传性状的生物称为基因工程生物或转基因生物。细胞工程细胞工程细胞工程(cell engineering)是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改 变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获 得某种有用物质的技术。细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞 融合技术(也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。发酵工程发酵工程发酵工程(fermentation engineering)是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段(主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化)生产各种特定的有用物质；或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。酶工程酶工程利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能以及对酶进行的修饰改造，并借助于生物反应器生产人类所需产品的一项技术。主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。蛋白质工程蛋白质工程 蛋白质工程(protein engineering)这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的，它是指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰、改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。 现代生物技术的发展现代生物技术的发展 现代生物技术时期是以分子生物学的理论为先导，以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。1944年美国微生物学家Avery等用实验证明了DNA是遗传信息的携带者。1953年美国学者Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，1958年Crick又阐明了DNA的半保留复制模式，从而奠定了现代分子生物学的基础。1961年Nirenberg，1965年 Holley，1967年Khorana分别对20种常见氨基酸以及起始和终止密码完成了破译。1972年 Berg创建了DNA体外重组技术，这标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。生物工程发展的趋势 目前三个平台：DNA重组、细胞培养和DNA芯片未来将会形成的几个新的平台 1.基因组平台 2.生物芯片 3.干细胞生物学 4.生物信息学 5.神经科学第二章 基因工程基因工程基础基因工程基础内内容容基因工程研究基因工程研究基因工程的应用基因工程的应用第一节第一节基因工程基础基因工程基础基因工程的定义、研究内容基因工程的工具酶基因工程的载体基因工程中的一些主要分子生物学方法基因工程基因工程geneengineering运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。基因工程的基本过程就是利用重组基因工程的基本过程就是利用重组基因工程的基本过程就是利用重组基因工程的基本过程就是利用重组DNADNA（recombinantDNArecombinantDNA）技术，在体外通过人）技术，在体外通过人）技术，在体外通过人）技术，在体外通过人工工工工“ “剪切（剪切（剪切（剪切（cutcut）” ”和和和和“ “拼接（拼接（拼接（拼接（splicesplice）” ”等方法，等方法，等方法，等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因。生出人类需要的基因。生出人类需要的基因。生出人类需要的基因。基因工程是用人工的方法把不同生物基因工程是用人工的方法把不同生物基因工程是用人工的方法把不同生物基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进的遗传物质（基因）分离出来，在体外进的遗传物质（基因）分离出来，在体外进的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基得到高效表达，最终获得人们所需要的基得到高效表达，最终获得人们所需要的基得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。因产物。因产物。因产物。基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因工程研究的理论依据基因工程研究的理论依据不同的基因有相同的物质基础不同的基因有相同的物质基础不同的基因有相同的物质基础不同的基因有相同的物质基础基因是可切割的基因是可切割的基因是可切割的基因是可切割的基因是可转移的基因是可转移的基因是可转移的基因是可转移的多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的遗传密码是通用的遗传密码是通用的遗传密码是通用的基因工程技术路线基因工程技术路线1 1、DNADNA片段的取得（目的基因的分离和制备）片段的取得（目的基因的分离和制备）片段的取得（目的基因的分离和制备）片段的取得（目的基因的分离和制备）2 2、DNADNA片段和载体的连接片段和载体的连接片段和载体的连接片段和载体的连接重组体重组体重组体重组体DNADNA3 3、外源、外源、外源、外源DNADNA片段引入受体细胞片段引入受体细胞片段引入受体细胞片段引入受体细胞基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆和基因文库和基因文库和基因文库和基因文库4 4、选择基因（目的基因）、选择基因（目的基因）、选择基因（目的基因）、选择基因（目的基因）5 5、目的基因表达、目的基因表达、目的基因表达、目的基因表达切接转选表达1.1基因工程的工具酶基因工程的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶基因的剪刀基因的剪刀基因的针线基因的针线一类能够识别和切割双链一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷分子内核苷酸序列的内切核酸酶。酸序列的内切核酸酶。restrictionendonuclease这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶根据酶的功能、大小和反应条件，及切割根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为的特点，可以将限制性内切酶分为三类：三类：型酶、型酶、型酶、型酶、型酶型酶型酶不适合做基因工程的工具酶型酶不适合做基因工程的工具酶型酶在基因工程中也不常用型酶在基因工程中也不常用型酶是基因工程理想的工具酶型酶是基因工程理想的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶型型限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性1、识别序列和切割位点、识别序列和切割位点2、切割方式、切割方式3、同尾酶和同裂酶、同尾酶和同裂酶4、限制性片段、限制性片段长度：长度：经限制性核酸内切酶切割后产生的DNA片段。切割频率：切割频率：某限制酶在该DNA切割位点出现频率型型限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性1、识别序列、识别序列可识别长度为可识别长度为4-7bp的双的双链链DNA特定序列，该识特定序列，该识别序列（识别位点）常别序列（识别位点）常呈旋转对称性。呈旋转对称性。1、切割位点、切割位点切割位点与其识别序列切割位点与其识别序列一致，在其识别序列内一致，在其识别序列内切割切割DNA。型型限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性2、切切割割方方式式DNA的的限限制制性性酶酶切切型型限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性指来源不同、识别序指来源不同、识别序列不同但产生相同的列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切粘性末端的核酸内切酶。酶。同裂酶同裂酶指来源不同、指来源不同、而识别序列和切割方而识别序列和切割方式均相同的核酸内切式均相同的核酸内切酶。酶。3、同尾酶和同裂酶、同尾酶和同裂酶DNA连接酶连接酶能够将两端能够将两端DNADNA拼接起来的酶类拼接起来的酶类原核生物主要有两种类型的原核生物主要有两种类型的DNADNA连接酶：连接酶：E Ecoli DNAcoli DNA连接酶和连接酶和T T4 4 DNA DNA 连接酶。连接酶。 最常见的是最常见的是T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶能够催化能够催化DNADNA链上彼此相邻的链上彼此相邻的3 3- -羟基（羟基（ OH OH ）和）和5 5- -磷酸基团（磷酸基团（-P-P），），形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。DNA连接酶 DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段 DNA连接酶的作用是将双螺旋DNA分子的某一条链上两个相邻核苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封闭起来，即催化3-OH和5-p之间形成磷酸二酯键，从而将具黏性末端的双链DNA、平末端双链DNA以及带缺口的双链DNA连接起来。原核生物主要有两种类型的DNA连接酶 Ecoli DNA连接酶T4DNA 连接酶 催化反应能量来源 不同T4DNA连接酶用ATP，而EcoliDNA连接酶则用NAD 催化平末端连接的能力不同 只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的双螺旋的DNA片段 (一一)常用的常用的DNA聚合酶：聚合酶：大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的聚合酶的Klenow大片断酶大片断酶T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶TaqDNA聚合酶聚合酶催化催化DNA体外合成反应体外合成反应DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶I(DNasel)是一种是一种单链多肽蛋白质，具有三种不单链多肽蛋白质，具有三种不同的酶催活性，即同的酶催活性，即53的聚的聚合酶活性、合酶活性、53的核酸外切的核酸外切酶活性和酶活性和35的核酸外切酶的核酸外切酶活性。活性。 主要用途是通过主要用途是通过DNA缺口平缺口平移，制备供核酸分子杂交用移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的的带放射性标记的DNA探针探针(图图22) Klenow酶的主要用途 修补经限制性内切酶消化或其他方法所形成的5或3突出末端，制备平末端。 对具有3隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记。cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。DNA序列测定。T4DNA聚合酶这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯化而来，具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。主要用途可将任何形式的双链DNA制备成平末端的双链DNA。外切酶的活性比Klenow酶强200倍，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止 进行双链DNA的3末端标记。 T7DNA聚合酶具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性主要用途：用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应；如同DNA聚合酶一样，可通过单纯的延伸或取代合成的途径，标记DNA的3末端，也可用来将双链DNA的5或3突出端转变成平末端的结构。修饰的T7DNA聚合酶对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去35的核酸外切酶活性 修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单链模板上的聚合作用的速率增加了39倍 测序时常用此酶，故亦称测序酶 TaqDNA聚合酶 最适的活性温度是72，连续保温30min仍具有相当的活性 在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，按5 3的方向合成新生的互补链DNA。 (二二)分子克隆中常用的其他工具分子克隆中常用的其他工具酶酶甲基化酶甲基化酶末端转移酶末端转移酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶逆转录酶逆转录酶S1核酸酶核酸酶Bal31植酸酶植酸酶1.2基因工程的载体基因工程的载体载体的功能载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件Vector，本质是，本质是DNA携带外源基因进入到受体细胞的运载工具携带外源基因进入到受体细胞的运载工具基因克隆载体具备条件基因克隆载体具备条件在克隆载体合适的位置含有允许外源在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA片段组片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多。多。l克隆载体能携带外源克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细胞，或片段进入受体细胞，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA、线粒体、线粒体DNA和叶绿体和叶绿体DNA中，随这些中，随这些DNA同步复制。同步复制。具有能够直接观察的表型特征具有能够直接观察的表型特征基因克隆载体具备条件基因克隆载体具备条件克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。根据导入的受体生物。可以分为：大肠杆菌载体植物载体酵母载体动物载体基因克隆载体分类基因克隆载体分类大肠杆菌载体大肠杆菌载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体将外源DNA导入原核生物细胞1、质粒载体、质粒载体质粒（质粒（plasmid）是指细菌等生物细胞内一类独）是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质，一般为双链立于染色体外而能自我复制的遗传物质，一般为双链的共价闭合环状的共价闭合环状DNA。pBR322质粒载体：质粒载体：“P”表示是一种质粒；表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构表示两位主要构建者姓氏的头一个字母建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。表示实验编号。质粒载体的条件一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件。 1具有复制起点 2具有抗菌素抗性基因 3具有若干限制酶单一识别位点 4具有较小的分子量和较高的拷贝数pBR322pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点： 1 1、具有较小的分子量；、具有较小的分子量； 它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过克隆载体的分子量大小不要超过10kb10kb。 2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。记号。 pBR322 DNApBR322 DNA分子中总共有分子中总共有2424种核酸内切酶只种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中具有单一的酶切识别位点。其中7 7种内切酶的识别位点种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，在四环素抗性基因内部，2 2种识别位点在于这个基因的种识别位点在于这个基因的启动区内，所以启动区内，所以9 9个限制酶切位点插入外源片断可以导个限制酶切位点插入外源片断可以导致致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有3 3种限制酶在氨苄青霉素抗种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，性基因有单一的识别位点，3 3、具有较高的拷贝数、具有较高的拷贝数, ,经过氯霉素扩增后经过氯霉素扩增后, ,每个细胞中可积每个细胞中可积累累1000-30001000-3000拷贝。拷贝。质粒载体pUC系列的载体是通过pBR322和M13两种质粒改造而来，它的复制子来自pMBl，Amp抗性基因则是来自R质粒的转座子。与pBR322质粒载体相比，pUC系列的优点有如下三方面。 具有更小的分子量和更高的拷贝数。 适用于组织化学方法检测重组体。 具有多克隆位点MCS区段 MCS可以使两种不同黏性末端的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。a互补载体的来自Ecoli的Lac操纵子的DNA区段，编码半乳糖苷酶氨基端的一个片段。异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型半乳糖苷酶实现基因内互补(a互补)。当培养基中含有IPTG时，细胞可同时合成这二个功能上互补的片段，使含有此种质粒上述受体菌在含有生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(Xgal)的培养基上形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒上的多克隆位点时，可使半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。 噬菌体是一类细噬菌体是一类细菌病毒的总称。菌病毒的总称。2、噬菌体载体、噬菌体载体噬菌体颗粒的外噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内壳是蛋白质，内部是核酸。部是核酸。2、噬菌体载体、噬菌体载体噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期。源周期。只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体。具有溶原周期的噬菌体称为温和噬菌具有溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体。体。2、噬菌体载体、噬菌体载体噬菌体噬菌体载体载体M13噬菌体载体噬菌体载体噬菌粒载体噬菌粒载体 2、噬菌体载体、噬菌体载体3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体也称黏粒载体，是指一类由人工构建的含也称黏粒载体，是指一类由人工构建的含有有DNA的的cos位点和质粒复制子的特殊类位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体型的质粒载体噬菌体基因组是一长度为48 502bp的线性双链DNA分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链，称为粘端(cohesive end，cos)。这是将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。 噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以以环状形式存在，并且能够自然成环。 噬菌体载体的类型1插入型载体 插入型的载体又分免疫功能失活和大肠杆菌半乳糖苷酶失活两种亚型。 前者凡有外源DNA插入的重组体都能形成清晰的噬菌斑 后者形成无色(浅蓝色)的噬菌斑 2置换型载体 在载体非必要区的两侧含有核酸限制性内切酶两个切点，两个切点间的片段被取代后不影响噬菌体生活力的载体。可插入长度约为20kb的外源DNA。在可取代的区段中带有lacZ基因的相应序列时，重组体亦可用半乳糖苷酶失活法进行筛选。柯斯质粒载体柯斯(cosmid)质粒是一类由人工构建的质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒、cos位点序列来自噬菌体，其克隆能力为3145kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。 柯斯质粒的特点大体上可归纳成如下4个方面。1具有噬菌体的特性 高效地转导 ，噬菌体DNA同样的方式环化起来 ，不能够通过溶原周期，无法形成子代噬菌体颗粒。 2具有质粒载体的特性 具有质粒复制子 ，具有抗菌素抗性基因 ,也有插入失活克隆位点。3具有高容量的克隆能力 柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右核酸分子探针的标记1.3基因工程中主要分子生物学方法基因工程中主要分子生物学方法核酸分子的杂交多聚酶链式反应核酸分子探针的标记核酸分子探针的标记探针是指在化学及生物学意义上能与特定探针是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。殊的方法所测定的分子。核酸分子探针是指能与互补核酸系列复性核酸分子探针是指能与互补核酸系列复性杂交的特定已知核苷酸片断。杂交的特定已知核苷酸片断。核酸分子探针的标记核酸分子探针的标记切刻平移法切刻平移法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物。聚核苷酸片断的混合物。随机引物法是近年发展起来的一种较理想随机引物法是近年发展起来的一种较理想的核酸探针的标记方法。的核酸探针的标记方法。随随机机引引物物的的探探针针标标记记探探针针的的末末端端标标记记是基因工程及分子生物学领域中最常用的是基因工程及分子生物学领域中最常用的基本技术之一基本技术之一是基于在适宜的温度及离子强度等条件下，是基于在适宜的温度及离子强度等条件下，具有一定同源性的两条核苷酸单链可按碱具有一定同源性的两条核苷酸单链可按碱基互补原则复性杂交形成双链的原理建立基互补原则复性杂交形成双链的原理建立的的杂交的两条单链分别是核酸探针和待测核杂交的两条单链分别是核酸探针和待测核酸酸核酸分子的杂交核酸分子的杂交核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类核酸原位杂交核酸原位杂交菌落原位杂交菌落原位杂交斑点狭缝杂交斑点狭缝杂交膜上吸印杂交膜上吸印杂交目前最常用的一种核酸分子杂交方法目前最常用的一种核酸分子杂交方法膜上吸印杂交膜上吸印杂交原理：将待测核酸序列片段通过原理：将待测核酸序列片段通过吸印技术吸印技术转转移结合到一定的固相支持物上，然后与存移结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相标记的核酸探针进行杂交并对其在于液相标记的核酸探针进行杂交并对其实行检测的方法。实行检测的方法。固相支持物：固相支持物：硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜尼龙膜尼龙膜分类：分类：涉及涉及DNA吸印的吸印的southern吸印杂交法吸印杂交法涉及涉及RNA吸印的吸印的northern吸印杂交法吸印杂交法吸印方法：吸印方法：虹吸转移法虹吸转移法电泳转移法电泳转移法真空转移法真空转移法膜上吸印杂交膜上吸印杂交概念概念southern吸印杂交法吸印杂交法通过虹吸转移法、电通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移泳转移法、真空转移法等转移方法将经电法等转移方法将经电泳分离及变性的泳分离及变性的DNA片段转移到一定固相片段转移到一定固相支持物上然后进行杂支持物上然后进行杂交并对其实行检测的交并对其实行检测的方法方法northern吸印杂交法吸印杂交法通过虹吸转移法、电通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移泳转移法、真空转移法等转移方法将经电法等转移方法将经电泳分离及变性的泳分离及变性的RNA片段转移到一定固相片段转移到一定固相支持物上然后进行杂支持物上然后进行杂交并对其实行检测的交并对其实行检测的方法方法Southern杂杂交交PCR技术是指在模板技术是指在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合聚合酶催化合成反应，体外扩增特异酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段片段的技术。的技术。多聚酶链式反应多聚酶链式反应PCR每个循环需要三步：每个循环需要三步：变性变性退火退火延伸延伸反应条件反应条件多聚酶链式反应多聚酶链式反应94变性变性30s55复性复性30s70-72延伸延伸30-60s一共进行一共进行30轮左右的循环轮左右的循环引物 (primer) 是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。 PCRPCR扩增方式扩增方式扩增方式扩增方式第二节第二节基因工程研究基因工程研究目的基因的分离与制目的基因的分离与制备备目的基因与载体的重目的基因与载体的重组组将重组体导入受体细将重组体导入受体细胞胞重组转化体的筛选和重组转化体的筛选和鉴定鉴定克隆基因的表达克隆基因的表达目的基因（目的基因（Objective gene）是指准备导是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。需要的外源基因称目的基因。2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备l l外源基因外源基因（Foreign gene）：插入到载体）：插入到载体内的非自身的内的非自身的DNA片段片段基因化学合成法基因化学合成法2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备基因生物制备法基因生物制备法DNA自动合成仪自动合成仪cDNA文库法文库法PCR法法基因组文库法基因组文库法基因分离的物理化学方法基因分离的物理化学方法鸟枪法鸟枪法(shotgun)cDNA文库的建立与基因的分离文库的建立与基因的分离直接从特定的直接从特定的mRNA分离基因分离基因基因组文库的建立和基因的分离基因组文库的建立和基因的分离从蛋白质人手分离编码此蛋白的基因从蛋白质人手分离编码此蛋白的基因基因化学合成法基因化学合成法利用利用PCR法或法或RT-PCR分离基因分离基因基因分离的物理化学方法基因分离的物理化学方法根据DNA分子的两条链存在着GC、A=T(分别代表GC间的三个氢键、 AT间二个氢键)碱基配对。如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，即其熔解温度(Tm)值就高。这样，人们可以通过控制熔解使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。当利用单链核酸酶s1酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段。海胆rDNA基因的分离就是一例。 2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备鸟枪法(shot gun)这一方法又叫霰弹法。这一方法是绕过特定基因分离这一关口，用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段(o81069106道尔顿)。然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌(如Ecoli)中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。 2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备直接从基因组中分离目的基因的方法直接从基因组中分离目的基因的方法2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备基因组文库法基因组文库法以适当的目的基因片段作探针，利用高密度以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。段。cDNAcDNA：具有与某：具有与某RNARNA链呈互补的碱基序列的链呈互补的碱基序列的单链单链DNADNA即即complementarycomplementary DNA DNA之缩写，或之缩写，或此此DNADNA链与具有与之互补的碱基序列的链与具有与之互补的碱基序列的DNADNA链所形成的链所形成的DNADNA双链。双链。 2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备cDNA文库法文库法以适当的目的基因片段作探针，利用高密度以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的的噬菌斑或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。段。2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备cDNA文库法文库法cDNA文库的建立方法 1分离表达目的基因的组织或细胞2从组织和细胞中制备总体RNA和mRNA3第一条cDNA链的合成4第二条cDNA链的合成(i)自身引导法(图1-15) (ii)cDNA第二条链的置换合成法(图1-41)。 (iii)引物一衔接头法合成双链cDNA (图1-42) 。 5cDNA的甲基化和接头的加入6双链cDNA与载体的连接第一条互补第一条互补DNADNA链的链的合成需要合成需要RNARNA模板、模板、cDNAcDNA合成引物、反合成引物、反转录酶、转录酶、4 4种脱氧核种脱氧核苷三磷酸以及相应的苷三磷酸以及相应的缓冲液缓冲液(Mg2+)(Mg2+)等。等。作为第一条链合成作为第一条链合成反应产物的反应产物的cDNA：mRNA杂交分子杂交分子充当切口平移的模充当切口平移的模板。板。 基因的化学合成基因的化学合成 1基因片段的全化学合成：基因片段的全化学合成：所谓基因片段的全化学合成所谓基因片段的全化学合成是首先合成组成一个基因的是首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有所有片段，相邻的片段间有46个碱基的重叠互补，在个碱基的重叠互补，在适当的条件下适当的条件下(主要是温度条主要是温度条件件)经退火后，用经退火后，用T4 DNA连连接酶将各片段以磷酸二酯键接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完的共价键形式连接成一个完整的基因。整的基因。 基因的化学合成2基因的化学一酶促合成：此方法的特点是不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的3末端有一短的顺序相互补，在适当的条件下通过退火形成模板引物的复合体(template-primer complex)，然后在存在四种dNTP的条件下，用Ecoli的DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入载体(图1-45)。通过通过PCR技术获取所需要的特异技术获取所需要的特异DNA片段片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。引物。2.1目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备PCR法法PCR扩增法扩增法2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组黏性末黏性末端连接端连接平段连平段连接接1、由同一种限制性核酸内切酶切割的不同、由同一种限制性核酸内切酶切割的不同DNA 片段具有完全相同的末端；片段具有完全相同的末端；2、由两种不同的限制性核酸内切酶切割的、由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段具有相同类型的黏性末端；片段具有相同类型的黏性末端；2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组黏性末端连接黏性末端连接2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组如果目的基因的如果目的基因的DNA片段是用限制性内切片段是用限制性内切酶切割并有酶切割并有黏性末端黏性末端，则用同一种限制性，则用同一种限制性内切酶处理载体内切酶处理载体DNA，使其成为黏性末端。，使其成为黏性末端。切下的目的基因的片段插入到质粒的切口切下的目的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的处，再加入适量的DNA连接酶，质粒的黏连接酶，质粒的黏性末端与目的基因性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。分子。2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接连接平末端连接平末端DNA分子的方法有分子的方法有4种：种： （1）直接用）直接用T4DNA连接酶连接；连接酶连接； （2）先用）先用末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶，给平末端，给平末端DNA分子分子加上同聚物尾巴之后再用加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；连接酶进行连接； （3）用衔接物连接平末端）用衔接物连接平末端DNA分子；分子； （4）DNA接头连接法。接头连接法。 （1）直接用）直接用T4DNA连接酶连接连接酶连接2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接（1）T4DNA连接酶除了能够封闭具有连接酶除了能够封闭具有3，一一OH和和5一一P末端的双链末端的双链DNA的缺口之外，在的缺口之外，在存在存在ATP和加入高浓度酶（和加入高浓度酶（10-100倍）倍）和低和低浓度的聚乙二醇浓度的聚乙二醇PEG8000存在的条件下，它存在的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高，基因操作不经常采但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。用。且外源且外源DNA不能原位删除下来。不能原位删除下来。2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接（2）同聚物加尾连接平末端）同聚物加尾连接平末端DNA片段片段运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸(通通过脱氧核苷三磷酸前体过脱氧核苷三磷酸前体)，加到，加到DNA分子单链分子单链延伸末端的延伸末端的3，一一OH基团上，它并不需要模板基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。个核苷酸。优点在于：不易自身环化，这是因为同一种DNA分子两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。用任何一种方法制备的DNA片段都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法的不足之处：方法烦琐；外源片段难以回收。另外由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。还要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会重新产生某种核酸限制性内切酶的切点。(3)用衔接物连接平末端用衔接物连接平末端DNA分子分子 如果重组体如果重组体DNA是用是用T4DNA连接酶的平末端连接或连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决片段。为了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。分子的连接。所谓衔接物所谓衔接物(linker)，是指用化学方法合成的一段由，是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。点的寡核苷酸片段。2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接衔接物的5，末端和待克隆的DNA片段5，末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来 2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接（4）DNA接头连接法接头连接法DNA衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。造成麻烦。当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头接头(adapter)连接法。连接法。2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接DNA接头接头(adapter)连接法于连接法于1978年由康乃年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源段。当它的平末端与平末端的外源DNA片片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的的新的DNA分子，而易于连接重组。分子，而易于连接重组。2.2目的基因与载体的重组目的基因与载体的重组平末端连接平末端连接2.3将重组体导入受体细胞将重组体导入受体细胞导入方法导入方法1CaCl2处理后的细菌转化或转染。2高压电穿孔法。 3聚乙二醇介导的原生质体转化法。 4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。 5原生质体融合。 6脂质体法。 7细胞核的显微注射法。 1CaCl2处理后的细菌转化或转染。这是将重组的质粒或噬菌体DNA导入细菌中所用的常规方法，前者叫转化(transformation)后者叫转染(transfection)。作为受体细胞的细菌经一定浓度的冰冷CaCl2(50-100mmolL)溶液处理后变成所谓感受态细胞(Competent cells)处在感受态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。 导入方法导入方法注意以下几点：(a)用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在OD 600为04左右为好。(b)制备受体细胞的整个过程要在4进行，并尽量避免污染。如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。(c)为了提高转化率，可选用复合CaCl2溶液如“分子克隆”一书所介绍的FSB溶液。导入方法导入方法2高压电穿孔法。通过调节外加电场的强度、电脉冲的长度和用于转化的DNA浓度可将外源DNA导入细菌或真核细胞。用电穿孔法实现基因导入比CaCl2法方便，对细菌而言其转化效率可达1091010转化体微克DNA，但必须有专门仪器 导入方法导入方法3聚乙二醇介导的原生质体转化法。这种方法常用于转化酵母细胞以及其它真菌细胞。活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶(如driselase)处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000(PEG一6000)的介导下将外源DNA转化入受体细胞中。导入方法导入方法4磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。用磷酸钙和DNA共沉淀方法时是将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。 导入方法导入方法5原生质体融合。通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。6脂质体法。将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。7细胞核的显微注射法。即将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中。导入方法导入方法2.4重组转化体的筛选和鉴定重组转化体的筛选和鉴定筛选和鉴定筛选和鉴定遗传检测遗传检测目的基因转录产物检测目的基因转录产物检测目的基因翻译产物检测目的基因翻译产物检测物理检测法物理检测法核酸分析法核酸分析法一一、遗传检测遗传检测根据载体表型特征的筛选根据载体表型特征的筛选根据插入基因遗传性状的筛选根据插入基因遗传性状的筛选抗药性标记抗药性标记半乳糖苷酶半乳糖苷酶 显色反应显色反应二、核酸分析法二、核酸分析法(一一)PCR法法(二二)核酸杂交法核酸杂交法(三三)DNA测序法测序法菌落印迹原位杂交菌落印迹原位杂交斑点印迹杂交斑点印迹杂交Southern印迹杂交印迹杂交(一)PCR法根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。而采用DNA分子杂交的方法，只能在被杂交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就会出现杂交信号。1菌落印迹原位杂交将被筛选的菌落或噬菌斑，从其生长的琼脂平板中通过影印方法，小心地原位转移到放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，并保存好原来的菌落或噬菌斑平板作为参照。将影印的硝酸纤维素滤膜，用碱液处理，促使细菌细胞壁原位裂解、释放出DNA并随之原位变性。然后80下烘烤滤膜，使变性DNA原位同硝酸纤维素滤膜形成不可逆的结合。将这块固定有DNA印迹的滤膜干燥后，同放射性标记的特异性DNA或RNA探针杂交，漂洗除去多余的探针，最后经放射自显影检测杂交的结果。含有同探针序列同源的DNA的印迹，在x光底片上呈现黑色的斑点，将胶片同原先保存的参照平板进行对照，即可确定阳性菌落或噬菌斑的位置，从而获得含有目的基因插入片段的重组础工业体克隆。(二)核酸杂交法2斑点印迹杂交斑点印迹杂交法与菌落印迹原位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA(RNA)样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支持物上，然后同核酸探针进行分子杂交。通过放射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。此方法常用于病毒核酸的定量检测。(二)核酸杂交法3Southern印迹杂交 它首先将初筛的重组DNA提取出来，用合适的核酸限制性内切酶将DNA切割，并进行凝胶电泳分离，然后经碱变性，利用干燥的吸水纸产生的毛细作用，让液体流经凝胶，使DNA片段由液流携带，从凝胶转移并结合在硝酸纤维素滤膜的表面，最后将此膜同标记的核酸探针进行分子杂交。如果被检测DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检测DNA的条带部位结合成双链的杂交分子，并通过放射自显影显示出黑色条带来。 (二)核酸杂交法(三)DNA测序法进行目的基因的核苷酸测序。如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用RFLP(限制性片段长度多态性)技术。 用限制性内切酶对待克隆的目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化。经多种限制性内切酶切割分析，若两种结果都一样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列没有变化。三、物理检测法三、物理检测法( (一一) )凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法( (二二)R)R环检测法环检测法(一一)凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法:利用凝胶电泳检测重组质粒利用凝胶电泳检测重组质粒利用凝胶电泳检测重组质粒利用凝胶电泳检测重组质粒DNADNA分子的大小，也可以初步证明外源目的基因片段分子的大小，也可以初步证明外源目的基因片段分子的大小，也可以初步证明外源目的基因片段分子的大小，也可以初步证明外源目的基因片段是否已插入载体。是否已插入载体。是否已插入载体。是否已插入载体。 ( (二二二二)R)R环检测法环检测法: :采用采用mRNAmRNA作探针，利用电子显微镜观察其核酸作探针，利用电子显微镜观察其核酸杂交结果。在临近双链杂交结果。在临近双链DNADNA的变性温度下和高浓度的变性温度下和高浓度(70(70) )的甲酰的甲酰胺溶液中，双链的胺溶液中，双链的DNARNADNARNA分子要比双链的分子要比双链的DNADNADNADNA分子分子更为稳定。因此，当更为稳定。因此，当RNARNA探针及待测探针及待测DNADNA的混合物置于这种退的混合物置于这种退火条件下，火条件下，RNARNA便会同它的购便会同它的购DNADNA分子中的互补序列退火形成分子中的互补序列退火形成稳定的稳定的DNARNADNARNA杂交分子，而使被取代的杂交分子，而使被取代的DNADNA链处于单链状链处于单链状态。这种由单链态。这种由单链DNADNA分支和双链分支和双链DNA-RNADNA-RNA分支形成的分支形成的“ “泡状泡状” ”体，叫做体，叫做R R环结构。环结构。 四、目的基因转录产物检测用RNA印迹(Northern blotting)法检测。根据转录的RNA在一定条件下可以同转录该种RNA的模板DNA链进行杂交的特性，制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。五、目的基因翻译产物检测最常用的是蛋白质印迹(Western-blotting)法。提取克隆子总蛋白质，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性抗体结合，通过一系列抗原抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目的基因表达产物。一、基一、基础础理理论论研究：研究：基因的基因的结结构与功能。构与功能。基因的人工定点突基因的人工定点突变变。人人类类基因基因组计组计划划2.5基因工程的应用基因工程是一项非常复杂的技术操作，它的环节之繁多、操作之细致是其他工程所无法比拟的。但是如果抛开细节问题，基因工程操作流程还是比较明了的。它的基本步骤可以大致归纳如下：小结（1）获取目的基因，即用各种不同的方法取得人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。（2）获取基因载体。用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。(3)重组DNA，即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。从这里就可以看出工具酶的重要性，没有它们，重组工作就寸步难行。（4）把重组DNA导入受体细胞进行扩增，即用人工方法，让携带着目的基因的运载体进入新的生物细胞里，让其增殖，由此形成重组DNA的无性生殖系（即克隆）。（5）筛选与培育，即基因表达产物的鉴定、收集和加工等一系列复杂过程的综合。前几步工作是“播种”，这一步工作则是“收获”。“收获”工作比较复杂，这里不再介绍。作作业业基因工程的定义、研究内容基因工程的定义、研究内容基因工程研究的理论依据是什么？基因工程研究的理论依据是什么？基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？基因工程的载体有哪些？载体的功能有哪些？基因工程的载体有哪些？载体的功能有哪些？Southern杂交、杂交、Northern杂交的概念是什么？杂交的概念是什么？PCR技术的概念、原理及步骤技术的概念、原理及步骤目的基因的制备方法有哪些？目的基因的制备方法有哪些？目的基因与载体重组过程中平末端连接方式有哪目的基因与载体重组过程中平末端连接方式有哪几种？几种？第三章 蛋白质工程ProteinEngineering3-1蛋白结构基础和蛋白质工程的原理蛋白结构基础和蛋白质工程的原理蛋白质结构的基本构件蛋白质结构的基本构件 在自然界中，构在自然界中，构成生命最基本的物成生命最基本的物质有蛋白质、核酸、质有蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物多糖和脂类等生物大分子，其中蛋白大分子，其中蛋白质最为重要，核酸质最为重要，核酸则最为根本。则最为根本。各各种种生生物物功功能能、生生命命现现象象和和生生理理活活动动往往往往是是通通过过蛋蛋白白质质来来实实现现的的，蛋蛋白白质质不不仅仅是是生生物物体体的的重重要要组组分分，更更重重要要的的是是它与生命活动有着十分密切的关系。它与生命活动有着十分密切的关系。 在体内，蛋白质执行着酶催化作用，在体内，蛋白质执行着酶催化作用，使新陈代谢能有序地进行，从而表现出使新陈代谢能有序地进行，从而表现出各种生命的现象；通过激素的调节代谢各种生命的现象；通过激素的调节代谢作用，以确保动物正常的生理活动；产作用，以确保动物正常的生理活动；产生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；构建成的各种生物膜，形成生物体内物构建成的各种生物膜，形成生物体内物质和信息交流的通路和能量转换的场所。质和信息交流的通路和能量转换的场所。蛋白质的生理功能蛋白质是一切生命活动的体现者：蛋白质是一切生命活动的体现者：蛋白质是一切生命活动的体现者：蛋白质是一切生命活动的体现者：构成细胞和生物体的主要成分构成细胞和生物体的主要成分构成细胞和生物体的主要成分构成细胞和生物体的主要成分 调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素）调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素）调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素）调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素） 运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧）运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧）运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧）运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧） 免疫作用：如抗体免疫作用：如抗体免疫作用：如抗体免疫作用：如抗体 运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白 凝血：如纤维蛋白凝血：如纤维蛋白凝血：如纤维蛋白凝血：如纤维蛋白蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：碳：碳：碳：碳：50505555；氢：；氢：；氢：；氢：6.07.06.07.0；氧：氧：氧：氧：20232023；氮：；氮：；氮：；氮：15171517；硫：硫：硫：硫：0.3-2.50.3-2.5 分子量：分子量：分子量：分子量：1010，00010001，000000，000000道尔顿道尔顿道尔顿道尔顿化学组成化学组成 生生生生产产产产上上上上常常常常把把把把蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质不不不不完完完完全全全全水水水水解解解解的的的的产产产产物物物物按按按按分分分分子子子子大大大大小小小小分分分分别别别别称称称称为为为为shishi、胨胨胨胨、肽肽肽肽。 shishi和和和和胨胨胨胨仅仅仅仅用用用用于于于于表示分子量较大但不确定的多肽混合物。表示分子量较大但不确定的多肽混合物。表示分子量较大但不确定的多肽混合物。表示分子量较大但不确定的多肽混合物。 短短短短肽肽肽肽可可可可以以以以进进进进一一一一步步步步水水水水解解解解成成成成氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸，并并并并成成成成为为为为蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水解解解解的的的的最最最最小小小小单单单单位位位位，是是是是组组组组成成成成蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的基基基基本本本本单单单单位位位位。从从从从蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水解解解解物物物物中中中中分分分分离离离离出出出出来来来来的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸有有有有2020种种种种，除除除除了了了了脯脯脯脯基基基基酸酸酸酸外外外外，所所所所有有有有的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸均均均均可可可可用下式表示：用下式表示：用下式表示：用下式表示： R（NH2CHCOOH） 一个氨基酸的氨基与另一个氨基一个氨基酸的氨基与另一个氨基一个氨基酸的氨基与另一个氨基一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合失去一分子水，形成酸的羧基缩合失去一分子水，形成酸的羧基缩合失去一分子水，形成酸的羧基缩合失去一分子水，形成酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰胺键又称为肽键，一般由三个或三胺键又称为肽键，一般由三个或三胺键又称为肽键，一般由三个或三胺键又称为肽键，一般由三个或三个以上的氨基酸残基组成的肽称为个以上的氨基酸残基组成的肽称为个以上的氨基酸残基组成的肽称为个以上的氨基酸残基组成的肽称为多肽。多肽。多肽。多肽。 蛋白质的分子结构可划分蛋白质的分子结构可划分蛋白质的分子结构可划分蛋白质的分子结构可划分为一级结构、二级结构、三级为一级结构、二级结构、三级为一级结构、二级结构、三级为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，这种结构由结构和四级结构，这种结构由结构和四级结构，这种结构由结构和四级结构，这种结构由各种化学键组成。蛋白质的分各种化学键组成。蛋白质的分各种化学键组成。蛋白质的分各种化学键组成。蛋白质的分子构象又称为空间结构、高级子构象又称为空间结构、高级子构象又称为空间结构、高级子构象又称为空间结构、高级结构、立体结构、三维结构等结构、立体结构、三维结构等结构、立体结构、三维结构等结构、立体结构、三维结构等等，是指蛋白质分子中所有原等，是指蛋白质分子中所有原等，是指蛋白质分子中所有原等，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的摆布情况规律。子在三维空间的摆布情况规律。子在三维空间的摆布情况规律。子在三维空间的摆布情况规律。 蛋白质是由许多氨基酸按一定的蛋白质是由许多氨基酸按一定的蛋白质是由许多氨基酸按一定的蛋白质是由许多氨基酸按一定的排列顺序通过肽键相连而成的排列顺序通过肽键相连而成的排列顺序通过肽键相连而成的排列顺序通过肽键相连而成的多多多多肽链肽链肽链肽链。蛋白质的肽链结构成为蛋。蛋白质的肽链结构成为蛋。蛋白质的肽链结构成为蛋。蛋白质的肽链结构成为蛋白质的化学结构，它包括氨基酸白质的化学结构，它包括氨基酸白质的化学结构，它包括氨基酸白质的化学结构，它包括氨基酸组成、肽链数目、末端组成、氨组成、肽链数目、末端组成、氨组成、肽链数目、末端组成、氨组成、肽链数目、末端组成、氨基酸排列顺序和二硫键位置等。基酸排列顺序和二硫键位置等。基酸排列顺序和二硫键位置等。基酸排列顺序和二硫键位置等。蛋白质的一级结构就是由许蛋白质的一级结构就是由许多氨基酸序列按照一定的排多氨基酸序列按照一定的排列顺序，通过肽键相连接而列顺序，通过肽键相连接而成的多肽链结构，每一种蛋成的多肽链结构，每一种蛋白质的肽链的氨基酸都有一白质的肽链的氨基酸都有一定的排列顺序。蛋白质的一定的排列顺序。蛋白质的一级结构是最基本的，它包含级结构是最基本的，它包含着决定蛋白质的高级结构的着决定蛋白质的高级结构的关键性因素。关键性因素。蛋白质的二级结构是蛋白质的二级结构是蛋白质的二级结构是蛋白质的二级结构是指多肽链主链骨架中指多肽链主链骨架中指多肽链主链骨架中指多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿的若干肽段，各自沿的若干肽段，各自沿的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，着某个轴盘旋或折叠，着某个轴盘旋或折叠，着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而并以氢键维系，从而并以氢键维系，从而并以氢键维系，从而形成有规则的构象。形成有规则的构象。形成有规则的构象。形成有规则的构象。如如如如- -螺旋、螺旋、螺旋、螺旋、- -折叠折叠折叠折叠和和和和- -转角等。转角等。转角等。转角等。- -螺螺螺螺旋和旋和旋和旋和- -折叠是蛋白质折叠是蛋白质折叠是蛋白质折叠是蛋白质构象的重要单元。二构象的重要单元。二构象的重要单元。二构象的重要单元。二级结构不涉及氨基酸级结构不涉及氨基酸级结构不涉及氨基酸级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。残基的侧链构象。残基的侧链构象。残基的侧链构象。 - -螺旋的螺旋的螺旋的螺旋的螺距螺距螺距螺距（pitchpitch）5. 5.4A4A，螺旋每螺旋每螺旋每螺旋每绕一圈绕一圈绕一圈绕一圈（360360）为）为）为）为3.83.8个氨基酸个氨基酸个氨基酸个氨基酸残基，每个残基，每个残基，每个残基，每个重复单位沿重复单位沿重复单位沿重复单位沿螺旋轴上升螺旋轴上升螺旋轴上升螺旋轴上升1.5A1.5A。 - -折叠是一种肽链折叠是一种肽链折叠是一种肽链折叠是一种肽链相对伸展的结构。相对伸展的结构。相对伸展的结构。相对伸展的结构。在这种结构模型中，在这种结构模型中，在这种结构模型中，在这种结构模型中，肽链按层排列，在肽链按层排列，在肽链按层排列，在肽链按层排列，在相邻的肽链之间形相邻的肽链之间形相邻的肽链之间形相邻的肽链之间形成氢键，得以巩固成氢键，得以巩固成氢键，得以巩固成氢键，得以巩固这种结构。在天然这种结构。在天然这种结构。在天然这种结构。在天然蛋白质变性时，往蛋白质变性时，往蛋白质变性时，往蛋白质变性时，往往就包含往就包含往就包含往就包含- -螺旋向螺旋向螺旋向螺旋向- -折叠的转变。折叠的转变。折叠的转变。折叠的转变。 在自然界中，多数蛋白质的空间结构呈球状。在自然界中，多数蛋白质的空间结构呈球状。环球蛋白是在三维空间中沿着多方向进行卷曲、环球蛋白是在三维空间中沿着多方向进行卷曲、折叠、盘绕而成的近似球形结构。这种在二级折叠、盘绕而成的近似球形结构。这种在二级结构基础上的肽链再折叠，称为蛋白质的三级结构基础上的肽链再折叠，称为蛋白质的三级结构。结构。 维维维维持持持持蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质构构构构象象象象的的的的作作作作用用用用力力力力有有有有四四四四种种种种共共共共价价价价键键键键类类类类型型型型：R R R R基基基基之之之之间间间间的的的的氢氢氢氢键键键键；非非非非极极极极性性性性R R R R基基基基之之之之间间间间的的的的疏疏疏疏水水水水基基基基相相相相互互互互作作作作用用用用（范范范范德德德德华华华华引引引引力力力力）；- -螺螺螺螺旋旋旋旋和和和和- -折折折折叠叠叠叠中中中中的的的的肽肽肽肽链链链链内内内内或或或或肽肽肽肽链链链链间间间间德德德德氢氢氢氢键键键键；带带带带正正正正负负负负电电电电荷荷荷荷的的的的R R R R基基基基之之之之间间间间的的的的离离离离子子子子键键键键。维维维维持持持持蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的三三三三级级级级结结结结构最重要的作用力是疏水键的相互作用。构最重要的作用力是疏水键的相互作用。构最重要的作用力是疏水键的相互作用。构最重要的作用力是疏水键的相互作用。从共价结构上看，亚基就从共价结构上看，亚基就从共价结构上看，亚基就从共价结构上看，亚基就是蛋白质分子的最小共价是蛋白质分子的最小共价是蛋白质分子的最小共价是蛋白质分子的最小共价单位。亚基一般是由一条单位。亚基一般是由一条单位。亚基一般是由一条单位。亚基一般是由一条多肽链组成的，但有的亚多肽链组成的，但有的亚多肽链组成的，但有的亚多肽链组成的，但有的亚基也可以由几条多肽链组基也可以由几条多肽链组基也可以由几条多肽链组基也可以由几条多肽链组成，这些多肽链通常以二成，这些多肽链通常以二成，这些多肽链通常以二成，这些多肽链通常以二硫键相连接称为亚基。由硫键相连接称为亚基。由硫键相连接称为亚基。由硫键相连接称为亚基。由亚基聚合而成的蛋白质分亚基聚合而成的蛋白质分亚基聚合而成的蛋白质分亚基聚合而成的蛋白质分子称为寡聚蛋白。由亚基子称为寡聚蛋白。由亚基子称为寡聚蛋白。由亚基子称为寡聚蛋白。由亚基组成的寡聚蛋白结构被称组成的寡聚蛋白结构被称组成的寡聚蛋白结构被称组成的寡聚蛋白结构被称为四级结构，侧重强调亚为四级结构，侧重强调亚为四级结构，侧重强调亚为四级结构，侧重强调亚基之间的相互作用和空间基之间的相互作用和空间基之间的相互作用和空间基之间的相互作用和空间排布情况。排布情况。排布情况。排布情况。 维持四级结构的主要力靠疏水键。四级结维持四级结构的主要力靠疏水键。四级结维持四级结构的主要力靠疏水键。四级结维持四级结构的主要力靠疏水键。四级结构中的聚合物，大致可分为不对称性的聚合物构中的聚合物，大致可分为不对称性的聚合物构中的聚合物，大致可分为不对称性的聚合物构中的聚合物，大致可分为不对称性的聚合物和对称性的聚合物。构成四级结构的原体可排和对称性的聚合物。构成四级结构的原体可排和对称性的聚合物。构成四级结构的原体可排和对称性的聚合物。构成四级结构的原体可排列成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多列成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多列成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多列成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，最多可聚合成六十聚体等。可聚合成六十聚体等。可聚合成六十聚体等。可聚合成六十聚体等。 蛋白质分子之间的相互作用蛋白质分子之间的相互作用 在在在在一一一一定定定定条条条条件件件件下下下下，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质亚亚亚亚基基基基的的的的聚聚聚聚合合合合可可可可以以以以被被被被解解解解离离离离成成成成游游游游离离离离的的的的亚亚亚亚基基基基，但但但但在在在在适适适适当当当当的的的的条条条条件件件件下下下下，这这这这些些些些游游游游离离离离的的的的亚亚亚亚基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。 在在在在特特特特殊殊殊殊环环环环境境境境条条条条件件件件下下下下，某某某某些些些些具具具具有有有有四四四四级级级级结结结结构构构构的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子之之之之间间间间，一一一一种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的亚亚亚亚基基基基可可可可以以以以与与与与另另另另一一一一种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的亚亚亚亚基基基基聚聚聚聚合合合合，并并并并产产产产生生生生有有有有活活活活性性性性的的的的杂杂杂杂交交交交分分分分子子子子。这这这这一过程也是一种分子杂交。一过程也是一种分子杂交。一过程也是一种分子杂交。一过程也是一种分子杂交。 不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组成，都能聚合成聚合物。成，都能聚合成聚合物。成，都能聚合成聚合物。成，都能聚合成聚合物。 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子所所所所具具具具有有有有的的的的多多多多种种种种多多多多样样样样的的的的生生生生物物物物学学学学功功功功能能能能是是是是与与与与它它它它们们们们特特特特殊殊殊殊的的的的和和和和复复复复杂杂杂杂的的的的结结结结构构构构紧紧紧紧密密密密相相相相关关关关的的的的。一一一一般般般般来来来来说说说说，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构与与与与功功功功能能能能的的的的关关关关系系系系包包包包含含含含着着着着两两两两个个个个方面的问题：方面的问题：方面的问题：方面的问题： 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质必必必必须须须须具具具具备备备备特特特特定定定定的的的的结结结结构构构构，才才才才能能能能表表表表现现现现特特特特定定定定的的的的功功功功能能能能，在在在在蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质肽肽肽肽链链链链中中中中有有有有一一一一些些些些基基基基团团团团对对对对特特特特定定定定功功功功能能能能而而而而言言言言是是是是必必必必需需需需基基基基团团团团，另另另另一一一一些些些些是是是是非非非非必必必必需需需需基基基基团团团团；在在在在体体体体内内内内，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子是是是是如如如如何何何何利利利利用用用用它它它它的的的的特特特特定定定定结结结结构执行特定的生物功能的。构执行特定的生物功能的。构执行特定的生物功能的。构执行特定的生物功能的。 目前，在化学结构和空间结构目前，在化学结构和空间结构已经阐明的酶蛋白，其酶分子的已经阐明的酶蛋白，其酶分子的活性中心与底物结合时，整个酶活性中心与底物结合时，整个酶分子的立体构象有所扭动，这种分子的立体构象有所扭动，这种扭动引起的张力正是促使底物化扭动引起的张力正是促使底物化学键容易发生断裂的基本原因。学键容易发生断裂的基本原因。这种张力也是依靠酶分子中的许这种张力也是依靠酶分子中的许多非活性中心部位的协调作用而多非活性中心部位的协调作用而发生的。发生的。 2020世世世世纪纪纪纪6060年年年年代代代代初初初初，随随随随着着着着生生生生物物物物化化化化学学学学和和和和分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学的的的的发发发发展展展展和和和和延延延延伸伸伸伸，人人人人们对生物的遗传物质们对生物的遗传物质们对生物的遗传物质们对生物的遗传物质DNADNA结构与功能已经有了比较清楚的认识。结构与功能已经有了比较清楚的认识。结构与功能已经有了比较清楚的认识。结构与功能已经有了比较清楚的认识。 19721972年年年年，美美美美国国国国斯斯斯斯坦坦坦坦福福福福大大大大学学学学BergBerg成成成成功功功功实实实实现现现现了了了了DNADNA重重重重组组组组实实实实验验验验，从从从从此此此此揭揭揭揭开开开开了了了了基基基基因因因因工工工工程程程程发发发发展展展展的的的的序序序序幕幕幕幕，并并并并逐逐逐逐步步步步形形形形成成成成了了了了以以以以基基基基因因因因工工工工程程程程为为为为核核核核心心心心内内内内容容容容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。 2020世世世世纪纪纪纪8080年年年年代代代代初初初初，随随随随着着着着蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质晶晶晶晶体体体体学学学学和和和和结结结结构构构构生生生生物物物物学学学学的的的的发发发发展展展展，人人人人类类类类可可可可以以以以通通通通过过过过对对对对蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构与与与与功功功功能能能能的的的的了了了了解解解解，借借借借助助助助计计计计算算算算机机机机辅辅辅辅助助助助设设设设计计计计，利利利利用用用用基基基基因因因因定定定定位位位位诱诱诱诱变变变变等等等等高高高高新新新新技技技技术术术术改改改改造造造造基基基基因因因因，以以以以达达达达到到到到改改改改进进进进蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质某某某某些些些些性性性性质质质质的的的的目目目目的的的的。这这这这些些些些技技技技术术术术的的的的融融融融合合合合，促促促促使使使使了了了了蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质工工工工程程程程这这这这一一一一新新新新兴兴兴兴生生生生物物物物技技技技术术术术领领领领域域域域的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。蛋白质工程的概念和起源蛋白质工程的概念和起源蛋白质工程的概念和起源蛋白质工程的概念和起源1982年，年，Winter等首次报等首次报道了通过基因定位诱变获道了通过基因定位诱变获得改性的酪氨酸得改性的酪氨酸tRNA合成合成酶；酶；1983年，年，Ulmer在在科科学学杂志上发表了以杂志上发表了以“ProteinEngineering”（蛋白质工（蛋白质工程）为题的专论，这标志程）为题的专论，这标志着人们能按自己的意愿创着人们能按自己的意愿创造出适合人类需求的新基造出适合人类需求的新基因，并能表达出具有不同因，并能表达出具有不同功能的蛋白质。这是新一功能的蛋白质。这是新一代的基因工程，因而蛋白代的基因工程，因而蛋白质工程也称为第二代基因质工程也称为第二代基因工程。工程。 蛋白质工程的基本内容和目的可以概蛋白质工程的基本内容和目的可以概蛋白质工程的基本内容和目的可以概蛋白质工程的基本内容和目的可以概括为：以蛋白质结构与功能为基础，通过括为：以蛋白质结构与功能为基础，通过括为：以蛋白质结构与功能为基础，通过括为：以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计化学和物理手段，对目标基因按预期设计化学和物理手段，对目标基因按预期设计化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更优良，更符合人类需求的功能蛋白质。优良，更符合人类需求的功能蛋白质。优良，更符合人类需求的功能蛋白质。优良，更符合人类需求的功能蛋白质。 严格地说蛋白质工程就是以蛋白质结构和严格地说蛋白质工程就是以蛋白质结构和严格地说蛋白质工程就是以蛋白质结构和严格地说蛋白质工程就是以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借功能的研究为基础，运用遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变和合成助计算机信息处理技术的支持，从改变和合成助计算机信息处理技术的支持，从改变和合成助计算机信息处理技术的支持，从改变和合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。术。术。术。 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质工工工工程程程程技技技技术术术术对对对对天天天天然然然然蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质进进进进行行行行改改改改造造造造改改改改良良良良或或或或全全全全新新新新设设设设计计计计模模模模拟拟拟拟，使使使使目目目目的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质具具具具有有有有特特特特殊殊殊殊的的的的结结结结构构构构和和和和性性性性质质质质，能能能能够够够够抵抵抵抵御御御御外外外外界界界界的的的的不不不不良良良良环环环环境境境境，因而蛋白质具有广阔的应用前景。因而蛋白质具有广阔的应用前景。因而蛋白质具有广阔的应用前景。因而蛋白质具有广阔的应用前景。 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质工工工工程程程程的的的的出出出出现现现现是是是是生生生生物物物物技技技技术术术术发发发发展展展展到到到到现现现现阶阶阶阶段段段段的的的的必必必必然然然然产产产产物物物物，同同同同时时时时也也也也是是是是社社社社会会会会生生生生产产产产实实实实践践践践和和和和生物科学研究的客观需要。生物科学研究的客观需要。生物科学研究的客观需要。生物科学研究的客观需要。 蛋白质工程是在现代生物学理论和技术蛋白质工程是在现代生物学理论和技术蛋白质工程是在现代生物学理论和技术蛋白质工程是在现代生物学理论和技术发展的基础上诞生的，同时也是借助于其他发展的基础上诞生的，同时也是借助于其他发展的基础上诞生的，同时也是借助于其他发展的基础上诞生的，同时也是借助于其他许多学科相互渗透、相互作用而发展的。主许多学科相互渗透、相互作用而发展的。主许多学科相互渗透、相互作用而发展的。主许多学科相互渗透、相互作用而发展的。主要包括以下两大方面：分子遗传学的相关理要包括以下两大方面：分子遗传学的相关理要包括以下两大方面：分子遗传学的相关理要包括以下两大方面：分子遗传学的相关理论与技术和蛋白质结构功能的相关的理论与论与技术和蛋白质结构功能的相关的理论与论与技术和蛋白质结构功能的相关的理论与论与技术和蛋白质结构功能的相关的理论与技术。技术。技术。技术。 以以以以蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构与与与与功功功功能能能能的的的的研研研研究究究究为为为为基基基基础础础础，掌掌掌掌握握握握蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质活活活活性性性性中中中中心心心心的的的的结结结结构构构构，了了了了解解解解构构构构成成成成中中中中心心心心的的的的各各各各氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基及及及及其其其其侧侧侧侧链链链链基基基基团团团团的的的的位位位位置置置置，再再再再借借借借助助助助计计计计算算算算机机机机图图图图像像像像与与与与处处处处理理理理系系系系统统统统的的的的模模模模拟拟拟拟进进进进行行行行分分分分子子子子设设设设计计计计，提提提提出出出出对对对对目目目目的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的改改改改建建建建或或或或构构构构建建建建方方方方案案案案，确确确确定定定定活活活活性性性性中中中中心心心心的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基组组组组成成成成，并并并并辅辅辅辅助助助助设设设设计计计计和和和和预预预预测测测测其其其其结结结结构构构构功功功功能能能能的的的的变变变变化化化化。同同同同时时时时计计计计算算算算机机机机辅辅辅辅助助助助处处处处理理理理系系系系统统统统可可可可以以以以通通通通过过过过生生生生物物物物物物物物理理理理学学学学原原原原理理理理，模模模模拟拟拟拟预预预预测测测测氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸序序序序列列列列的的的的变变变变化化化化对对对对蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质空空空空间间间间结结结结构构构构的的的的影影影影响响响响。按按按按照照照照目目目目的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的改改改改进进进进或或或或构构构构建建建建方方方方案案案案，进进进进行行行行编编编编码码码码该该该该蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质基基基基因因因因的的的的修修修修饰饰饰饰和和和和合合合合成成成成，再再再再通通通通过过过过遗遗遗遗传传传传工工工工程程程程途途途途径径径径，在在在在适适适适当当当当的的的的载载载载体体体体表表表表达达达达系系系系统统统统中中中中表表表表达达达达所所所所需需需需要要要要的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质。通通通通过过过过这这这这一一一一过过过过程程程程的的的的重重重重复复复复进进进进行行行行，最终符合目的蛋白质分子的结构、性质和功能设计的要求。最终符合目的蛋白质分子的结构、性质和功能设计的要求。最终符合目的蛋白质分子的结构、性质和功能设计的要求。最终符合目的蛋白质分子的结构、性质和功能设计的要求。 蛋白质工程的原理蛋白质工程的原理蛋白质工程操作中的问题蛋白质工程操作中的问题1、有关分子遗传学和基因工程的问题有关分子遗传学和基因工程的问题；如更有效cDNA克隆技术，精确高效的定位突变技术，高效目的基因表达系统等等。2、有关蛋白质结构功能研有关蛋白质结构功能研究的理论和技术；究的理论和技术；如准确地由一级机构推测高级机构、肽链折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、液体以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等等。3、有关一些相关有关一些相关技术技术：如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。 尽管蛋白质工程相关技术还很不成熟，但是这尽管蛋白质工程相关技术还很不成熟，但是这一生物技术已经取得了令人瞩目的成就，特别是一生物技术已经取得了令人瞩目的成就，特别是在酶制剂的性质改良方面，取得了突破性进展。在酶制剂的性质改良方面，取得了突破性进展。许多突变的工程酶，如枯草杆菌蛋白酶工程酶，许多突变的工程酶，如枯草杆菌蛋白酶工程酶，已获得了专利，并已广泛应用于食品、轻化工行已获得了专利，并已广泛应用于食品、轻化工行业了。业了。3-2蛋白质工程的工作定义蛋白质工程的工作定义建立蛋白质工程的研究方法系统建立蛋白质工程的研究方法系统随机诱变基因库的定向筛选随机诱变基因库的定向筛选研究蛋白质结构与功能的关系研究蛋白质结构与功能的关系严格意义上的蛋白质工程严格意义上的蛋白质工程2.1建立蛋白质工程的研究方法系统建立蛋白质工程的研究方法系统在研究某些蛋白质一级结构及其结构功能在研究某些蛋白质一级结构及其结构功能元件相互关系的基础上建立起应用蛋白质元件相互关系的基础上建立起应用蛋白质工程方法的系统。工程方法的系统。2.2随机诱变基因库的定向筛选随机诱变基因库的定向筛选利用目的基因表型具有高效检测筛选系统利用目的基因表型具有高效检测筛选系统这一特性，在目标条件下从随机诱变基因这一特性，在目标条件下从随机诱变基因库中分离出目标基因，最终获得突变蛋白库中分离出目标基因，最终获得突变蛋白质。质。2.3研究蛋白质结构与功能的关系研究蛋白质结构与功能的关系利用各种方法，包括蛋白质工程的方法，利用各种方法，包括蛋白质工程的方法，研究和阐明蛋白质分子结构与功能关系，研究和阐明蛋白质分子结构与功能关系，并且尽可能达到定量描述的水平。并且尽可能达到定量描述的水平。2.4严格意义上的蛋白质工程严格意义上的蛋白质工程在深入了解某一个蛋白质结构与功能关系在深入了解某一个蛋白质结构与功能关系的基础上，经过有目标的、严格的分子设的基础上，经过有目标的、严格的分子设计，定向地改造或构建一个具有特定性质计，定向地改造或构建一个具有特定性质和功能的目的蛋白质。和功能的目的蛋白质。一是对天然蛋白质的改造，包括小改、中一是对天然蛋白质的改造，包括小改、中改以及大改；改以及大改；二是完全重新构建一个自然界中没有的全二是完全重新构建一个自然界中没有的全新的蛋白质新的蛋白质2.4严格意义上的蛋白质工程严格意义上的蛋白质工程蛋白质的分子设计可以按改造部位的多寡分为三类第一类为“小改”第二类为“中改” 第三类为“大改”3-3蛋白质工程的研究方法蛋白质工程的研究方法结构分析方法结构分析方法蛋白质的分离纯化鉴定方法蛋白质的分离纯化鉴定方法功能研究方法功能研究方法进行结构改造的分子生物学研究方法进行结构改造的分子生物学研究方法3.1蛋白质结构分析方法蛋白质结构分析方法与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术术1、蛋白质一级结构分析方法、蛋白质一级结构分析方法2、蛋白质构象研究方法、蛋白质构象研究方法3、蛋白质折叠过程研究方法、蛋白质折叠过程研究方法4、蛋白质生物物理研究方法及计算机结构、蛋白质生物物理研究方法及计算机结构模拟研究模拟研究蛋白质一级结构研究，既氨基酸序列的测定，其原理是片段重叠、逐级降解、cDNA以质谱法等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方法。蛋白质构象研究方法蛋白质构象研究方法在蛋白质高级结构研究方面，一种是单晶体衍射在蛋白质高级结构研究方面，一种是单晶体衍射法另一种是核磁共振（法另一种是核磁共振（NMR）法。）法。单晶体衍射法是研究蛋白质空间结构最主要的单晶体衍射法是研究蛋白质空间结构最主要的分析手段，分别用于对结晶蛋白质，单晶体衍射分析手段，分别用于对结晶蛋白质，单晶体衍射主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。核磁共振（核磁共振（NMR）法是对溶液中蛋白质空间构）法是对溶液中蛋白质空间构象的研究。核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白象的研究。核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能时的实际构象状态。时的实际构象状态。蛋白质折叠过程研究方法蛋白质折叠过程研究方法目前流行的蛋白质折叠过程理论是目前流行的蛋白质折叠过程理论是Amfinsen提出的随机成核理论：即线性多提出的随机成核理论：即线性多肽链折叠呈现肽链折叠呈现“成核成核-折卷折卷-凝集凝集”三个阶三个阶段。段。成核作用是由于挤压效应或疏水作用，多成核作用是由于挤压效应或疏水作用，多肽链中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核肽链中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核心区；心区；折卷则是已成核的结构散落成为较大的超折卷则是已成核的结构散落成为较大的超二级结构单元的集合体；二级结构单元的集合体；凝集则是集合体在原子水平凝集，形成致凝集则是集合体在原子水平凝集，形成致密的三级结构。密的三级结构。3.2分子生物学研究方法分子生物学研究方法1、寡居核苷酸片段及基因的人工合成、寡居核苷酸片段及基因的人工合成2、目的基因的克隆与分析、目的基因的克隆与分析3、目的基因的定位诱变、目的基因的定位诱变4、目的基因高效表达系统、目的基因高效表达系统 蛋白质工程主要研究手段是利用所谓的反蛋白质工程主要研究手段是利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或体内环境而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质空间结构和表达出生物学功能的可能测蛋白质空间结构和表达出生物学功能的可能及其高低程度。及其高低程度。3-4蛋白质工程的应用蛋白质工程的应用通通过过基基因因定定点点突突变变或或基基因因克克隆隆的的方方法法，人人们们就就可可以以对对自自然然界界存存在在的的酶酶或或蛋蛋白白质质进进行行改改造造，使使它它们们变变成成适适合合于于工工业化生产的新酶。业化生产的新酶。 一般来说提高蛋白一般来说提高蛋白的稳定性包括以下的稳定性包括以下几个方面：几个方面：延长延长酶的半衰期；酶的半衰期；提提高酶的热稳定性；高酶的热稳定性；延长药用蛋白质延长药用蛋白质的保存期；的保存期；抵御抵御由于重要氨基酸氧由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。化引起的活性丧失。1 1 1 1、消除酶的被抑制特性、消除酶的被抑制特性、消除酶的被抑制特性、消除酶的被抑制特性芽孢杆菌是工业上发酵生产蛋白质水解酶的主要生产酶，芽孢杆菌是工业上发酵生产蛋白质水解酶的主要生产酶，枯草芽孢杆菌的不同菌株产生的胞外碱性蛋白酶统称为枯草芽孢杆菌的不同菌株产生的胞外碱性蛋白酶统称为枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶。1985年，美国的埃斯特尔借助年，美国的埃斯特尔借助PCR技技术，用术，用19种其他氨基酸分别替换枯草芽孢杆菌蛋白酶分种其他氨基酸分别替换枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第子第222位残基上容易受氧化的蛋氨酸，获得了一系列活位残基上容易受氧化的蛋氨酸，获得了一系列活性差异很大的性差异很大的突变酶。突变酶。蜡蜡状状芽芽孢孢杆杆菌菌梭梭状状芽芽孢孢杆杆菌菌12 2、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性溶菌酶是一种广泛用于食品工业的酶制品，其催化溶菌酶是一种广泛用于食品工业的酶制品，其催化速率随温度升高而升高，因此，这种工业用酶的热速率随温度升高而升高，因此，这种工业用酶的热稳定性是提高其应用潜力的重要标准。稳定性是提高其应用潜力的重要标准。蛋白质晶体结构研究表明，蛋白质晶体结构研究表明，T4溶菌酶分子由一条肽溶菌酶分子由一条肽链构成，并在空间上折叠形成两个相对独立的单元，链构成，并在空间上折叠形成两个相对独立的单元，酶活性中心位于两个单元之间，该酶分子的一个重酶活性中心位于两个单元之间，该酶分子的一个重要特性是在第要特性是在第97位和第位和第54位残基上是两个未形成二位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫硫键的半胱氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫键的蛋白质分子。键的蛋白质分子。3 3、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性研究人员对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两研究人员对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有两个天门冬酰胺，它们都位于亚基之个相同的亚基，每个亚基含有两个天门冬酰胺，它们都位于亚基之间的界面上，对酶的热稳定性起决定性作用。通过间的界面上，对酶的热稳定性起决定性作用。通过PCR定向诱变技定向诱变技术，研究人员将第术，研究人员将第14位和第位和第78位上的两个天门冬酰胺分别转变成苏位上的两个天门冬酰胺分别转变成苏氨酸和异亮氨酸残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。氨酸和异亮氨酸残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。通过对蛋白质通过对蛋白质中非必需的天门冬酰胺进行突变，有利于提高蛋白质中非必需的天门冬酰胺进行突变，有利于提高蛋白质的热稳定性。的热稳定性。酵酵母母菌菌啤啤酒酒酵酵母母4 4、改变酶的最适、改变酶的最适、改变酶的最适、改变酶的最适pHpH值条件值条件值条件值条件改变工业用酶的最适改变工业用酶的最适pH值是蛋白质工程研究和实践中的值是蛋白质工程研究和实践中的另一个重要目标。改变食品级酶的最适另一个重要目标。改变食品级酶的最适pH值条件，使酶值条件，使酶适应食品加工环境，在工艺控制上非常重要。适应食品加工环境，在工艺控制上非常重要。葡萄糖异构酶（葡萄糖异构酶（GI）能将能将D葡萄糖、葡萄糖、D木糖和木糖和D核核糖等催化为相应的酮糖；在体外一定条件下，它也能催糖等催化为相应的酮糖；在体外一定条件下，它也能催化化D葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆的关键酶；它还用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，浆的关键酶；它还用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值得工业用酶。是一种具有重大经济价值得工业用酶。5 5、提高酶的催化特性、提高酶的催化特性、提高酶的催化特性、提高酶的催化特性研究人员对嗜热脂肪芽孢杆菌的（苏氨酸）研究人员对嗜热脂肪芽孢杆菌的（苏氨酸）Tyr-tRNA合合成酶进行定位突变后，改变了其与底物结合的特异性，成酶进行定位突变后，改变了其与底物结合的特异性，从而提高了催化效率。从而提高了催化效率。酪氨酰酪氨酰tPNAtPNA合成酶的氨酰化活性合成酶的氨酰化活性酶酶Kcat/sK Km m/mol/molK Kcatcat/K/Km m(s(s-1-1molmol- -1 1L)L)Thr-51Thr-514.74.72.5002.5001 8601 860Ala-51Ala-514.04.01.2001.2003 2003 200ProPro51511.81.80.0190.01995 80095 8006 6、修饰酶的催化特异性、修饰酶的催化特异性、修饰酶的催化特异性、修饰酶的催化特异性利用蛋白质工程技术可以改变新支链淀粉酶的催化特异性。借助定点突变技术，研究人员确定了嗜热脂肪芽孢杆菌产生的新支链淀粉酶的活性中心。当活性中心内的谷氨酸和天门冬氨酸残基分别被具有相反电荷或中性的氨基酸残基（组氨酸、谷氨酰胺或天门冬酰胺）取代时，将导致突变体酶裂解1，4糖苷键与1，6糖苷键的活性比例发生明显改变。7 7、修饰、修饰、修饰、修饰NisinNisin的生物防腐效应的生物防腐效应的生物防腐效应的生物防腐效应(Nisin)乳酸链球菌素，是一种乳酸链球菌在代乳酸链球菌素，是一种乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的有较强抑菌作用的小分子谢过程中合成和分泌的有较强抑菌作用的小分子肽，是目前研究最多，应用最广，由乳酸菌产生肽，是目前研究最多，应用最广，由乳酸菌产生的唯一能应用于商业化生产的细菌素。的唯一能应用于商业化生产的细菌素。链球菌链球菌思考题思考题蛋白质工程的定义、原理。蛋白质工程的定义、原理。蛋白质工程的组成部分。蛋白质工程的组成部分。蛋白质工程的主要研究方法。蛋白质工程的主要研究方法。定点突变技术。定点突变技术。第四章enzymeengineering4-1酶工程原理和方法酶工程原理和方法1、酶是由生物体产生的具有催化剂活、酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质性的蛋白质 。2、本身就是一段、本身就是一段RNA，不需要额外的，不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。蛋白酶就可以对自身进行剪切。 高效率比非催化高1081020倍比非酶催化高1071013倍 高度专一性 反应条件温和 酶催化是可调控的酶工程酶工程(enzymeengineering)即即利用酶的催化作用，在一利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业工业、轻工业和医药工业等领域。等领域。酶工程：酶工程：酶是基因工程、细胞工程、发酵工酶是基因工程、细胞工程、发酵工程和生化工程的研究对象和工具。程和生化工程的研究对象和工具。酶工程的研究可以促进基因工程、酶工程的研究可以促进基因工程、细胞工程、发酵工程和生化工程的发展。细胞工程、发酵工程和生化工程的发展。酶工程酶工程化学酶工程化学酶工程生物酶工程生物酶工程自然酶自然酶化学修饰酶化学修饰酶固定化酶固定化酶人工合成酶人工合成酶克隆酶克隆酶突变酶突变酶新酶新酶1.1酶的催化特性 (一)反应条件温和 (二)催化效率高(三)反应专一性强 (四)反应可调节控制一、产酶菌种的选育和保藏 （一）常用产酶微生物 (二)菌种的分离筛选 1优良菌种的特点 一个优良菌种应具备以下几个条件：繁殖快，产酶量高，生产周期短；适应性强，容易培养和控制，便于管理和降低生产成本；产酶性能稳定，不易退化，不易受噬菌体侵袭；产生的酶容易分离纯化；菌种本身和代谢产物安全无毒，对生产人员、生产环境，酶的应用不会产生不良影响。2菌种的分离 (1)含菌样品的收集 (2)富集培养 (3)菌种的纯化 3.菌种的筛选(三)产酶微生物育种 1诱变育种 2原生质体融合育种 3基因工程育种 (四)菌种的保藏 1斜面冰箱保藏法 2沙土管保藏法 3石蜡油封保藏法 4真空干燥冷冻保藏 液氮超低温保藏法 1.2酶工程的应用范围酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。用价值才真正得以体现。1.3酶和酶工程的研究意义酶和酶工程的研究意义生命活动过程中的新陈代谢所涉及的各种生命活动过程中的新陈代谢所涉及的各种化学反应由各种酶的催化来实现。化学反应由各种酶的催化来实现。（1）生命活动规律；）生命活动规律；（2）生物工程的工具；生物工程的工具；（3）医药工业（疾病发生、）医药工业（疾病发生、诊断诊断和治疗等）；和治疗等）；（4）工农业、环保等领域的应用；）工农业、环保等领域的应用；（5）分析工具。）分析工具。2.1酶的生产方法酶的生产方法提取法提取法采用各种提取、分离技术从动物、植物或微采用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来。是最生物细胞或组织中将酶提取分离出来。是最早采用的酶生产技术。目前在动、植物资源早采用的酶生产技术。目前在动、植物资源丰富的地区，仍有使用价值。丰富的地区，仍有使用价值。简单方便，但受气候、地理环境的影响，产简单方便，但受气候、地理环境的影响，产品含杂质较多，分离纯化较困难。品含杂质较多，分离纯化较困难。例如，从动物胰脏中提取胰酶；从动物胃中例如，从动物胰脏中提取胰酶；从动物胃中提取胃蛋白酶等提取胃蛋白酶等。4-2酶的生物发酵生产酶的生物发酵生产发酵法发酵法利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得所需的酶。获得所需的酶。根据微生物培养方式的不同，分为固体培养根据微生物培养方式的不同，分为固体培养法、液体深层法、固定化细胞和固定化原生法、液体深层法、固定化细胞和固定化原生质体法等。质体法等。化学合成法化学合成法现在已可用肽合成仪来进行酶的化学合成。现在已可用肽合成仪来进行酶的化学合成。合成成本高昂，且只能合成已知化学结构的合成成本高昂，且只能合成已知化学结构的酶。酶。酶的生产方法酶的生产方法2.2发酵生产用产酶菌株的要求发酵生产用产酶菌株的要求酶的产量高酶的产量高容易培养和管理容易培养和管理产酶稳定性好产酶稳定性好利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化安全可靠安全可靠2.3菌种获得途径：菌种获得途径：菌种保存机构菌种保存机构筛选筛选菌种采集菌种采集菌种的分离、纯化菌种的分离、纯化菌种生产性能的检定菌种生产性能的检定初筛：从已分离的菌种中挑出可产初筛：从已分离的菌种中挑出可产生目的酶的菌株。生目的酶的菌株。复筛：在初筛基础上筛选产酶量高、复筛：在初筛基础上筛选产酶量高、性能更符合要求的菌株。性能更符合要求的菌株。一、菌种的活化和扩大培养(一)菌种活化(二)菌种的扩大培养 二、发酵培养基的制备 1碳源，碳源是指能向细胞提供碳素的含碳化合物。一般采用淀粉及其水解产物，如糊精、麦芽糖等 2氮源，能够向细胞提供氮素的化合物称为氮源。氮源分为有机氮和无机氮。有机氮主要是各种蛋白质材料及蛋白质的水解产物 。无机氮包括各种铵盐和硝酸盐等。 3无机盐类无机盐提供细胞生命活动必需的无机元素，对培养基的pH、缓冲能力和渗透压起调节作用。 4生长因子生长因子是指细胞生长繁殖所必需的微量有机物质，包括维生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等，它们是构成辅酶的必需物质。 三、酶合成的促进剂和阻遏物 (一)酶合成的促进剂 在培养基中少量添加就明显著增加酶产量的物质，统称为产酶促进剂它们大多属于酶合成的诱导物、酶的稳定剂或表面活性剂。诱导物多为底物或底物类似物，如淀粉、蔗糖、纤维素分别是淀粉酶、蔗糖酶、纤维素酶的诱导物。 (二)酶合成的阻遏物微生物酶的生产受代谢途径末端产物和分解代谢产物的阻遏。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶的合成受其催化产物无机磷酸的抑制 2.4酶的发酵生产方法 产酶效率高 ，细胞被固定化后，只能在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，故可加快生化反应速度，提高产酶率。 可进行连续发酵，固定化细胞固定在载体上，不易脱落，可反复使用多次。 缩短发酵周期，提高设备利用率，在利用固定化细胞发酵时，第二批次及以后批次的发酵周期缩短。酶容易分离纯化，固定化细胞颗粒很容易与发酵液分离，发酵液中游离细胞很少，因此有利于酶的分离纯化 2.5酶的发酵条件控制 (一)温度 不同的微生物生长有不同的最适温度，例如黑曲霉的最适温度为2832，枯草杆菌最适温度是3437。 (二)pH值 不同的微生物所需要的最适pH不同。例如，黑曲霉既可产生，淀粉酶，又可产生糖化酶，当培养基的pH偏中性时，有利于淀粉酶的生产；而当pH偏酸性时糖化酶产量提高，淀粉酶产量降低。 (三)溶解氧在发酵过程中应连续不断地供给无菌空气，同时进行搅拌以增加培养基中溶解氧的含量。 4-3酶的分离纯化 3.1酶分离纯化的一般程序 首先获得出发酶液。如果微生物发酵生产的是胞外酶，液体发酵的培养液或固体培养物的抽提液就是出发酶液；如果发酵生产的是胞内酶，先分离收集菌体，将其破碎，再利用提取液将酶抽提至液相，即获得出发酶液。除去出发酶液中的悬浮固形物获得澄清的酶液。利用各种技术将酶沉淀分离。将获得的沉淀干燥，研磨成粉，加入适当的稳定剂、填充剂等，做成粉末制剂。当对酶产品的纯度要求很高时，还需要精制。 保藏菌种保藏菌种活化活化扩培扩培发酵发酵分离纯化分离纯化成品成品(酶酶)固体发酵固体发酵液体发酵液体发酵一般工艺流程：一般工艺流程：3.2酶分离提取的条件控制 1温度操作过程尽可能在低温()下进行，溶液中存在无机盐或有机溶剂时，更应如此，以防止蛋白质水解酶对目的酶的分解破坏。2pH 在提纯过程中通常采用一定pH的缓冲液，防止溶液过酸或过碱影响酶的稳定性和溶解度。3盐浓度 大多数蛋白质具有在适当的盐浓度下溶解度增大的性质，但当盐浓度过高时，酶蛋白易变性失活。 4杂菌污染 含酶溶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中要防止杂菌污染。3.3酶的工业分离纯化技术(一)细胞破碎技术 1机械破碎 2物理破碎 3化学破碎法 4酶法酶法 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-IID超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细细胞胞破破碎碎珠珠高高压压细细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理本章目录微生物细胞的破碎一、一、机械破碎法机械破碎法1、高压匀浆法高压匀浆法2、珠磨法、珠磨法3、超声破碎法、超声破碎法二、非机械破碎法二、非机械破碎法1、酶溶法、酶溶法2、化学渗透法、化学渗透法（二）发酵液的絮凝与凝聚技术 1、凝聚凝聚是指在电解质作用下，溶液的胶粒之间双电层排斥作用降低，而使胶体体系不稳定，胶粒间相互凝聚的现象。常用的凝聚电解质有硫酸铝、氯化铝、三氯化铁、硫酸亚铁、石灰、硫酸锌、碳酸镁等。2絮凝絮凝是指在某些高分子絮凝剂的作用下，溶掖中的较小胶粒聚合形成较大絮疑团的过程。采用絮凝法产生的絮凝团较粗大，容易过滤分离。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物分子量可高达数万至一千万以上，它们具有长的链状结构，其链节上含有许多活性基团，包括带正、负电荷的离子，如羧基(COOH)、氨基(NH2)等 絮凝剂可分为三类：有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶黏物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。(三)发酵液的过滤技术1过滤技术的分类 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透4大类。 根据过滤对产生推动力的条件不同，粗滤可分为常压过滤、离心过滤、加压过滤、减压过滤等4种。常用的过滤设备 (1)板框过滤机，适合于固体含量110的悬浮液的分离。 (2)真空转鼓过滤机，适合于固体颗粒大、固体含量高(10)的悬浮液的分离 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶酶提取提取酶酶分离纯化分离纯化酶酶浓缩浓缩酶酶贮存贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶提取和酶提取和分离纯化分离纯化的步骤的步骤酶产品的提取和分离纯化的一般步骤：酶产品的提取和分离纯化的一般步骤：胞内酶：细胞分离收集菌体胞内酶：细胞分离收集菌体破碎破碎匀浆匀浆胞外酶：发酵液或固体培养物的酶浸提物胞外酶：发酵液或固体培养物的酶浸提物离心或过滤离心或过滤沉淀分离沉淀分离干燥干燥精制精制(四)酶的提取技术 1稀盐溶液抽提，是利用某些蛋白质溶解于稀盐溶液的特性来提取酶的。大多数酶溶于水，而且在一定浓度盐存在的条件下，溶解度增加，这称为盐溶现象。 2稀酸溶液抽提，某些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，适宜用稀酸溶液提取。 3稀碱溶液抽提，某些酶在碱性条件下溶解度较大，而且稳定性好，适用于稀碱溶液提取。4有机溶剂抽提，某些酶与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多，不溶或难溶于极性溶剂，需用乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。 5双水相体系萃取 它是利用两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，体系形成的互不兼容的两相，即双水相体系来提取酶。 (五)酶的离心分离技术 离心分离是酶提取纯化过程中最常用的方法，是借助离心机旋转所产生的离心力，使酶与其他物质分离的技术。主要用于除去发酵液中的菌体残渣、培养基残渣以及抽提过程中生成的沉淀物。(六)酶的沉淀分离技术1盐析沉淀法 盐析沉淀法又称为盐析法，该法利用蛋白质在一定浓度的盐溶液中沉淀的特性分离蛋白质。在盐浓度较高时，由于盐离子的水合作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质的溶解度下降，蛋白质沉淀，这就是盐析现象。 2有机溶剂法 在等电点附近，蛋白质分子主要以两性电解质的形式存在。如果这时添加有机溶剂，由于有机溶剂的存在使溶液的介电常数降低，两性电解质分子之间的静电引力增大，从而使分子凝聚沉淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用也会破坏蛋白质表面的水合层，导致蛋白质分子脱水而沉淀。 3有机聚合物沉淀法 除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。常用于蛋白质沉淀的有机聚合物有PEG6000、PEG20000、聚丙烯酸、单宁等。 4选择性变性沉淀法有一些蛋白质的稳定相当好，可忍受极端环境条件，因此，可利用极端条件使非目的酶变性，并从溶液中沉淀出来，从而使目的酶得到分离。可供利用的变性条件有热变性、pH变性和有机溶剂变性。(七)酶的浓缩技术 由于发酵液或酶的抽提液中酶的浓度一般都比较低，一般用减压、超滤等方法进行适当浓度的浓缩。(八)酶的干燥技术酶的工业化制剂有液态和固体粉剂两种。固体酶制剂稳定性高，便于贮存、运输和应用。干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分除去一部分，以获得含水量较少的固体的过程。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥等。 3.4酶的精制技术(一)透析与超滤技术 1透析 2超滤 (二)层析分离技术 1吸附层析技术 2离子交换层析技术 3凝胶层析技术 4亲和层析 (三)电泳分离技术 1凝胶电泳技术 2等电聚焦电泳技术 1、根据酶分子溶解度不同的方法、根据酶分子溶解度不同的方法2、根据酶分子大小和形状不同的方法、根据酶分子大小和形状不同的方法3、根据酶分子电荷性质的方法、根据酶分子电荷性质的方法4、根据酶分子专一性结合的分离方法、根据酶分子专一性结合的分离方法5、根据分配系数的分离方法、根据分配系数的分离方法6、其他分离方法、其他分离方法酶的提取和精制酶的提取和精制溶解度溶解度不同不同盐析盐析沉淀法沉淀法等电点等电点沉淀法沉淀法有机溶剂有机溶剂沉淀法沉淀法复合复合沉淀法沉淀法根据某一浓根据某一浓度的盐溶液度的盐溶液中不同浓度中不同浓度的蛋白质和的蛋白质和酶的溶解度酶的溶解度不同不同根据两性根据两性电解质在电解质在等电点时等电点时溶解度最溶解度最低低利用酶利用酶在有机在有机质中的质中的溶解度溶解度的不同的不同利用酶利用酶能与某能与某些物质些物质形成沉形成沉淀淀酶分子酶分子大小和形状大小和形状离心离心分离法分离法凝胶凝胶过滤法过滤法透析透析超滤超滤反渗透反渗透电渗析电渗析琼脂和琼脂凝胶、聚丙烯琼脂和琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡萄糖凝胶酰胺凝胶、葡萄糖凝胶膜分离技术膜分离技术离子交换柱层析离子交换柱层析层析聚焦层析聚焦电泳分离电泳分离等电聚焦电泳等电聚焦电泳酶分子酶分子电荷性质电荷性质酶分子专一性结合酶分子专一性结合1、亲和层析、亲和层析2、免疫吸附层析、免疫吸附层析3、染料配体亲和层析、染料配体亲和层析4、共价层析、共价层析3.5酶制剂的保藏条件 (一)合适的温度 (二)适当的p 值 (三)抗氧化保护 (四)提高酶的浓度和纯度4-4酶分子的改造与修饰酶分子的改造与修饰1、稳定性差、稳定性差2、对反应的温度、要求严格、对反应的温度、要求严格3、Km值过大值过大4、具有抗原性、具有抗原性天然酶在应用中的限制因素天然酶在应用中的限制因素定义：通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质定义：通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功共价结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。能的过程。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。4.1酶分子修饰的意义酶分子修饰的意义提高酶的活力提高酶的活力 activityactivity增强酶的稳定性增强酶的稳定性 stabilitystability降低或消除酶的抗原性降低或消除酶的抗原性 immunological immunological propertyproperty研究和了解酶分子中主链、侧链、组成研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响子空间构象的影响 structure structure 酶分子修饰的基本要求和条件酶分子修饰的基本要求和条件 1 1 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1 1）酶的稳定性）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂、抑制剂等。等。 （2 2）酶活性中心的状况）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。状、亚基数等。酶分子修饰的条件酶分子修饰的条件2 2 在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1 1）pHpH与离子强度与离子强度 pHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2 2）修饰反应的温度与时间）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。一性的修饰反应。（3 3）反应体系中酶与修饰剂的比例）反应体系中酶与修饰剂的比例 1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰、大分子结合修饰3、侧链水解修饰、侧链水解修饰4、侧链基团修饰、侧链基团修饰5、酶基因与改造、酶基因与改造6、酶分子的物理修饰、酶分子的物理修饰4.2主要修饰技术主要修饰技术1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。的特性和功能发生改变的方法。定义：定义：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。常用于酶分子修饰的是二价金属离子，如：常用于酶分子修饰的是二价金属离子，如：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。等。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰pa.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。pb.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶）等，使酶分子中的金属离子与分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。除去。此时，酶往往成为无活性状态。pc c. . 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰金属离子置换修饰只适用于那些在分子结金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。都是二价金属离子。1、金属离子置换修饰、金属离子置换修饰例如例如:锌型蛋白酶锌型蛋白酶Zn2+Ca2+活力提高活力提高20%30%30%淀粉酶淀粉酶Mg2+,Zn2+Ca2+可提高活力可提高活力增加稳定性增加稳定性2、大分子结合修饰、大分子结合修饰定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。的特性与功能的方法。常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。使用前一般需经过活化，然后合物、聚氨基酸等。使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。在一定条件下与酶分子共价结合。修饰条件的控制：修饰剂的种类与浓度、温度、修饰条件的控制：修饰剂的种类与浓度、温度、pH和反应时和反应时间等。间等。此法是目前应用最广泛的酶分子修饰方法此法是目前应用最广泛的酶分子修饰方法.如尿激酶与大分子如尿激酶与大分子结合增加稳定性结合增加稳定性,木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合.聚乙二醇对色氨聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰消除抗原性酸酶进行修饰消除抗原性定义：有些酶的肽链经有限水解，使酶的空间结构发生定义：有些酶的肽链经有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法。某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法。利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。方法：方法：常用修饰剂：专一性较强的蛋白酶或肽酶。常用修饰剂：专一性较强的蛋白酶或肽酶。其他：如其他：如EDTA+纯水或稀盐酸透析处理枯草杆菌中纯水或稀盐酸透析处理枯草杆菌中性蛋白酶，可使其部分水解。性蛋白酶，可使其部分水解。3 3、 酶侧链水解修饰酶侧链水解修饰( (肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰) )4 4、 酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。性和功能的修饰方法。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。（1）羧基修饰剂 羧基修饰剂可使羧基酯化、酰基化或结合上其他基团。最早用来修饰蛋白质侧链羧基的修饰剂是乙醇盐酸试剂，它可使羧基产生酯化作用。 常见基团的化学修饰反应：常见基团的化学修饰反应：羧基羧基（2）氨基修饰剂 主要有二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。它们可与氨基共价结合将氨基屏蔽起来，或导致脱氨基作用，从而改变酶蛋白的构象或性质。例如用O甲基异脲与溶菌酶赖氨酸残基的氨基结合，酶活力保持不变，但稳定性提高，而且很容易结晶析出；用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸的氨基转变为羟基，使酶的稳定性提高，在体内的半衰期可延长2倍。常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基（3）巯基修饰剂 巯基在维持亚基间的相互作用和在酶的催化过程中起重要的作用，然而巯基却容易发生变化，从而改变酶的性质和催化特性。常用的 巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。 常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：咪唑常见基团的化学修饰反应：咪唑基基（4）酚基修饰剂 常用碘化法、硝化法和琥珀酰化法等修饰酶蛋白中的酚基。酚基经修饰剂修饰后，引入负电荷，因而增大酶对带正电荷的底物的结合力常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基（5）胍基修饰剂 精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用做胍基修饰剂。 常见基团的化学修饰反应：胍常见基团的化学修饰反应：胍基基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基基（6）分子内交联剂 用含有双功能团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定。 5、酶基因与改造、酶基因与改造20世纪世纪80年代在基因工程基础上发展而来的年代在基因工程基础上发展而来的酶的蛋白质工程，又称为第二代基因工程，是指酶的蛋白质工程，又称为第二代基因工程，是指通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术。的技术。新蛋白质的设计新蛋白质的设计突变基因的核苷酸序列突变基因的核苷酸序列的确定的确定突变基因的获得突变基因的获得新蛋白质的产生新蛋白质的产生生物酶工程主要包括三方面内容：用基因工程技术大量生产酶；修饰酶基因，产生遗传修饰；设计出新酶基因，合成自然界中从未有过的酶。 基因工程的方法包括基因工程的方法包括:利用克隆利用克隆,良好的宿主良好的宿主-载体系统和不同的表达系统载体系统和不同的表达系统基因的定点诱变基因的定点诱变随机诱变随机诱变蛋白质分子剪裁蛋白质分子剪裁对蛋白质功能元件进行分解或重组来获得具有单一对蛋白质功能元件进行分解或重组来获得具有单一或复合功能的新蛋白质或复合功能的新蛋白质 酶基因克隆及表达的大致步骤酶基因克隆及表达的大致步骤 克隆克隆是酶基因工程的关键一步，是把编码目的酶的基因插入适当的载体，后带入载体相容的宿主，并随宿主复制。酶基因插入载体后，在宿主中有两种表达方式，一种是利用自身自身携带的起始密码起始密码子，启动合成与天然酶完全相同的酶相同的酶 另一种是利用载体载体所具有的密码子密码子，合成相应的融合蛋白融合蛋白，融合蛋白经化学或酶法水解水解后形成天然酶。要构建一个具有良好产酶性能的菌株，必须具备良好的宿主宿主载体系统载体系统 理想的宿主应具备以下几个特性：所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高比例要高，能以活性形式分泌；菌体容易大规模培养大规模培养，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料；载体与宿主相容，克隆酶基因的载体能在宿主中稳定维持稳定维持；宿主中的蛋白酶蛋白酶尽可能少少，产生的外源酶不会被迅速降解降解；宿主菌对人安全安全，不分泌毒素。例如；青霉素酰化酶例如；青霉素酰化酶,葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶,凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶,丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶6 6、酶分子的物理修饰、酶分子的物理修饰 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。作用下，副键发生某些变化和重排。通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pHpH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。的特性和功能的变化情况。酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。较明显。各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。抗能力，从而提高其稳定性。半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了变化，这种变化发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pHpH更接近于生理环境，在更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。临床应用上有较大意义。 KmKm的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，VmVm没有明显变化，但有些酶经修饰后，没有明显变化，但有些酶经修饰后，KmKm值变大。值变大。修饰酶的性质特征：修饰酶的性质特征：1、酶的热稳定性增强；、酶的热稳定性增强；2、消除抗原性作用；、消除抗原性作用；3、许多修饰酶在体内的半衰期延长；、许多修饰酶在体内的半衰期延长；4、修修饰饰酶酶的的最最适适pH值值均均向向有有利利于于生生理理和和临临床床应应用范围变化；用范围变化；5、对最大反应速度和米氏常数的影响；、对最大反应速度和米氏常数的影响；6、修饰酶对组织的分布能力有所提高。、修饰酶对组织的分布能力有所提高。4-5酶的固定化酶的固定化游离酶在应用中的不足游离酶在应用中的不足稳定性差；稳定性差；难于回收重复利用；难于回收重复利用；给后续分离纯化增加困难给后续分离纯化增加困难。固定化酶固定化酶固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。酶。用于固定化的酶，通常是经提取分离纯化后的酶，也用于固定化的酶，通常是经提取分离纯化后的酶，也可以是含酶菌体或菌体碎片。可以是含酶菌体或菌体碎片。优点：稳定性增加；可反复使用；利于连续操作；易优点：稳定性增加；可反复使用；利于连续操作；易于和反应产物分离。于和反应产物分离。通常采用的固定化方法可大体概括为：载体通常采用的固定化方法可大体概括为：载体结合法、结合法、离子交换吸附法、离子交换吸附法、共价偶联法、交共价偶联法、交联法、螯合法、包埋法和热处理法等。联法、螯合法、包埋法和热处理法等。5.1酶固定化的方法酶固定化的方法载体结合法载体结合法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。根据吸附剂的特点又分为两种：到固定目的的方法。根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附和离子交换吸附。物理吸附和离子交换吸附。物理吸附物理吸附：通过氢键、疏水键等物理作用力将酶固定于不溶通过氢键、疏水键等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。性载体的方法。常用的载体常用的载体无机吸附剂：活性炭、高岭土、氧化铝、硅胶、无机吸附剂：活性炭、高岭土、氧化铝、硅胶、微孔玻璃、多孔陶瓷等；微孔玻璃、多孔陶瓷等；有机吸附剂：纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂：纤维素、胶原、火棉胶等。通常有机吸附剂的吸附容量高于无机吸附剂，且通常有机吸附剂的吸附容量高于无机吸附剂，且无机吸附剂会使某些酶发生吸附变性。吸附力弱无机吸附剂会使某些酶发生吸附变性。吸附力弱.离子交换吸附离子交换吸附在适宜的在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团的相互作用而达到酶固定离基团和离子交换基团的相互作用而达到酶固定化的方法。化的方法。常用离子交换剂：常用离子交换剂：CMC、DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶等。二乙胺基乙基纤维素二乙胺基乙基纤维素离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。具体的操作方法分类具体的操作方法分类静态法静态法电沉积法电沉积法动力学批量式固定化法动力学批量式固定化法反应器装载法反应器装载法特点特点优点：操作简便，条件温和，吸附剂可反复使用。优点：操作简便，条件温和，吸附剂可反复使用。缺点：酶和载体吸附力较弱，易解吸脱落。缺点：酶和载体吸附力较弱，易解吸脱落。共价结合法共价结合法借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备固定化酶的方法。行偶联制备固定化酶的方法。常用载体常用载体天然高分子及其衍生物：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝天然高分子及其衍生物：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等；胶、甲壳质等；合成高聚物：聚丙烯酰胺、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共合成高聚物：聚丙烯酰胺、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。聚物等。酶分子中可形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、酶分子中可形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。羟基、酚基和咪唑基等。载体首先需活化，即引入活泼基团。载体首先需活化，即引入活泼基团。特点：特点：优点：酶与载体结合很牢固，酶不会脱落，可以长期使用；优点：酶与载体结合很牢固，酶不会脱落，可以长期使用；缺点：载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时在反应过程缺点：载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时在反应过程中可能影响酶的空间构象而影响其催化活性。中可能影响酶的空间构象而影响其催化活性。螯合法螯合法螯合法螯合法此法将酶螯合到载螯合到载体表面的钛(二价或四价)、铬(四价)和钒(三价)等金属氢氧化物金属氢氧化物上。 包埋法包埋法将酶包埋在高分子凝胶微孔中或高分子半透膜微囊内，将酶包埋在高分子凝胶微孔中或高分子半透膜微囊内，酶被包埋后不会扩散到周围介质中，而底物和产物却酶被包埋后不会扩散到周围介质中，而底物和产物却能自由出入。能自由出入。常用载体：琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、聚丙烯常用载体：琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶、尼龙等。酰胺、火棉胶、尼龙等。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法凝胶包埋法半透膜（微胶囊）包埋法半透膜（微胶囊）包埋法脂质体包埋法脂质体包埋法优点优点是： 有较好的适应性，原则上既可固定化酶也可固定化不同种类、不同生理状态的细胞； 条件温和，方法简便； 稳定性好，特别是固定化细胞； 容量高，包埋法制备的固定化酶或固定化细胞的含量可达30 %- 60 % ，全部载体体积均可利用；包埋后载体可防止蛋白酶及机械作用对酶的损害。缺点缺点： 载体大分子对底物和产物的扩散阻力大，因此对作用于大分子底物的酶，固定化后活力较低，因底物不易穿透包埋物； 由于酶分子较小，故有时有漏出现象。 共价交联法（架桥法）共价交联法（架桥法）利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，制备固定化蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，制备固定化酶的方法。酶的方法。常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中戊二醛最为常用。苯等。其中戊二醛最为常用。特点：特点：优点：操作简便，结合牢固，可长时间使用。优点：操作简便，结合牢固，可长时间使用。缺点：交联反应条件较激烈，酶活力损失较大，缺点：交联反应条件较激烈，酶活力损失较大，且制成的固定化酶颗粒较小，机械强度也较低，且制成的固定化酶颗粒较小，机械强度也较低，使用不便。使用不便。如何选择载体如何选择载体： 根据固定化对象确定固定化方法根据固定化对象确定固定化方法：一般对酶的固定化多采用共价结合、离子结合和物理吸附等方法；而固定化细胞则以包埋法有效。 根据固定化方法选择载体：根据固定化方法选择载体： 具有离子交换基团和吸附蛋白质能力的如CM纤维素、DEAE纤维素、CMSephadex、DEAESephadex及藻土、磷灰石等均可作为离子结合和物理吸附法的载体。而具有活性基团如羟基、氨基、羧基、酰胺基、巯基的载体，如多糖类、蛋白质类、多孔玻璃、硅胶等也可经过适当的化学反应结合上更活泼的基团而直接用于和酶形成共价键而将酶固定化。上述载体都可用于共价键合法的载体，而能形成凝胶或进行凝聚的琼脂、角叉菜胶、海藻酸盐、明胶、聚丙烯酰胺等，可作为包埋法的载体。共价交联法共价交联法这种方法实用意义不大，多用于下述辅助场合：这种方法实用意义不大，多用于下述辅助场合：将酶蛋白和惰性蛋白交联，从而减少目的将酶蛋白和惰性蛋白交联，从而减少目的酶活力的大幅度降低；酶活力的大幅度降低；为克服物理吸附法制备的固定化酶在使用为克服物理吸附法制备的固定化酶在使用时易脱落的缺点，用交联剂将吸附好的酶交联时易脱落的缺点，用交联剂将吸附好的酶交联在载体表面，形成一个交联酶分子层，从而增在载体表面，形成一个交联酶分子层，从而增加牢固程度、防止酶脱落；加牢固程度、防止酶脱落；包埋法制备的固定化酶，由于载体孔径大，包埋法制备的固定化酶，由于载体孔径大，酶分子易漏出，包埋后进行交联，可防止酶漏酶分子易漏出，包埋后进行交联，可防止酶漏出，同样也可交联包埋细胞。出，同样也可交联包埋细胞。热处理法热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制得。定在菌体内而制得。只适用于热稳定性较好的酶的固定化。热处理时，要只适用于热稳定性较好的酶的固定化。热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如：链霉菌细胞中葡萄糖异构酶的固定化，可采用例如：链霉菌细胞中葡萄糖异构酶的固定化，可采用6065下处理下处理15min。5.2固定化酶的性质固定化酶的性质1稳定性稳定性对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定性好，可以在一定条件下长期保存；保存稳定性好，可以在一定条件下长期保存；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被其水解；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被其水解；对变性剂的耐受性提高。对变性剂的耐受性提高。2最适温度最适温度固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多；固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多；有些固定化酶则与游离酶比较有较明显的变化。固定化有些固定化酶则与游离酶比较有较明显的变化。固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。的影响。3最适最适pH载体性质对最适载体性质对最适pH值的影响值的影响载体带负电荷，则制得的固定酶其最适载体带负电荷，则制得的固定酶其最适pH向碱性一侧偏移；向碱性一侧偏移；载体带正电荷，则制得的固定酶其最适载体带正电荷，则制得的固定酶其最适pH向酸性一侧偏移；向酸性一侧偏移；载体不带电，则制得的固定酶其最适载体不带电，则制得的固定酶其最适pH一般不改变。一般不改变。产物性质对最适产物性质对最适pH值的影响值的影响产物为酸性时，固定化酶的最适产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶高一些；要比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶低一些；要比游离酶低一些；产物为中性时，最适产物为中性时，最适pH一般不改变。一般不改变。固定化酶的性质固定化酶的性质l4底物特异性底物特异性q对于只作用于低分子底物的酶，固定化前后的底对于只作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化；物特异性没有明显变化；q对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。固定化酶的性质固定化酶的性质多数情况下酶的活性降低多数情况下酶的活性降低其可能原因有：酶固定化改变其可能原因有：酶固定化改变酶的构象酶的构象，从而，从而导致酶与底物结合能力和酶催化活力的改变；导致酶与底物结合能力和酶催化活力的改变；载体的存在影响底物或其它效应物对酶调节部载体的存在影响底物或其它效应物对酶调节部位的位的调节作用及调节效应调节作用及调节效应；在固定化酶体系中，；在固定化酶体系中，底物和产物的扩散底物和产物的扩散受到限制。受到限制。反应动力学常数发生变化反应动力学常数发生变化当酶固定于中性载体后，表观米氏常数往往比当酶固定于中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶高，而最大反应速度变小；而当酶与带游离酶高，而最大反应速度变小；而当酶与带负电荷的载体结合后，表观米氏常数往往变小。负电荷的载体结合后，表观米氏常数往往变小。5.3细胞的固定化细胞的固定化固定化细胞的优点固定化细胞的优点大大降低成本，省去酶的分离纯化工作，省去破碎大大降低成本，省去酶的分离纯化工作，省去破碎细胞提取酶的程序，减少酶的活性损失；细胞提取酶的程序，减少酶的活性损失；可以作为单一的酶发挥作用，也可利用它所包含的可以作为单一的酶发挥作用，也可利用它所包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过程。复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过程。酶在细胞内环境中的稳定性高，固定后活性回收率酶在细胞内环境中的稳定性高，固定后活性回收率高；可利用细胞中的复合酶系进行连续酶反应；一高；可利用细胞中的复合酶系进行连续酶反应；一般固定化细胞成本低于固定化酶。般固定化细胞成本低于固定化酶。目前，随着固定化细胞技术的发展，其实际应用甚至目前，随着固定化细胞技术的发展，其实际应用甚至超过了固定化酶。超过了固定化酶。需注意的问题有：酶反应的底物和产物能否通过细胞需注意的问题有：酶反应的底物和产物能否通过细胞膜、细胞内是否存在产物的分解系统和其他副反应。膜、细胞内是否存在产物的分解系统和其他副反应。固定化细胞的方法与固定化酶的方法基本相似。固定化细胞的方法与固定化酶的方法基本相似。直接固定化法直接固定化法无载体情况下，借助物理或化学方法将细胞直接固无载体情况下，借助物理或化学方法将细胞直接固定的方法。例如，靠细胞自身的絮凝作用或添加少定的方法。例如，靠细胞自身的絮凝作用或添加少量助凝剂促进细胞的絮凝而使细胞固定化。量助凝剂促进细胞的絮凝而使细胞固定化。优点：能获得高细胞密度，且不会损害细胞的生存。优点：能获得高细胞密度，且不会损害细胞的生存。缺点：机械强度极差，不能承受压缩或强的剪切作缺点：机械强度极差，不能承受压缩或强的剪切作用。此外，若是细胞活力很高，那么密集填充的细用。此外，若是细胞活力很高，那么密集填充的细胞，必将导致严重的传递阻力。胞，必将导致严重的传递阻力。细胞固定化的方法细胞固定化的方法吸附法吸附法利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。胞固定化的方法。常用吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔常用吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。特点特点优点；操作简便，对细胞和生长、繁殖没有明显优点；操作简便，对细胞和生长、繁殖没有明显的影响；的影响；缺点：吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落，缺点：吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落，使用受到一定的限制。使用受到一定的限制。该法是制备固定化动物细胞的主要方法。该法是制备固定化动物细胞的主要方法。包埋法包埋法将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。同样可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。法。同样可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法凝胶包埋法以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法。它是应用最广泛的细胞固定化方法。细胞固定化的方法。它是应用最广泛的细胞固定化方法。适用于各种微生物和动植物细胞的固定化。适用于各种微生物和动植物细胞的固定化。常用载体：琼脂、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶、聚丙烯常用载体：琼脂、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。酰胺凝胶和光交联树脂等。常用方法介绍常用方法介绍琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法明胶包埋法明胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法交联和共价偶联法交联和共价偶联法因所用试剂对细胞有较大毒性，故很少应用于细胞因所用试剂对细胞有较大毒性，故很少应用于细胞的固定化。的固定化。可与包埋法或吸附法结合，进行细胞的双重固定化。可与包埋法或吸附法结合，进行细胞的双重固定化。固定化动物细胞固定化动物细胞：与植物、微生物细胞有所不同动物细胞有两种不同的培养育方法，第一种必须附着在固体固体表面表面上，形成单层单层生长的细胞；第一种所谓“锚地依赖性”细胞，不能在诸如角叉菜聚糖、海藻酸及琼脂糖等载体聚合物的网状结构上生长，但能在血纤维蛋白上附着和生长。血纤维蛋白是在凝血酶的作用下，由血纤维蛋白原转化而形成的，它在动物细胞培养中起着类似“微载体”的作用。第二种则为悬浮培悬浮培养，不要求固体表面，可在培养液中培养液中自由生长。琼脂糖可用作这种细胞的包埋载体。4-6酶反应器酶反应器酶反应器：以酶作为催化剂进行反应所需的设备。主要酶反应器：以酶作为催化剂进行反应所需的设备。主要指游离酶、固定化酶或固定化细胞催化反应的容器。指游离酶、固定化酶或固定化细胞催化反应的容器。作用：以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应作用：以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定产物。物制备特定产物。特点：不同于化学反应器，在低温、低压下发挥作用，特点：不同于化学反应器，在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能也比较少；也不同于发酵反应器，反应时的耗能和产能也比较少；也不同于发酵反应器，因为它不表现自催化方式。因为它不表现自催化方式。6.1酶反应器的类型及特点酶反应器的类型及特点型式名称型式名称操作方式操作方式特征特征均相酶均相酶反应器反应器搅拌罐搅拌罐分批，半分批分批，半分批反应器内的溶液用搅拌器机械混合反应器内的溶液用搅拌器机械混合超滤膜超滤膜反应器反应器分批，半分批，分批，半分批，连续连续膜只允许低分子化合物通过而酶不能通过，膜只允许低分子化合物通过而酶不能通过，适用于大分子底物适用于大分子底物固定化酶反固定化酶反应器应器搅拌罐搅拌罐分批，半分批，分批，半分批，连续连续固定化酶悬浮在溶液中固定化酶悬浮在溶液中固定床或填固定床或填充床充床连续连续最广泛使用的固定化酶反应器。固定化酶最广泛使用的固定化酶反应器。固定化酶填充在反应器内，底物溶液一般由下向上填充在反应器内，底物溶液一般由下向上通入通入流化床流化床分批，连续分批，连续利用溶液的流动促使固定化酶在床内激烈利用溶液的流动促使固定化酶在床内激烈搅动、混合搅动、混合膜反应器膜反应器连续连续膜状或片状的固定化酶，组件形式有中空膜状或片状的固定化酶，组件形式有中空酶管、螺旋板、旋转圆盘型和平板型等酶管、螺旋板、旋转圆盘型和平板型等鼓泡塔鼓泡塔分批，半分批，分批，半分批，连续连续将固定化酶颗粒悬浮保留在塔内，适用于将固定化酶颗粒悬浮保留在塔内，适用于有气体参与的反应有气体参与的反应搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器传统形式的反应器，较常用。传统形式的反应器，较常用。结构组成：容器、搅拌器及热交换装置，有时在容器结构组成：容器、搅拌器及热交换装置，有时在容器壁上加装挡板。壁上加装挡板。操作：分批式或半分批式。操作：分批式或半分批式。特点：酶无法回收，特点：酶无法回收，但结构简单，不需但结构简单，不需特殊设备，适于小特殊设备，适于小规模生产。规模生产。搅拌罐式反应器可用于游离酶和固定化酶催化的反应。搅拌罐式反应器可用于游离酶和固定化酶催化的反应。特别是水解酶类的底物多数是带有黏性或是不溶于水的特别是水解酶类的底物多数是带有黏性或是不溶于水的颗粒，难以用固定化酶来处理，仍需游离酶来处理。颗粒，难以用固定化酶来处理，仍需游离酶来处理。搅拌罐式反应器用于固定化酶反应，具有搅拌罐式反应器用于固定化酶反应，具有固定化酶更换容易等特点，但载体易被旋固定化酶更换容易等特点，但载体易被旋转搅拌桨叶的剪切力所破坏，搅拌动力消转搅拌桨叶的剪切力所破坏，搅拌动力消耗也大。此外，对于分批反应器，在用离耗也大。此外，对于分批反应器，在用离心或过滤沉淀方法回收固定化酶时，易造心或过滤沉淀方法回收固定化酶时，易造成酶的失活和回收损失成酶的失活和回收损失固定床反应器固定床反应器把催化剂填充在固定床把催化剂填充在固定床(填充床填充床)中的反应中的反应器称为固定床型反应器。器称为固定床型反应器。 当前工业上多数采用此类反应器。当前工业上多数采用此类反应器。结构：将颗粒状或片状固定化酶填充于其结构：将颗粒状或片状固定化酶填充于其中构成。中构成。操作特点：底物按一定方向以恒定速度通操作特点：底物按一定方向以恒定速度通过固定化酶床层，流动状态接近活塞流。过固定化酶床层，流动状态接近活塞流。特点：特点：优点：单位体积催化剂负荷量大，反应效率高，由于产物优点：单位体积催化剂负荷量大，反应效率高，由于产物浓度沿反应器长度是逐渐增高的，可减少产物的抑制作用。浓度沿反应器长度是逐渐增高的，可减少产物的抑制作用。缺点：温度与缺点：温度与pH难以控制，底物和产物会产生轴向浓度分难以控制，底物和产物会产生轴向浓度分布，清洗和更换固定化酶较麻烦。床内有自压缩倾向，易布，清洗和更换固定化酶较麻烦。床内有自压缩倾向，易堵塞，且床内压力降相当大，底物必须加压输入。堵塞，且床内压力降相当大，底物必须加压输入。流化床反应器流化床反应器结构：装有较小颗粒的垂直塔式反应器，反结构：装有较小颗粒的垂直塔式反应器，反应器形状可为柱形或锥形等。应器形状可为柱形或锥形等。操作特点：底物以一定速度由下向上流过，操作特点：底物以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在浮动状态下进行反应。流使固定化酶颗粒在浮动状态下进行反应。流体的混合程度可认为是介于体的混合程度可认为是介于CSTR和和PFR之之间。间。特点：特点：优点：具有良好的传质及传热性能。优点：具有良好的传质及传热性能。pH、温度控制及气温度控制及气体的供给比较容易；不易堵塞，可适用于处理粘度高的体的供给比较容易；不易堵塞，可适用于处理粘度高的液体；能处理粉末状底物；即使细小颗粒的固定化酶，液体；能处理粉末状底物；即使细小颗粒的固定化酶，压力降也不会很高。压力降也不会很高。缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大；由缺点：需保持一定的流速，运转成本高，难于放大；由于颗粒酶处于流动状态，易导致粒子的机械破损；由于于颗粒酶处于流动状态，易导致粒子的机械破损；由于流化床的空隙体积大，酶的浓度不高；由于底物高速流流化床的空隙体积大，酶的浓度不高；由于底物高速流动使酶冲出，降低了转化率。动使酶冲出，降低了转化率。膜型反应器膜型反应器膜式反应器利用膜的分离功能同时完成反应和分离过膜式反应器利用膜的分离功能同时完成反应和分离过过程，过程， 由膜状或板状固定化酶组装的反应器。包括用固定化由膜状或板状固定化酶组装的反应器。包括用固定化酶膜组装成的平板状或螺旋状反应器、转盘型反应器、酶膜组装成的平板状或螺旋状反应器、转盘型反应器、空心酶管和中空纤维膜反应器。空心酶管和中空纤维膜反应器。平板型或螺旋卷型反应器：平板型或螺旋卷型反应器：特点：压力降小，放大容易，但比表面积较小。特点：压力降小，放大容易，但比表面积较小。6.2酶反应器的发展酶反应器的发展含有辅助因子再生的酶反应器含有辅助因子再生的酶反应器许多酶反应都需要辅因子的参与。如辅酶、辅基、许多酶反应都需要辅因子的参与。如辅酶、辅基、能量供给体等。而这些辅因子的价格较贵，采用能量供给体等。而这些辅因子的价格较贵，采用简单的添加方法很不经济。简单的添加方法很不经济。特点：可使辅因子反复使用，降低生产成本。特点：可使辅因子反复使用，降低生产成本。两相或多相反应器两相或多相反应器许多底物不溶或微溶于水，在进行酶转化时，在水许多底物不溶或微溶于水，在进行酶转化时，在水相中有浓度低、反应体积大、分离困难、能耗大等相中有浓度低、反应体积大、分离困难、能耗大等缺点。缺点。特点：使酶反应在水特点：使酶反应在水-有机相中进行，大大增加反有机相中进行，大大增加反应时的底物浓度，而且还可减少底物，特别是产物应时的底物浓度，而且还可减少底物，特别是产物对酶的抑制作用，使酶反应进行到底及酶的操作稳对酶的抑制作用，使酶反应进行到底及酶的操作稳定性延长。定性延长。操作：两相反应通常是将酶或固定化酶置于水相中，操作：两相反应通常是将酶或固定化酶置于水相中，而底物溶解于有机相中，然后在搅拌乳化条件下反而底物溶解于有机相中，然后在搅拌乳化条件下反应。应。进展：液膜反应器，反胶团反应器等。进展：液膜反应器，反胶团反应器等。固定化多酶反应器固定化多酶反应器特点：可模拟微生物细胞的多酶系统，进行特点：可模拟微生物细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合成各种产物。多种酶的顺序反应，来合成各种产物。前景：有可能完全代替微生物发酵法来生产前景：有可能完全代替微生物发酵法来生产有用产品，用小型柱式反应器，取代庞大而有用产品，用小型柱式反应器，取代庞大而低效的微生物发酵罐。低效的微生物发酵罐。6.3酶反应器的设计酶反应器的设计目的：设计出一个既能充分发挥生物反应的优点，又可目的：设计出一个既能充分发挥生物反应的优点，又可克服一些限制的因素，以最低的生产成本，获得最高的克服一些限制的因素，以最低的生产成本，获得最高的产量和质量的酶反应器。产量和质量的酶反应器。设计原理设计原理酶促反应动力学以及温度、压力、酶促反应动力学以及温度、压力、pH等操作参数等操作参数对反应特性的影响；对反应特性的影响；反应器的型式和反应器内流体流动状态及传热特反应器的型式和反应器内流体流动状态及传热特性；性；需要的生产量及生产工艺流程。需要的生产量及生产工艺流程。酶反应器的运转酶反应器的运转利用酶反应器进行生产，首先需要根据生产目的、生产的规模、生产原料、产品的质量要求选择合适的酶反应器，以便充分利用酶的催化功能，生产出预期产品，同时降低反应过程的成本，即用最少量的酶，在最短时间内完成最大量的反应。此外，达到此目的还需要合理地配置、使用和操作反应器。 1防止微生物污染防止微生物污染 2酶反应器中流动状态的控制酶反应器中流动状态的控制 3反应器稳定性的控制反应器稳定性的控制 四、影响酶反应器的稳定性因素四、影响酶反应器的稳定性因素：温度过高、pH过高或过低、离子强度过大会造成酶变性失活；微生物及酶会对固定化酶造成破坏；氧化剂存在会导致酶氧化分解；重金属等有毒物质会对酶活性产生不可逆抑制；剪切力会对酶结构造成破坏；载体磨损会造成的酶损失；长期在高浓度底物和盐浓度中，固定化酶会逐步解吸。因此，在酶反应器使用和维护过程中，必须采取有针对性的措施。4-7生物传感器生物传感器 传感器传感器是一种能够检测被测量信号(参量)并将其转换为一种可输出信号的装置，通常由感受器、换能器和电信号处理装置感受器、换能器和电信号处理装置三部分组成。生物传感器是利用生物活性材料作为感受器，配以适当的换能器所构成的分析工具（或分析系统)。生物传感器可用来检测或计量化合物。7.1生物传感器的工作原理生物传感器的工作原理 生物传感器(Biosensor)是由固定化酶固定化酶(或细胞、细胞器等)与适当的换能器件与适当的换能器件构成的分析系统。 生物传感器必须有换能器生物传感器必须有换能器用于生物传感的换能器有电极、FEF(场效应晶体管)、光导纤维、热敏电阻和压电晶体等。换能器(Transducer)能将生化信号定量地转换为电信号。生物传感器的关键关键部分是感受器感受器。生物感受器所用的生物活性材料，一般是对被测分子具有高度选择能力的纯化酶、免疫系统、组织、细胞器或完整细胞，将这些材料制成固定化膜固定化膜。膜的制备原理与固定化酶和固定化细胞相似，常用的方法有夹心法、包埋法、吸附法、共价结合法、交联法和微胶囊法。理想的固定化方法，不应破坏生物材料的活性并延理想的固定化方法，不应破坏生物材料的活性并延长材料的活性长材料的活性 7.2两种生物传感器系统由于生物材料与惰性电极直接或间接作用，可将生物传感器系统分为两类：(1)间接系统：是由固定到膜上的酶及放到其附近的换能器组成。 (2)直接系统：在某些情况下，催化电子转移的酶，可直接与电极或半导体装置偶联从而可实现从氧化还原蛋白向电极的直接电子转移。而电子受体必须是另一种天然的氧化还原的共轭物 7.3生物传感器的类型生物传感器的类型生物传感器按检测器件的检测原理来分类，大致可分为热敏热敏生物传感器、场效应管场效应管(FET)生物传感器、压电压电生物传感器、光学光学生物传感器及声波生物传感器；按感受器所选用的生物材料可分为酶传感器，微生酶传感器，微生物传感器、免疫传感器、组织传感器物传感器、免疫传感器、组织传感器等。下面按后一分类介绍生物传感器。 (一)酶传感器 感受器由纯化酶制成的酶膜酶膜构成 该类型的传感器能够在常温常压下检测待测液中的糖类醇类糖类醇类、有机酸、氨基酸等生物分子的含量有机酸、氨基酸等生物分子的含量，其原理是传感器中的酶能将待测物质氧化或分氧化或分解，然后经过换能器将反应所导致的化学物质变化转变为电信号并进行放大和处理，从而推算出被测物质的浓度。 最典型的酶传感器是最典型的酶传感器是葡萄糖传感器葡萄糖传感器，其感受器是由葡萄糖氧化酶制成的酶膜，它将扩散进入感受器的葡萄糖化转变为葡萄糖酸，同时消耗氧气，使反应体系中的氧浓度下降。氧浓度变化由换能器氧电极检测。 (二)免疫传感器免疫传感器是利用抗体与抗原的特异性抗体与抗原的特异性反应来检测物质的。已有几种免疫传感器获得了初步成功。例如，绒毛促性腺激素绒毛促性腺激素(HCG)传感器，该传感器是将HCG抗体固定在二氧化钛电极的表面制成工作电极，通过它与固定尿素的参比电极之间形成一定的电位差，当电解液中加入含HCG抗原时，工作电极的电位立即发生变化，从电位变化可求出HCG浓度。由HCG的浓度可以判断动物是否怀孕。 (三)微生物传感器微生物传感器是应用细胞固定化技术，将各种微生物固定微生物固定在膜上的生物传感器。它利用微生物的呼吸作用或微生物体内的酶。该种传感器寿命长，非常适用于发酵过程中物质变化的测定。 (四)组织传感器 组织传感器是利用动物和植物组织中多酶组织中多酶系统系统的催化作用催化作用来识别分子的。由于所用的酶存在于天然组织内，无须进行人工提取纯化，因而比较稳定，制备成的传感器寿命较长。例如，猪肾组织切片含有丰富的谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶，将其与氨气敏氨气敏电极结合可制成检测谷氨酰胺的传感器。7.4生物传感器的作用特点生物传感器的作用特点 (一)生物传感器检测的专一性专一性 (二)生物传感器检测的高速度高速度 (三)生物传感器使用的简便性简便性 (四)生物传感器检测的连续性连续性 7.5多酶反应器多酶反应器 多酶反应器(生物反应器)是使生物技术工程转化为产业和生产力的关键技术生物反应器，是指利用酶或生物体（如微生物、动植物细胞）所具有的特殊功能，在体外进行生物化学反应的装置系统。1、多酶反应器的设计目标和要求多酶反应器的设计目标和要求多酶反应器的设计目标就是以尽可能低的成本，进行高效率的产品生产。其要求是： (1)高容积的生产率：容积生产率是随酶浓度或比活的增加而增加，但提高酶浓度和比活力是有限度的。 (2)简便有效地控制最佳反应条件。要使反应器的设计达到易连续化、自动化，能与仪表，自动控制系统或计算机系统相连接。 (3)尽可能降低能耗(4）减少污染(5)反应器应是加工简便、易行，投资低。 2、使用多酶反应器时的一些注意事项、使用多酶反应器时的一些注意事项 (1)生物催化剂的特性：为适应不同形式固定化酶或固定化细胞，就需设计不同形式的反应器不同形式的反应器，如；机械性能较好的固定化生物催化剂可适用于搅拌桶式反应器，也可用于固定床式反应器。而机械性能差的，则在搅拌桶式反应器上难以应用。 (2)反应类型：酶促反应分为六大类，水解酶和异构酶催化的反应较简单。而另一些酶类需辅因子，为维持反应正常进行，就需不断补充被消耗掉的辅因子。对单一酶反应就需补加辅因子补加辅因子再生系统。另外，酶促反应往往会产酸或产碱，使反应系统pH改变，为维持酶反应的最适条件，则需不断调整反应系统的pH。而有些耗氧反应及产气(如C02)反应，则应注意随时凋整反应体系的通气量，通气量，控制一定的氧分压。 (3)动力学性质：酶促反应的动力学性质，如底物浓度浓度，底物或产物的抑制常数抑制常数，扩散作散作用等均与反应器的性能有关，在设计反应器时都应充分给予考虑。(4)反应器的形式及大小：由于不同酶促反应的反应特性不同，则应采取不同形式的采取不同形式的反应器，如底物溶解度低的反应，则不宜用固定床式反应器，而宜采用搅拌桶式反应器。反应器的大小主要由生产规模所决定，但也受生物催化剂性能的影响，高活力的固定化酶可用小体积的反应器。 (5)热传递和温度的影响：酶促反应速度速度和酶的热失热失活速活速度均与温度温度有关。酶促反应活化能在2183千焦耳mol(520千卡mol)范围内，而酶失活所需能量为41.8-418千焦耳mol(10100千卡mol)。虽然酶失活所需能量高于活化能，但若热传递不好，造成热量的不断积累，温度升高，则将导致酶失活。因此，控制反应系统温度是十分重要的。一般酶促反应的最适温度在最适温度在2060C之间之间。(6)操作稳定性；即使反应条件控制很好，酶在反应过程中活力总是逐渐降低的，从而使反应器的效率逐渐降低。这在工业生产上是要尽量避免的。为解决这个问题，可采用多个反应器串联或并联形反应器串联或并联形式组成反应器组，并按一定顺序进行更换，从而可使生产保持在一个恒定的水平上进行。所用反应器的个数及更换时间，主要取决于酶的稳定性，即半衰期， 酶工程的应用酶工程的应用酶是生物学有力的研究工具酶是生物学有力的研究工具基因工程工具酶基因工程工具酶基因组学基因组学蛋白组学蛋白组学酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系工业用酶：淀粉糖业工业用酶：淀粉糖业农业用酶：饲料农业用酶：饲料医疗用酶：蛋白酶医疗用酶：蛋白酶 检测试剂检测试剂抗病毒等新药物开发抗病毒等新药物开发酶的应用酶的应用1、酶在医药方面的应用2、酶在食品方面的应用3、酶在轻工、化工方面的应用 4、酶在环境保护中的应用GoGoGoGo5、酶在生物技术方面的应用Go酶在医药方面的应用酶在医药方面的应用用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的治疗用酶进行疾病的治疗用酶制造各种药物用酶制造各种药物通通过过酶酶活力活力变变化化进进行疾病行疾病诊诊断断酶疾病与酶活力变化淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降谷丙转氨酶/谷草转氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨酰转肽酶（-GT）原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高醛縮酶急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降磷酸葡糖变位酶肝炎、癌症，活力升高乳酸脱氢酶肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性山梨醇脱氢酶（SDH）急性肝炎，活力显著提高脂肪酶急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高羟基丁酸脱氢酶心肌梗塞、心肌炎，活力增高磷酸己糖异构酶急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高鸟氨酸氨基甲酰转移酶急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高乳酸脱氢酶同工酶心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折，LDH5增高葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病亮氨酸氨肽酶（LAP）肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高用用酶酶测测定物定物质质的量的的量的变变化化进进行疾病行疾病诊诊断断 酶测定的物质用 途葡萄糖氧化酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病葡萄糖氧化酶+过氧化物酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病尿素酶尿素测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇测定胆固醇含量，诊断高血脂等DNA聚合酶基因通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因酶酶在疾病治在疾病治疗疗方面的方面的应应用用酶 名来 源用 途淀粉酶胰脏、麦芽、微生物治疗消化不良，食欲不振蛋白酶胰脏、胃、植物、微生物治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压脂肪酶胰脏、微生物治疗消化不良，食欲不振纤维素酶霉菌治疗消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血链激酶链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折青霉素酶蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶大肠杆菌治疗白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，动物预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎凝血酶动物，蛇，细菌，酵母等治疗各种出血病胶原酶细菌分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡右旋糖酐酶微生物预防龋齿 胆碱酯酶细菌治疗皮肤病，支气管炎，气喘溶纤酶蚯蚓溶血栓弹性蛋白酶胰脏治疗动脉硬化，降血脂核糖核酸酶胰脏抗感染，祛痰，治肝癌尿酸酶牛肾治疗痛风作作业业名词解释名词解释酶的生产方法有哪些？酶的生产方法有哪些？微生物细胞的破碎方法和原理。微生物细胞的破碎方法和原理。简述几种酶的提取和精制的方法及原理。简述几种酶的提取和精制的方法及原理。酶分子改造和修饰的方法及原理酶分子改造和修饰的方法及原理酶的固定化方法及原理酶的固定化方法及原理第五章第五章 细胞工程细胞工程Cell Engineering Cell Engineering 5-1细胞工程原理细胞工程原理I1.1细胞工程概述细胞工程概述 细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的理细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上通论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上通过过遗传操作及大规模的细胞和组织培养遗传操作及大规模的细胞和组织培养（在细胞水（在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养）色体或基因移植以及组织和细胞培养）等方法，从等方法，从而改良品种或创造新种、加速繁育生物个体、获得而改良品种或创造新种、加速繁育生物个体、获得有用物质的过程。有用物质的过程。细胞工程的意义细胞工程的意义为了得到高产优质的菌种，细胞融合技术为了得到高产优质的菌种，细胞融合技术是非常有效的手段；是非常有效的手段；利用动植物细胞培养技术可以生产保健食利用动植物细胞培养技术可以生产保健食品的重要成分以及特种食品香味和风味添品的重要成分以及特种食品香味和风味添加剂；加剂；在动植物的育种和植物、家畜品种的改良在动植物的育种和植物、家畜品种的改良中，细胞工程更是发挥了巨大的作用。中，细胞工程更是发挥了巨大的作用。细胞工程细胞工程细胞融合细胞融合细胞拆分细胞拆分细胞培养细胞培养繁殖生物学技术繁殖生物学技术抗体抗体F 细胞融合细胞融合利用自然或人工的方法使两个或几个不同利用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞胞融合融合为一个一个细胞，用于制造新的物种或品系及胞，用于制造新的物种或品系及产生生单克隆抗体等。克隆抗体等。F 细胞拆合细胞拆合细胞胞质工程，是通工程，是通过物理或化学方法将物理或化学方法将细胞胞质与与细胞核分开，再胞核分开，再进行不同行不同细胞胞间核核质的重新的重新组合，合，重建成新重建成新细胞。胞。F细胞培养细胞培养单个个细胞培养、胞培养、组织培养、器官培养培养、器官培养F 繁殖生物学技术繁殖生物学技术体外受精技体外受精技术、胚胎移植技、胚胎移植技术、家畜性、家畜性别决定、克隆决定、克隆动物物F 染色体工程染色体工程按照人按照人们的需要来添加或削减一种生物的染色的需要来添加或削减一种生物的染色体，或用体，或用别的生物的染色体来替的生物的染色体来替换。X-染色体（左），染色体（左）， Y-染色体（右）染色体（右）， 放大了约放大了约13,000倍；倍；人类染色体在显微镜下的样子人类染色体在显微镜下的样子 I1.2 细胞工程的主要技术领域细胞工程的主要技术领域F (一一)细胞融合技术细胞融合技术人人-鼠鼠细胞融合胞融合实验1970年，年，L.DavidFrye和和MichaelEdidin进行了人、鼠行了人、鼠细胞融合胞融合实验，令人信服地令人信服地证明膜蛋白的流明膜蛋白的流动动物细胞融合 所谓细胞融合是指用自然或人工的方法使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞融合的结果是一个细胞含有两个或多个细胞核，称为异核体；而少数异核体的来自不同细胞核的染色体在随后的有丝分裂中有可能合并到一个结合核内，成为合核体的杂种细胞。 细胞融合机理膜之膜之间彼此靠近彼此靠近克服静克服静电斥力和水合力斥力和水合力两两层膜膜连接接胞内物胞内物质接触、交接触、交换重重组融合完成融合完成F 细胞融合过程细胞融合过程原生质体的制备和再生原生质体的制备和再生诱导细胞使之发生融合诱导细胞使之发生融合筛选杂种细胞筛选杂种细胞杂种细胞的培养杂种细胞的培养F诱导细胞融合的主要方法诱导细胞融合的主要方法B病毒诱导细胞融合病毒诱导细胞融合B化学因子诱导的细胞融合化学因子诱导的细胞融合B电融合方法电融合方法仙台病毒仙台病毒1.病毒诱导细胞融合病毒诱导细胞融合1958年冈田善雄偶然发现已灭活的仙台病毒(HVJ，副黏液病毒的一种)可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合形成多核体细胞 缺点:病毒诱导愈合存在融合剂制备困难、融合率较低、不易重复的缺点。用用灭灭活活的的病病毒毒诱诱导导的的动动物物细细胞胞融融合合过过程程示示意意图图（HIV）爱滋病病毒）爱滋病病毒 所谓爱滋病（AIDS）是Acquired Immune Deficiency Syndrome的简称，即“后天免疫缺乏症候群” 爱滋病是由爱滋病毒所引起的，爱滋病毒又称为人类免疫缺乏病毒（Human Immunodeficiency Virus），简称HIV。2.化学因子诱导细胞融合化学因子诱导细胞融合-CH2CH2O-n1974年高国楠用聚乙二醇(PEG)成功诱导植物细胞融合，次年，Pontecorvo即用该法成功融合动物细胞。随后，Davison(1976)、 Fefter(1977)和Galfre(1977)等在方法上不断改进，PEG诱导融合便成为动物细胞融合的主要手段。 3.电融合方法电融合方法1979年，Senda等首先应用微电极，在显微镜下将112A、15S的电脉冲加至两相邻的植物原生质体使其发生融合。随后， Zimmermarm等又进一步采用加在平行电极板上的高压脉冲诱导植物原生质体、海胆卵、哺乳动物细胞及酵母菌等融合获得成功 平行电极法的主要操作过程先将从两种选定植物刚刚分离出来的原生质体以适当的溶液混合，插入电极，接通一定的交变电场；原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的串珠状；瞬间施以适当强度的电脉冲，使原生质体质膜被击穿而导致融合。亲本双方的细胞核和细胞质都融合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种几率很小。融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。一般亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的可能性就越大。融合细胞由双方的细胞质及一方核或再杂有少量他方染色体或DNA片段构成。原生质体融合后，两个细胞核尚未融合就过早地被新出现的细胞壁分开，以后它们将各自分裂生长成嵌合植株。融合处理后再生的细胞株可能出现以下几种表现：4.杂种细胞的筛选1由抗药性细胞组成的杂种细胞的筛选由抗药性细胞组成的杂种细胞的筛选2由营养缺陷突变型细胞组成的杂种细由营养缺陷突变型细胞组成的杂种细胞的筛选胞的筛选3由温度敏感突变型细胞组成的杂由温度敏感突变型细胞组成的杂种的筛选种的筛选HAT培养基HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)或氮丝氨酸(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的培养基。只有HGPRT+和TK+细胞才能利用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)来合成DNA而成活。相反， HGPRT和TK细胞不能利用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)来合成 DNA而死亡。因此，在HGPRT和TK细胞融合后，应用HAT培养基即可将通过基因互补而同时获得HGPRT和TK酶的杂种细胞筛选出来。F ( (二二) )细胞拆合细胞拆合把细胞核或细胞系与细胞质分离出来，把细胞核或细胞系与细胞质分离出来，然后把不同来源的细胞质和细胞质配合，然后把不同来源的细胞质和细胞质配合，形成杂交细胞。形成杂交细胞。包括细胞核移植和细胞器的移植包括细胞核移植和细胞器的移植细胞核移植细胞核移植细胞核移植是通过显微注射法将一个细胞细胞核移植是通过显微注射法将一个细胞核注入到动物的去核卵中，重构卵的发育、核注入到动物的去核卵中，重构卵的发育、生长，并成为完整个体生长，并成为完整个体用于动物比较多，在动物育种的应用方面用于动物比较多，在动物育种的应用方面发挥了很大的作用。发挥了很大的作用。细胞器的移植细胞器的移植细胞器的移植是将一个细胞的细胞器移到细胞器的移植是将一个细胞的细胞器移到另一个细胞中，借以改变细胞的某种特性，另一个细胞中，借以改变细胞的某种特性，以观察由不同来源的细胞器与细胞质重新以观察由不同来源的细胞器与细胞质重新组成的细胞所表现的功能发生什么变化组成的细胞所表现的功能发生什么变化把人类皮肤细胞核移植把人类皮肤细胞核移植到家兔的卵母细胞里到家兔的卵母细胞里 2001年年9月月7日，日，羊城晚报羊城晚报报道一条令科技界乃至整个社报道一条令科技界乃至整个社会瞩目的消息：中山医科大学陈系古教授等科研人员经过会瞩目的消息：中山医科大学陈系古教授等科研人员经过2000多多次实验，将人类皮肤细胞移植到家兔卵母细胞中，成功克隆出次实验，将人类皮肤细胞移植到家兔卵母细胞中，成功克隆出100多个人类胚胎。多个人类胚胎。 用皮肤细胞克隆用皮肤细胞克隆出人类胚胎出人类胚胎显微注射法显微注射法F5-2细胞培养细胞培养细胞培养概述一、培养细胞的生长条件二、细胞培养的设备条件三、细胞培养的基本操作技术四、培养细胞的生物学特征细胞培养定义：指将从机体取出的细胞在体外进行培养，使之继续生存或生长的方法，是目前医学生物学和药学研究领域普遍采用的基本技术生存：机体内有少部分细胞在体外只能生存不能生长生长：机体内大部分细胞在体外能生长概述细胞培养的优点能获取大量细胞细胞培养分裂次数细胞数万一万亿可获取纯种细胞：组织中有多种细胞共存，只有通过细胞培养，才能获取纯种细胞体外实验：可在体外进行试验，试验条件易于控制测试试验流程：用细胞培养筛选药物建立体外动物模型临床试验临床可应用各种先进科技手段进行研究细胞可无限期深低温保存，并随时可取用细胞培养的优点比动物实验快速价廉：如下例美国国立癌症研究所筛选药物：每种药物测试五种浓度，种不同肿瘤细胞进行测试，历时一周，花费美元。每星期可进行万次试验，筛选种药物（只有以细胞培养为基础才能做到）建立体外模型进行药物筛选：由于使用细胞培养技术筛选药物，大大提高了筛选效率。年代短短十年间，共有种药物被批准应用于抗肿瘤及相关病症的治疗，比以前余年中所有被批准的抗肿瘤药物总和还多细胞培养的优点可在体外作人类实验，无道义及法律问题 有很多药物对动物和人作用是不一样的，对动物有效的药物，对人体可能无效。对动物无副作用的药物，对人体可能有较大的毒副作用。细胞培养的优点2.1培养细胞的生长条件细胞的营养需要细胞的生存环境渗透压:温度:37，O2CO2:5%，CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.27.4无污染无毒培养基u培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； 多种金属离子； 激素；各种生长因子； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 胰酶抑制因子； 转移蛋白； 不明成分。 血 清一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10血清。对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。血清的作用无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。但是向无血清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。 无血清培养基血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌。血清的使用在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位-方便、广谱、稳定。抗菌素的使用基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升完全培养基的组成合成培养基（粉） 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至1000ml 过滤除菌，调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）。培养基的配制2.2细胞培养的设备条件无菌条件： 净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯， 电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器， 高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐实验室安全： 生物实验室安全，P1, P2, P3 实验室安全2.3细胞培养的基本操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)Termstoremember【细胞培养的污染和检测】细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。 严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法1. 细菌和真菌的污染和检测2.支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因有多种 1.支原体大小0.10.8m，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45m）；2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞、培养基、血清等。 相差显微镜观察法Hayflick培养基直接培养法DNA荧光染色法PCR方法特异引物扩增支原体DNA支原体的检测支原体污染后的抗生素处理支原体污染后的抗生素处理: 第一种方法：第一种方法：使用泰乐菌素（使用泰乐菌素（tylosin，Sigma)，泰乐菌素是一种兽用抗生素，泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。第二种方法：第二种方法：M-Plasmocin,InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。第三种方法：第三种方法：用用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：细胞传代同时加，效果很好，方法如下：细胞传代同时加BM-Cyclin-110 g/ml，37培养培养3天，加入天，加入BM-Cyclin-25 g/ml，37培养培养3天；天；（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，即可结束。否则加即可结束。否则加BM-Cyclin-120 g/ml，37培养培养3天，加入天，加入BM-Cyclin-210 g/ml，37培养培养3天。怀疑是支原体污染的就可以试试，对细胞不会有太天。怀疑是支原体污染的就可以试试，对细胞不会有太大影响。大影响。3. 病毒的污染和检测细胞的直接观察动物接种检查电子显微镜观察免疫学检查PCR技术2.4培养细胞的生物学特征（一）体外培养细胞的分型（一）体外培养细胞的分型1.贴附型：贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走细胞型游走细胞型多型细胞型多型细胞型2.悬浮型：悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 胞体呈梭型或不规则三角胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞时皆可称之为成纤维细胞。 成纤维细胞型：1.贴附型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2 23 3个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起细胞呈扁平不规则多角形，细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。皮等皆成上皮型形态。上皮型细胞：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源：来源于外胚层、内胚层细胞, , 如：如： 皮肤及其衍生物皮肤及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, , 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核形核 生长特点：易相连成片，相靠生长特点：易相连成片，相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 2. 悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)（二）培养细胞的生长和增殖过程（二）培养细胞的生长和增殖过程 1. 1. 培养细胞生命期（培养细胞生命期（Life Span of Culture CellsLife Span of Culture Cells）指细胞在整个离体培养过程中持续增殖和生长的时间，分为：原代培养期、传代期和衰退期。2. 2. 组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 原代培养（原代培养（Primary CulturePrimary Culture）期）期 初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系（Cell line）.在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）.为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 传代期传代期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。衰退期衰退期组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期（Latent Phase）; 指数增生期（Logarithmic growth Phase）; 停滞期（Stagnate Phase）.细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。 1潜伏期（潜伏期（LatentPhase）这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（细胞分裂指数（Mitotic IndexMitotic Index，MIMI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。 特点：特点：细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段；培养物中细胞数量呈指数增长，细胞群体均一，是理想的实验用细胞。 2指数增生期（指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。 3停滞期（停滞期（StagnatePhase）5-3抗体抗体的概念免疫球蛋白的分子结构和分类免疫球蛋白的分子片段抗体多样性的基因基础抗体的生理功能产生抗体的细胞抗体抗体抗体抗体(antibody，Ab)是机体在抗原物质的刺激下形成是机体在抗原物质的刺激下形成的一类能与抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球的一类能与抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白蛋白(immunoglobin，Ig)，由细胞合成并分泌。抗体，由细胞合成并分泌。抗体是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种免疫功能。免疫功能。主要存在于动物的血清、淋巴液、组织液及其它外分泌主要存在于动物的血清、淋巴液、组织液及其它外分泌液中，因此将抗体介导的免疫称为体液免疫。液中，因此将抗体介导的免疫称为体液免疫。有些抗体是以亲细胞性抗体存在于体内，这种形式的抗有些抗体是以亲细胞性抗体存在于体内，这种形式的抗体主要有体主要有g和和g，它们可结合于某些免疫细胞，它们可结合于某些免疫细胞表面。表面。此外，在成熟的淋巴细胞表面具有抗原受体，其本质也此外，在成熟的淋巴细胞表面具有抗原受体，其本质也是免疫球蛋白，称为膜表面免疫球蛋白。是免疫球蛋白，称为膜表面免疫球蛋白。3.1抗体的基本结构和分类抗体的基本结构和分类 免疫球蛋白分子是由两条相同的重链（ heavy chain ， H 链）和两条相同的轻链（ light chain ， L 链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 近对称轴的一对较长的链称为重链或链， 重链的分子量约为 5075kD ，由 450550 个氨基酸残基组成。 在对称轴较短的一对肽链称为轻链或链， 轻链的分子量约 25 kD ，由 214 个氨基酸残基构成。 IgG 分子由 3 个相同大小的节段组成，位于上端的两个臂由易弯曲的铰链区（ hinge region ）连接到主干上形成一个 “Y” 形分子，称为 Ig 分子的单体，这是构成免疫球蛋白分子的基本单位。 根据肽链中氨基酸顺序是否恒定，将链和链分别分为恒定区域 (C 区 ) 和可变区域区 (V 区 ) 。 Ig 的 V 区端是肽链的氨基末端（ N 端），另一端为羧基末端（ C 端），链上的 代表它的糖基。 Ig的类别、型别和血清型：的类别、型别和血清型：1类别类别：重链重链根据稳定区（CH）抗原性不同分成五类： 、和，相应的抗体分别为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。2亚类亚类：根据CH氨基酸组成和H链间二硫键数目的差异，IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 四个亚类；IgA和IgM也可分二个亚类：IgA1、IgA 2和IgM1、IgM2。3型别型别：轻链根据稳定区（CL）抗原性不同分成两型：型和型。4亚型亚型：型轻链根据稳定区个别氨基酸的不同分为四个亚型：14。5血清型血清型：包括同种型、同种异型、独特型。1、重链和轻链、重链和轻链IgM 、 IgD 、 IgG 、 IgA 和 IgE 相应的重链分别为 链、 链、 链、 链和 链。同一类 Ig ，根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别来划分不同的亚类。轻链可分为两型，即 型和 型，不同种属中，两型轻链的比例不同，正常人血清免疫球蛋白 : 约为 2 :1 ，而在小鼠则为 20 : 1 。 : 比例的异常可能反映了免疫系统的异常。 2、可变区和恒定区、可变区和恒定区不同的免疫球蛋白重链和轻链在靠近 N 端的约 110 个氨基酸的序列变化很大，称为可变区 variable region ， V 区。靠近 C 端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区 (constant region ， C 区 ) 。重链中可变区约占重链长度的 1/4 ，稳定区约占重链长度的 3/4 ；轻链中可变区和稳定区各为轻链长度的 1/2 左右。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab)。Y的柄部称结晶片段(crystalline fragment,FC)，糖结合在FC 上。 3、铰链区、铰链区铰链区富含脯氨酸，易伸展弯曲和蛋白酶水解。铰链区位于 CH1 与 CH2 之间，连接抗体的 Fab 段和 Fc 段，使两个 Fab 段易于移动和弯曲，从而可与不同距离的抗原部位结合。 IgM 、 IgD 、 IgG 、 IgA 、 IgE 和相应亚类的铰链区存在一定的差异，如 IgA 和 IgG1 、 IgG2 、 IgG4 的铰链区较短， IgG3 和 IgD 的铰链区较长， IgM 和 IgE 无铰链区。 4、免疫球蛋白的功能区（、免疫球蛋白的功能区（Thedomainofimmunoglobulin）由免疫球蛋白的肽链折叠而成的球形结构域称为功能区，每个功能区约由 110 个氨基酸组成，其氨基酸的序列具有相似性或同源性。因此，这些功能区的功能虽然不同，但其结构却具有较大的相似性。每个功能区的二级结构是由几股多肽链折叠一起形成的两个反向平行的 片层（ anti-parallel sheet ），两个 片中心的两个半胱氨酸残基由一个链内二硫键垂直连接，形成具有稳定功能区的作用 “ 桶状 ( barrel)” 或 “ 三明治 ( sandwich)” 的结构，免疫球蛋白肽链的这种独特的折叠方式称为免疫球蛋白折叠（ immunoglobulin folding ）。 3.23.2免疫球蛋白的水解片段（免疫球蛋白的水解片段（免疫球蛋白的水解片段（免疫球蛋白的水解片段（ ThehydrolyzedThehydrolyzedfragmentoffragmentofimmunglobulinimmunglobulin ） (1) 木瓜蛋白酶水解片段 木瓜蛋白酶（ papain ）水解 IgG 的部位是在铰链区二硫键连接的 2 条重链的近 N 端，裂解后可得到三个片段，其中两个片段相同： 2 个相同片段称为抗原结合片段（ fragment antigen binding ， Fab ），每个 Fab 段由一条完整的轻链和重链的 VH 和 CH1 功能区组成，相当于抗体分子的 2 个臂。 Fab 段为单价抗体，即能与抗原结合但不能形成凝集反应或沉淀反应； 1 个可结晶片段（ fragment crystallizable ， Fc ），相当于 IgG 的 CH2 和 CH3 功能区，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。 Fc 能介导抗体的很多生物学功能，因此， Ig 同种型的抗原性主要存在于 Fc 段。 (2) 、胃蛋白酶水解片段 胃蛋白酶（ pepsin ）在铰链区连接重链的二硫键近 C 端水解 IgG ，产生一个大片段和多条小分子多肽，见图 8-3 。大片段称为 F(ab) 2 片段，由于抗体分子的两个臂仍由二硫键连接，因此 F(ab) 2 片段为双价，与抗原结合可发生凝集反应和沉淀反应。 F(ab) 2 片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了 Fc 段抗原性可能引起的副作用，因而作为生物制品有较大的实际应用价值；若干小分子片段是由 Fc 段裂解而来，称为 pFc ，无生物学活性。 3.3抗体多样性的分子基础抗体多样性的分子基础抗体多样性的机制中指出有四个主要原因：编码抗体可变区的V基因片段数量相当大，它们与其他基因片段排列组合将构成一定的多样性。其次是由于轻链和重链可变区中，VJ或VDJ连接的随机性也使多样大大地增加。再加之在重链VDJ连接中，由于D基因片段连接点上点突变、插入或缺失使多样性又增加了数倍。第四个原因是体细胞DNA突变。3.4抗体的制备简述为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。 (一) 多克隆抗体第一代抗体第一代抗体在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是为多克隆抗体，也是第一代抗体第一代抗体。由于这种抗体。由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。得均一性抗体成为关注的问题。(二)单克隆抗体第二代抗体第二代抗体1975年德国学者年德国学者Kohler和英国学者和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（胞和经绵羊红细胞（sheepruebloodcell），），SRBC）免疫的）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。这种杂交瘤细胞既）。这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。它们是由识别一种抗原决定簇的细胞胞合成和分泌抗体的能力。它们是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体。克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体。这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体第二代抗体。(三)基因工程抗体第三代抗体第三代抗体基因工程抗体兴起于基因工程抗体兴起于8080年代早期。这一技术是年代早期。这一技术是将对将对Ig基因结构与功能的了解与基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对合，根据研究者的意图在基因水平对Ig分子进行切分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合后导入受体细胞割、拼接或修饰，甚至是人工全合后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。第三代抗体。基因工程抗体包括嵌合抗体、重构抗体、单链基因工程抗体包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单区抗体及抗体库等。其中以嵌合抗体研究抗体、单区抗体及抗体库等。其中以嵌合抗体研究的较多，也较成熟。单链抗体及单区抗体虽具有结的较多，也较成熟。单链抗体及单区抗体虽具有结构简单、分子小等优点但其临床应用的前景尚待证构简单、分子小等优点但其临床应用的前景尚待证实。实。5-4单克隆抗体单克隆抗体的概念单克隆抗体的制备过程制备单克隆抗体的注意事项单克隆抗体制备技术单克隆抗体医学上的应用单克隆抗体 （一）基本概念：（一）基本概念：1.多克隆抗体多克隆抗体：通常抗原如细菌、病毒、异种血清等具有多个抗原决定簇，可刺激机体多个具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些混合的由多种不同克隆B细胞产生的抗体称为多克隆抗体。用抗原免疫动物后获得的免疫血清均为多克隆抗体。2.单克隆抗体单克隆抗体：指由一株B淋巴细胞杂交瘤增生而成的单一克隆细胞产生的高度均一（其血清型完全一致）、只针对一种抗原决定簇的抗体。(二二)单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； （4）细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养； （6）杂交瘤细胞的筛选； （7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的鉴定； （9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立； （10）单克隆抗体的大量制备。单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 （1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 （2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。 单克隆抗体在医学中的应用 单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂，单抗可以充分发挥其优势。单抗的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下： 单克隆抗体的临床应用（1）临床疾病的诊断和治疗，如肿瘤的体内定位诊断和导向治疗。（2）增强免疫学实验的特异性和敏感性，克服交叉反应。（3）细胞表面抗原分子分布及功能的研究。（4）分离纯化抗原。 1.诊断各类病原体 这是单抗应用最多的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物感染的试剂等。单抗具有灵敏度高、特异性好的特点。尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 2.肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测 用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原（例如甲胎蛋白和癌胚抗原）的单抗早已用于临床检验。近年来，有人利用单抗进行肿瘤分型，对制定治疗方案和判断预后也有帮助。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗主要用于体内诊断，结合线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定位诊断。 3.检测淋巴细胞的表面标志 用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。例如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化和细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。对细胞表面抗原的检查在白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面也有指导作用。组织相容性抗原检查是移植免疫学的重要内容，而应用单抗对HLA进行位点检查与配型可得到更可信的结果。 4.机体微量成分的测定 应用单抗和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，如诸多酶类、激素、维生素、药物等；对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。上述应用的单抗属于鼠源性，作为体外诊断试剂是令人满意的。鼠源单抗如作为生物制剂应用于人体，则因是异种蛋白可引起过敏反应甚至危及生命。从临床治疗及预防疾病的要求，希望制备出人源性单抗。目前虽然已有文献报道，通过人-鼠细胞杂交及人-人细胞杂交进行了一些探索，但这些细胞株培养很不稳定，融合细胞中人的染色体往往呈选择性丢失，以致细胞株难以维持培养。因此制备人源单抗是目前急待解决的问题。 补充：干细胞补充：干细胞近几年，世界各国关于人类干细胞的研究骤然升近几年，世界各国关于人类干细胞的研究骤然升温，这与克隆技术的突破有关。温，这与克隆技术的突破有关。什么是干细胞呢？什么是干细胞呢？干细胞（干细胞（stemcell）是在生命的生长发育中起）是在生命的生长发育中起“主干主干”作用的原始细胞，它的神奇之处就是这些作用的原始细胞，它的神奇之处就是这些原始细胞具有自我更新、无限增殖扩容及多向分原始细胞具有自我更新、无限增殖扩容及多向分化的潜能。也就是说，这些细胞有可能长成各个化的潜能。也就是说，这些细胞有可能长成各个器官。器官。干细胞干细胞干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。另干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞细胞，具有再生各种具有再生各种组织组织器官和人体的潜在功能，医器官和人体的潜在功能，医学界称之为学界称之为“万用细胞万用细胞”。人体干细胞分两种类型：人体干细胞分两种类型：一种是全功能干细胞，可直接一种是全功能干细胞，可直接克隆克隆人体；人体；另一种是多功能干细胞，可直接复制各种脏器另一种是多功能干细胞，可直接复制各种脏器和修复组织。人类寄希望于利用于细胞的分离和修复组织。人类寄希望于利用于细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并最终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治终通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。疗。干细胞分类干细胞分类目前，通常将干细胞分为目前，通常将干细胞分为全能干细胞全能干细胞（如胚胎（如胚胎干细胞可以分化形成所有的成体组织细胞，甚干细胞可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体）、至发育成为完整的个体）、多能干细胞多能干细胞（具有（具有多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，如造血干细胞、神经干胞外的其他组织细胞，如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）和细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）和专能专能干细胞干细胞（维持某一特定组织细胞的自我更新，（维持某一特定组织细胞的自我更新，如肠上皮干细胞）。胚胎干细胞的分化和增殖如肠上皮干细胞）。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体；成体干细胞的进为具有各种组织器官的个体；成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。生的基础。造血干细胞造血干细胞造血干细胞是能自我更新、有较强分化发育和再造血干细胞是能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。造血干细胞来源于红骨髓，可以经血流迁移到外造血干细胞来源于红骨髓，可以经血流迁移到外周血液循环中，不会因献血和捐献造血干细胞而周血液循环中，不会因献血和捐献造血干细胞而损坏造血功能。损坏造血功能。正常人的造血干正常人的造血干细胞通胞通过静脉静脉输注到患者体内，注到患者体内，重建患者的造血功能和免疫功能，达到治重建患者的造血功能和免疫功能，达到治疗某些某些疾病的目的，此一疾病的目的，此一过程称程称为造血干造血干细胞移植。胞移植。核移植是将不同发育时期的胚胎或成体核移植是将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，利用显微手术和细胞融动物的细胞核，利用显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。成胚胎并使之发育成熟的过程。5-5细胞工程的应用细胞工程的应用动物细胞工程的应用动物细胞工程的应用克隆青蛙克隆青蛙1938年：德国科学家首次提出克隆设想。年：德国科学家首次提出克隆设想。1952年：科学家开始用青蛙克隆实验。年：科学家开始用青蛙克隆实验。1970年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，但是在开始进食以后死亡。但是在开始进食以后死亡。1981年：科学家进行克隆鼠实验，据称，用鼠胚胎细胞培年：科学家进行克隆鼠实验，据称，用鼠胚胎细胞培育出了发育正常的鼠。育出了发育正常的鼠。细胞工程的应用细胞工程的应用细胞工程作为科学研究的一种手段，已经细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。献。1.粮食与蔬菜生产粮食与蔬菜生产利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。我国在这一领人类受益最多的一个方面。我国在这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种或品系有近百种途径，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有个，小麦有30个左右。其中河南省农科院个左右。其中河南省农科院培育的小麦新品种，具有抗倒伏、抗锈病、培育的小麦新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。抗白粉病等优良性状。2.园林花卉园林花卉在果树、林木生产实践中应用细胞工程技在果树、林木生产实践中应用细胞工程技术主要是微繁殖和去病毒技术。术主要是微繁殖和去病毒技术。近年来，对经济林木组织培养技术的研究近年来，对经济林木组织培养技术的研究也受到很大的重视。也受到很大的重视。植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。革命性的变化。3.临床医学与药物临床医学与药物自自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克星。星。近年来，应用单克隆抗体可以检查出某些近年来，应用单克隆抗体可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积，这为有效的治疗提肌梗死的部位和面积，这为有效的治疗提供方便。供方便。4.繁育优良品种繁育优良品种目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。精液和胚胎的液氮超低温用于畜牧业生产。精液和胚胎的液氮超低温（-196摄氏度）保存技术的综合使用，使优摄氏度）保存技术的综合使用，使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，并且突破了动物交配的季节限制。另外，可并且突破了动物交配的季节限制。另外，可以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，在体外受精，然后再将人工控制的新型受精在体外受精，然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良新个体。新个体。第六章 发酵工程6-1发酵工程发酵工程概况概况6-2微生物工业菌种与微生物工业菌种与培养基培养基6-3发酵操作方法与发酵操作方法与工艺控制工艺控制6-4发酵产物的发酵产物的下游加工过程下游加工过程6-5发酵工程的发酵工程的应用应用6-6代谢调控和代谢工程代谢调控和代谢工程6-5发酵与产物分离偶联发酵与产物分离偶联6-1 发酵工程概况发酵工程的定义发酵工程反应过程的特点发酵工程的内容和发展1.1发酵工程的定义发酵：利用微生物在有氧和无养条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程发酵工程：发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。发酵产品：人干扰素、乙肝疫苗、心活素、红细胞生成素、血凝因子、青霉素酰化酶、成纤维细胞生长因子等等1.2发酵工程反应过程的特点a.反应条件温和b.原料来源广泛:原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源(植物秸秆、木屑等)，微生物本身能有选择地摄取所需物质。 c.反应以生命体的自动调节方式进行，若干个反应过程能够像单一反应一样，在单一反应器内很容易地进行d.发酵产品多为小分子，但能很容易的生产出复杂的高分子化合物e.高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的反应f.发酵液一般对生物体无害g.易发生杂菌污染h.通过菌种改良，可以利用原有设备较大幅度的提高生产水平需注意的一些问题1.副产物的产生，造成提取和精制的困难2.活细胞的反应，细胞容易发生变异，影响反应物的生成率，不易控制3准备工作量大，花费高4.底物浓度不能过高，要使用较大反应器5.废水具有较高的BOD/COD(水质生物耗氧量和化学需氧量）,需进行处理1.3发酵工程的研究内容内容：生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精致等过程有价值的发酵产物：微生物菌体本身；菌体代谢产物；菌体或酶系实现生物转化得到的产物发酵工程的内容发酵工程的内容是随着科学技术的发展而不断扩大和充实的。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。其主要内容包括生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。目前已具有生产价值的发酵类型有微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物的转化发酵和生物工程细胞的发酵五种。(一)微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得具有某种用途菌体为目的的发酵。比较传统的菌体发酵工业，有用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵两种类型。新的菌体发酵可用来生产一些药用真菌，如香菇类、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共生的密环菌以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子真菌的灵芝等药用菌。这些药用真菌可以通过发酵培养的手段来生产出与天然产品具有同等疗效的产物。有的微生物菌体还可用做生物防治剂，如苏云金杆菌、蜡样芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌，其细胞中的伴孢晶体可毒杀鳞翅目、双翅目的害虫。丝状真菌的白僵菌、绿僵菌可防治松毛虫等。所以，某些微生物的剂型产品，可制成新型的微生物杀虫剂，应用于农业生产中。因此，菌体发酵工业还包括微生物杀虫剂的发酵。(二)微生物酶发酵酶普遍存在于动物、植物和微生物中。最初，人们都酶普遍存在于动物、植物和微生物中。最初，人们都是从动物、植物的组织中提取酶，但现在，工业应用是从动物、植物的组织中提取酶，但现在，工业应用的酶大多来自微生物发酵。的酶大多来自微生物发酵。微生物酶制剂微生物酶制剂有广泛的用途。食品和轻工业中常用到有广泛的用途。食品和轻工业中常用到微生物酶制剂，如微生物生产的微生物酶制剂，如微生物生产的淀粉酶和糖化酶淀粉酶和糖化酶用于用于生产葡萄糖，氨基酰化酶拆分氨基酸等。酶也用于生产葡萄糖，氨基酰化酶拆分氨基酸等。酶也用于医医药生产和医疗检测药生产和医疗检测中，如青霉素酰化酶用来生产半合中，如青霉素酰化酶用来生产半合成青霉素所用的中间体成青霉素所用的中间体6氨基青霉烷酸，氨基青霉烷酸，胆固醇氧胆固醇氧化酶化酶用于检查血清中胆固醇的含量，用于检查血清中胆固醇的含量，葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶用用于检查血中葡萄糖的含量等，于检查血中葡萄糖的含量等，角蛋白酶角蛋白酶(keratinase)有助于伤口去痂和上皮再生，角蛋白酶还用于皮革脱有助于伤口去痂和上皮再生，角蛋白酶还用于皮革脱毛鞣制、配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容毛鞣制、配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。因此角蛋白酶是外科手术后刀口缝合不留痂、烧品。因此角蛋白酶是外科手术后刀口缝合不留痂、烧伤病人上皮再生的特效药，也是皮革鞣制和美容美发伤病人上皮再生的特效药，也是皮革鞣制和美容美发的主要生化原材料等。的主要生化原材料等。(三)微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多，已知的有37个大类下表，其中16类属于药物。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，因而称为次级代谢产物。1致酸剂致酸剂2生物碱生物碱3氨基酸氨基酸4动物生长促动物生长促进剂进剂5抗生素抗生素6驱虫剂驱虫剂7抗代谢剂抗代谢剂8抗氧剂抗氧剂9抗肿瘤剂抗肿瘤剂10抑制球虫抑制球虫剂剂11辅酶辅酶12转化甾醇转化甾醇和甾体和甾体13乳化剂乳化剂14酶酶15酶抑制剂酶抑制剂16脂肪酸脂肪酸17鲜味增强鲜味增强剂剂18除草剂除草剂19杀虫剂杀虫剂20离子载体离子载体21铁运载因铁运载因子子22脂类脂类23核酸核酸24核苷核苷25核苷酸核苷酸26有机酸有机酸27灭害剂灭害剂28药理活性药理活性物质物质29色素色素30植物生长植物生长促进剂促进剂31多糖类多糖类32蛋白质蛋白质33溶媒溶媒34发酵剂发酵剂35糖糖36表面活性表面活性剂剂37维生素维生素(四)微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。(五)生物工程细胞的发酵生物工程细胞的发酵是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的工程菌(engineering strain)、细胞融合所得的杂交细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。6-2 微生物工业菌种与培养基真核生物：细胞含有具体的细胞核，细胞核有核膜、核仁和染色体，如原生动物、单细胞藻类、真菌等。原核生物：细胞含有不具体的细胞核，细胞核没有核膜、核仁，遗传物质(DNA)不组成典型的染色体，如细菌和立克次氏蓝绿藻类。非细胞微生物：病毒如噬菌体发酵工业对菌种的要求a.原料廉价、生长迅速、代谢产物产量高b.培养条件易于控制，所需酶活力高c.发酵周期短，生长速度和反应速度快d.菌株选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株e.菌株抗噬菌体能力强f.菌种性能稳定，不宜变异退化g.菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素工业常用的微生物菌种2.1细菌2.1.1形态和大小 球状、杆状和螺旋状 110-10110-9mg2.1.2 属原核生物 包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核质体等 特殊结构：鞭毛、荚膜和芽孢2.1.3 细菌的繁殖方式裂殖方式(二分裂)细胞生长时，单环DNA染色质体被复制，细胞内的蛋白质等组成同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横断间隔，染色质体分开，继而间隔分裂形成细胞壁，最后形成两个相同的子细胞。 芽孢：某些细菌在其生活史的一定阶段，于营养细胞内形成的一个内生孢子一般湿热灭菌以杀死在自然界中抗热性最强的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢为标准， 规定在121 灭菌15分钟2.1.4发酵工业常用的细菌 大肠杆菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌等2.2 放线菌2.2.1 形态及构造菌落呈放射状属于原核生物由菌丝体构成，菌丝体包括基内菌丝体（营养菌丝体）和气生菌丝体 气生菌丝体发育到一定阶段形成孢子丝，然后形成孢子2.2.2 放线菌的繁殖 无性孢子进行繁殖，也可借菌丝断裂的片断繁殖成新的菌体 其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，称为菌丝体(mycelium)。 2.2.3 放线菌在微生物中的分类及地位 介于细菌和丝状真菌之间，在微生物分类位置上属于细菌2.2.4 发酵工业常用的放线菌主要用于生产抗生素(90%)：龟裂酶素：土霉素金霉素链霉菌：四环素红霉素链霉菌：红霉素其中小单胞菌属产抗生素最多另外放线菌还可产生酶和维生素常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属(Streptomyces)小单孢菌属(Micromonospora)诺卡氏菌属(Nocardia) 2.3酵母2.3.1 酵母的形态大小属真菌类单细胞出芽方式进行无性繁殖母细胞体积长大到一定程度就开始发芽，芽长大的同时母细胞缩小，在母细胞与子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的母细胞与子细胞。如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。 形态：球形、椭圆形、卵圆形、柠檬形、腊肠形和菌丝状等大小：发酵工业用酵母一般 46m2.3.2 酵母的细胞结构真核细胞典型的细胞结构2.3.3 酵母的繁殖方式无性繁殖：芽殖和裂殖，酵母的主要繁殖方式有性繁殖：产生子囊和子囊孢子2.3.4 工业上常用的酵母啤酒酵母卡尔斯伯酵母啤酒酵母椭圆变种德巴利氏酵母属汉逊氏酵母毕赤氏酵母属假丝酵母属丝酶母属工业主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶，以及生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。 2.4 霉菌2.4.1 形态及构造凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌(mold)。 属于真菌，亦称丝状真菌营养体由菌丝构成菌丝：无横膈，整个菌丝是一个单细胞，含多个细胞核；有横膈每一段就是一个细胞2.4.2 酶菌的繁殖及生活史通过孢子繁殖,通过无性和有性方式形成孢子其生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。 2.4.3 工业常用霉菌藻状菌纲：根酶、毛酶、犁头酶子囊菌纲：红曲霉半知菌类：曲霉、青酶2.5 噬菌体2.5.1特点、形态和化学成分形态：有头尾之分化学成分：核酸和蛋白质占粒子质量90%以上，其中核酸40-50%特点 形态微小，体积比细菌小的多 为非细胞类型，属于病毒对寄主细胞有严格的专一性2.5.2 生长和繁殖吸附：尾部吸附侵入侵入增值成熟释放2.5.3噬菌体的防治杜绝噬菌体生存增殖的环境条件选育和使用抗噬菌体菌株菌种轮换使用2.5.4其他微生物1担子菌所谓的担子菌(basidial germ)就是人们通常所说的菇类微生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。2藻类藻类(algae)是自然界分布极广的一大群自养微生物资源，许多国家已把它用做人类保健食品和饲料。3.生物工程菌应用基因工程技术，按照人的设计对基因或基因的部分进行定向重组所构建的能够在特定的受体细胞中进行表达的重组微生物菌株，称为生物工程菌(bioengineering strain)。如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。3.培养基的制备3.1培养基的营养成分及来源1.碳源：供给微生物生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的物质基础2.氮源：构成微生物细胞中蛋白质和核酸的主要元素3.无机盐和微量元素：参与细胞结构物质的组成，作为酶活性中心的组成部分或维持酶的活性，调节渗透压、PH值等4.生长因子：提供微生物细胞所需要的化学物质、辅助因子的组分和参与代谢的物质5.水6.产物形成的诱导物、前体和促进剂 1碳源碳源是构成菌体和产物的碳架及能量来源。常用的碳源包括各种能迅速利用的单糖(如葡萄糖、果糖)、双糖(如蔗糖、麦芽糖)和缓慢利用的淀粉、纤维素等多糖。多糖要经菌体分泌的水解酶分解成单糖后才能参与微生物的代谢。玉米淀粉及其水解液是抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制剂等发酵中常用的碳源。马铃薯、小麦、燕麦淀粉等用于有机酸、醇等的生产中。霉菌和放线菌还可以利用油脂作碳源，在发酵过程中加入的油脂有消泡和补充碳源的双重作用。某些有机酸、醇在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、麦角碱和某些抗生素的发酵生产中也可作为碳源使用(有的是作补充碳源)。此外，许多石油产品(碳氢化合物)作为微生物发酵的主要原材料正在深入研究和推广之中，如用正十六烷作碳源发酵生产谷氨酸。 2氮源凡是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质，称为氮源。它是微生物发酵中使用的主要原料之一。常用的氮源包括有机氮源和无机氮源两大类。黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等是有机氮源，无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。3无机盐和微量元素微生物的生长、繁殖和产物形成需要各种无机盐类(如磷酸盐、硫酸盐、氯化钠、氯化钾等)、微量元素(如镁、铁、钴、锌、锰等)。其生理功能包括构成菌体原生质的成分(磷、硫等)，作为酶的组成成分或维持酶的活性(镁、铁、锰、锌、钴等)，调节细胞的渗透压和影响细胞膜的透性(氯化钠、氯化钾等)，参与产物的生物合成等。微生物对微量元素的需要是极微的，一般有01mgL的浓度就可以满足要求。4生长因子生长因子是一类微生物维持正常生活不可缺少，但细胞自身不能合成的某些微量有机化合物，包括维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。大多数维生素是辅酶的组成结构，没有它们，酶就无法发挥作用。其需要量甚微，一般150g/L，甚至更低。各种微生物对外源氨基酸的需要是不相同的，取决于它们自身合成氨基酸的能力。凡是微生物自身不能合成的氨基酸，一般需以游离氨基酸或小分子肽的形式供应。而嘌呤、嘧啶及其衍生物的主要功能是构成核酸和辅酶。5水水是培养基的主要组成成分。它既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质；而且，它还直接参与许多代谢反应。由于水是许多化学物质的良好溶剂，不同的水，如深井水、自来水、地表水所溶解的物质可能不同，这些物质将对发酵产生影响，因此水的质和量对微生物的生长繁殖和产物合成有着很重要的作用。生产中使用的水有深井水、自来水和地表水。6产物形成的诱导物、前体和促进剂许多胞外酶的合成需要适当的诱导物存在。而前体是指被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质，如合成青霉素G的苯乙酸、合成红霉素的丙酸等。当前体物质的合成是产物合成的限制因素时，添加前体能增加这些产物的产量，并在某种程度上控制生物合成的方向。在有些发酵过程中，添加某些促进剂能刺激菌株的生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。如四环素发酵中加入溴化钠和M促进剂,能抑制金霉素的生物合成,同时增加四环素产量。3.2 培养基的类型2.2.1 根据营养基来源划分天然培养基合成培养基综合培养基2.2.2 根据培养基原物质状态液体培养基固体培养基2.2.3 根据培养基的用途划分基础培养基鉴别培养基增殖培养基：加入额外的营养物质，促进某一类菌生长选择培养基：加入某种具杀菌作用的物质活体培养基：活的动植物体或离体的生活细胞2.2.4依据其在生产中的用途，可将培养基分成孢子培养基种子培养基发酵培养基3.3 发酵培养基的选择基本原则提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分有利于减少培养基原料的消耗，增加产率有利于提高培养基和产物的浓度有利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期减少副产物的形成原料价格低廉，质量稳定有利于提高氧的利用率，降低成本能耗有利于产品的分离纯化，减少三废的出现3.4发酵的一般过程生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。典型的发酵过程如图4一l所示。以下以霉菌发酵为例加以说明。3.4.1菌种在进行发酵生产之前，首先必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经分离、纯化及选育后或是经基因工程改造后的工程菌，才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，筛选出高产量和高质量的优良菌株。筛选菌种的具体步骤可分为采样、富集与分离、筛选、发酵与性能测定等几个步骤。1.产生特殊物质的微生物筛选抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等以不同程度地广泛应用于抗生素的筛选。等以不同程度地广泛应用于抗生素的筛选。在这些方法中，在这些方法中，试验菌试验菌的选择十分重要，它的选择十分重要，它直接关系到检出的灵敏度和筛选出的抗生素直接关系到检出的灵敏度和筛选出的抗生素和活性和抗菌谱。和活性和抗菌谱。除了使用高敏感的试验菌以外，采用除了使用高敏感的试验菌以外，采用专一性专一性很高的筛选技术很高的筛选技术也可检出新的抗生素。也可检出新的抗生素。1抗生素产生菌的筛选2抗肿瘤药物产生菌的筛选 生化诱导分析法生化诱导分析法(BIA)(BIA)该法又称为该法又称为诱诱导检测法导检测法(Inductest)。SOSSOS生色检测法生色检测法(SOS (SOS ChromotestChromotest) )同同样，也可以样，也可以利用利用DNA修复能力变异株修复能力变异株进行抗肿瘤药物的筛选进行抗肿瘤药物的筛选。3免疫激活剂产生菌的筛选一般认为能作用于细胞表面酶的物质可一般认为能作用于细胞表面酶的物质可能具有免疫修饰作用，因此以存在于细能具有免疫修饰作用，因此以存在于细胞表面的胞表面的氨基肽酶氨基肽酶B、白氨酸氨基肽酶、白氨酸氨基肽酶、氨基肽酶氨基肽酶A、碱性磷酸酯酶为靶性、碱性磷酸酯酶为靶性物质，物质，研究了这些酶的抑制剂，发现抑制这些研究了这些酶的抑制剂，发现抑制这些酶会增强细胞性免疫或抗体产生能力。酶会增强细胞性免疫或抗体产生能力。因此，可以用细胞表面酶的抑制法筛选因此，可以用细胞表面酶的抑制法筛选免疫激活剂的产生菌。免疫激活剂的产生菌。4酶产生菌的筛选 特定酶产生菌的筛选方法主要是依靠特定酶产生菌的筛选方法主要是依靠酶催化的反应性酶催化的反应性质质和和作用的底物作用的底物特异性、特异性、底物和产物的特性底物和产物的特性及及酶在细酶在细胞中所处的位置胞中所处的位置进行设计。进行设计。对于许多分泌在对于许多分泌在细胞外的水解酶细胞外的水解酶，常常使待检测的微，常常使待检测的微生物在含有酶作用的生物在含有酶作用的不溶性底物不溶性底物，如淀粉、纤维素、，如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等培养基中生长，培养后，根据菌落周酪素、细胞壁等培养基中生长，培养后，根据菌落周围产生的围产生的透明圈透明圈的大小可以筛选到产淀粉酶、纤维素的大小可以筛选到产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、溶菌酶等的高活性菌株。也可以根据酶酶、蛋白酶、溶菌酶等的高活性菌株。也可以根据酶催化反应产酸或碱，在培养基中加入底物和酸碱催化反应产酸或碱，在培养基中加入底物和酸碱pH指示剂指示剂，培养后，菌体生长产酶使底物分解，依据菌，培养后，菌体生长产酶使底物分解，依据菌落周围的变色圈的大小和颜色深浅进行判断，筛选到落周围的变色圈的大小和颜色深浅进行判断，筛选到产目标酶微生物。产目标酶微生物。5自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。的过程称为自然选育。自然突变一般有两种原因，自然突变一般有两种原因，一是在自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种短一是在自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢产生的波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用，引起的突变；诱变物质的作用，引起的突变；另一种是四种碱基：胸腺嘧啶另一种是四种碱基：胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤和鸟嘌呤(G)的六位的六位酮基的烯醇式互变异构和胞嘧啶酮基的烯醇式互变异构和胞嘧啶(C)和腺嘌呤和腺嘌呤(A)的六的六位氨基的亚氨式互变异构作用，在位氨基的亚氨式互变异构作用，在DNA复制过程中，复制过程中，如果瞬间的互变异构，将使本应为如果瞬间的互变异构，将使本应为AT和和GC碱基对为碱基对为主的正确复制发生错误。主的正确复制发生错误。6诱变育种 1诱变育种的基本方法诱变育种的基本方法诱变育种是人为的利用物理化学等因素，使诱变的细诱变育种是人为的利用物理化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变的某一部位发生改变(又又称点突变称点突变)，从而使微生物的遗传物质，从而使微生物的遗传物质DNA和和RNA的的化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。诱变处理的方法有诱变处理的方法有单一诱变剂单一诱变剂处理和处理和复复合处理合处理。诱变处理后，应及时地在较诱变处理后，应及时地在较丰富丰富的培养的培养基上进行后基上进行后培养培养，以稳定变异，获得高，以稳定变异，获得高的突变频率。的突变频率。营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选营养缺陷型的菌株因具有显著的遗传标记，在杂交育营养缺陷型的菌株因具有显著的遗传标记，在杂交育种中有利于对杂交重组的分析。另外，营养缺陷型菌种中有利于对杂交重组的分析。另外，营养缺陷型菌株因基因突变致使某一合成途径中断，丧失合成其生株因基因突变致使某一合成途径中断，丧失合成其生长中必需的某种物质的能力，使末端产物减少，解除长中必需的某种物质的能力，使末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈抑制或调节，可使代谢途径中了末端产物参与的反馈抑制或调节，可使代谢途径中的某一中间产物过量积累；也可使分枝代谢的中间产的某一中间产物过量积累；也可使分枝代谢的中间产物和另一分枝途径中的末端产物积累。物和另一分枝途径中的末端产物积累。营养缺陷型的检出只能达到是某一类营养缺陷，如氨营养缺陷型的检出只能达到是某一类营养缺陷，如氨基酸类、维生素类、碱基类。还需进一步的具体的鉴基酸类、维生素类、碱基类。还需进一步的具体的鉴定是什么氨基酸、维生素和碱基，这就是营养缺陷型定是什么氨基酸、维生素和碱基，这就是营养缺陷型的鉴定。一般采用生长谱法确定，即营养组合纸片法，的鉴定。一般采用生长谱法确定，即营养组合纸片法，观察在培养基观察在培养基(一一)上的生长情况，加以确定。上的生长情况，加以确定。营养缺陷型有可能是单缺陷型或双缺陷型。一般单缺营养缺陷型有可能是单缺陷型或双缺陷型。一般单缺陷型的稳定性较差，易发生回复突变，而双缺陷型的陷型的稳定性较差，易发生回复突变，而双缺陷型的回复突变的机率较小。回复突变的机率较小。在生物合成途径中普遍存在末端产物的在生物合成途径中普遍存在末端产物的反馈抑制调节，在发酵过程中为了获得反馈抑制调节，在发酵过程中为了获得高产，采用降低末端产物浓度或除去阻高产，采用降低末端产物浓度或除去阻遏物一样比较困难，而较有效的方法是遏物一样比较困难，而较有效的方法是选育对末端产物有抗反馈的突变株。选育对末端产物有抗反馈的突变株。通常抗反馈突变株是用通常抗反馈突变株是用添加末端产物类添加末端产物类似物或结构类似物似物或结构类似物的方法筛选。的方法筛选。抗反馈抑制变异株的筛选抗反馈抑制变异株的筛选抗分解代谢阻遏突变株的筛选从遗传学角度考虑，调节基因发生突变从遗传学角度考虑，调节基因发生突变会使阻遏蛋白失活，不能与分解代谢末会使阻遏蛋白失活，不能与分解代谢末端产物结合，或因操纵基因发生突变不端产物结合，或因操纵基因发生突变不能与阻遏蛋白结合，均会使分解代谢受能与阻遏蛋白结合，均会使分解代谢受到阻遏。从而获得抗分解代谢阻遏的突到阻遏。从而获得抗分解代谢阻遏的突变株。由此可导致相应的酶及生物合成变株。由此可导致相应的酶及生物合成产物的积累。产物的积累。抗性突变株的筛选这包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的这包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性突变株的筛选。可以根据具体的抗性要求选抗性突变株的筛选。可以根据具体的抗性要求选择不同的筛选条件和方法，获得所需的突变株，择不同的筛选条件和方法，获得所需的突变株，并应用于某些产物的生产。并应用于某些产物的生产。3 .4.2菌种的扩大培养目的：为生产提供相当数量的代谢旺盛的种子，以缩短发酵周期，提高发酵罐利用率，有利于减少杂菌污染的机会。对种子要求：纯、壮、活力旺盛、接种数量足够3.4.3发酵发酵发酵(fermentation)是微生物合成大量是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。它是在无菌状态下进行纯种培养的节。它是在无菌状态下进行纯种培养的过程。因此，所用的培养基和培养设备过程。因此，所用的培养基和培养设备都必须经过灭菌，通入的空气或中途的都必须经过灭菌，通入的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。菌接种技术。3.5.1种子扩大培养阶段液体培养法：液体试管、三角瓶摇床震荡或回旋培养。通气量大小可控。表面培养法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盘培养固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶和培养皿等3.5工业微生物菌种培养的类型3.5.2大规模生产阶段：浅盘固体培养、深层固体培养、浅盘液体培养、深层液体通气培养固体培养培养基原料：小麦麸皮等设备：较浅的曲盘、较深的大池、能旋转的转鼓和通风曲槽等特点：设备简单，生产成本低，产量较高，耗费劳动力较多，占地面积达，PH、溶解氧、温度等不易控制，易污染，生产规模难以扩大液体培养按是否需氧静置培养：厌氧菌发酵通气培养：好氧菌发酵按培养罐类型浅盘培养：没有通气搅拌设备，劳动强度大，生产效率低，易污染液体深层培养：发酵罐内进行，发酵罐内有搅拌器，通入空气。大型发酵罐的发酵一般也分几级，进行多级培养，谷氨酸发酵二级培养，青霉素和链霉素等需三级培养第三节 发酵操作方法和工艺控制1.发酵操作方法2影响发酵的主要因素3.发酵设备1.发酵操作方法发酵的一些指标：底物转化成产品的比率：控制原料对产品成本影响产率：单位时间，单位体积生产的成品半成品数量发酵产物浓度：确定下一步提取和精制方法及费用残留底物量：实际转化率，防止杂菌1.1 分批发酵又称间歇发酵法。在一个密闭系统内一次性加入营养物和菌种进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外界没有物料交换。全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、培养的诱导期、发酵过程、放罐和洗罐，所需时间的总和为一个发酵周期。 迟滞期 (1ag phase) ：细胞不分裂（不生长），但细胞变大，细胞内RNA含量增高，原生质呈碱性，合成代谢活跃，易合成新的诱导酶，对外界环境变化敏感。接种物中死细胞较多或培养基不丰富时延滞期较长。指数生长期 ：细胞分裂（生长）最快，细胞进行平衡生长，酶系活跃，代谢旺盛。生长速率由营养成分和培养条件决定。静止期或 稳定期： 新繁殖的细胞与死亡细胞数目相等，菌体产量达到最高，细胞开始储藏糖原、脂肪等储藏物，产芽孢的开始形成芽孢，开始合成次生代谢产物。可能由于营养物的消耗或抑制生长的代谢产物积累，细胞停止增殖，但仍存活。 衰亡期： 死亡细胞数目超过新生细胞，细胞形态多样，细胞开始自溶，开始释放次生代谢产物。 分批发酵过程微生物的生长可分为四个不同的阶段1.2 连续发酵法向发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液以相同的速度连续放出，从而使发酵液中的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。优点：提高设备利用率、原料利用率和便于实现自动化缺点：1）开放系统，容易杂菌污染 2）对设备、仪器要求高优点：可以维持稳定的操作条件，有剩予微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时；由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿囱_得以延长；容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。缺点：由于是开放系统，加上发酵周期长。容易造成杂菌污染；在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异；对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高；黏性丝状菌菌体容易附着在器壁土生长和发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。 1.3 补料分批发酵法指在分批培养过程中，间歇的或连续的补加新鲜培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的培养方法。又称半连续发酵，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方法。优点：1）与连续发酵相比,不需要严格的无菌条件，不会产生菌种老化和变异问题，以及适用范围广 2）与分批发酵比较：可以解除底物的抑制，产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏根据流加方式不同，分为单一补料反复补料分批发酵：发酵过程中每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，直至发酵产率明显下降。目前应用十分广泛，面包酵母、氨基酸、抗生素、单细胞蛋白质等发酵工业1.4 固体发酵某些微生物生长需水很少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产，称为固体发酵(solid fermentation)。我国传统的酿酒、制酱及天培(大豆发酵食品)的生产等均为固体发酵。另外，固体发酵还用于蘑菇的生产、奶酪和泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等 例 子原 料所用微生物蘑菇生产泡菜酱油大豆发酵食品千酪堆肥花生饼素金属浸提有机酸酶污水处理麦秆、粪肥结球甘蓝等大豆、小麦大豆凝乳混合有机材料花生饼低级矿石蔗糖、废糖蜜麦麸等污水成分双孢蘑菇、埃杜香菇等乳酸菌米曲霉寡孢根霉娄格法尔特氏青霉真菌、细菌、放线菌嗜食链孢霉硫芽孢杆菌黑曲霉黑曲霉细菌、真菌和原生动物固体发酵一般都是开放式，因而不是纯培养，无菌要求不高，它的一般过程为：将原料预加工后再经蒸煮灭菌，然后制成含一定水分的固体物料，接入预先培养好的菌种，进行发酵。发酵成熟后要适时出料，并进行适当处理，或进行产物的提取。根据培养基的厚薄可分为薄层发酵和厚层发酵，用到的设备有帘子、曲盘和曲箱等。薄层固体发酵是利用木盘或苇帘，在上面铺12锄厚的物料，接种后在曲室内进行发酵；厚层固体发酵是利用深槽(或池)，在其上部架设竹帘，帘上铺厚30 cm以上的物料，接种后在深槽下部给以通气进行发酵。2.影响发酵的主要因素影响发酵的主要因素营养物质的浓度、种类、比例溶解氧浓度氧化还原电位CO2发酵液黏度温度pH值泡沫酶和代谢产物此外，还包括菌体浓度、生长速率、死亡速率、细胞状态等生物学因素。 通风和搅拌：可以生长和最适生长氧浓度染菌的控制：1）设备、管道、阀门漏损 2）设备及管道灭菌不彻底存在死角 3）空气净化不彻底 4）菌种不纯或培养基灭菌不彻底 5）无菌操作不严格，生产操作出错物理、工程参数物理、工程参数参数名称参数名称单位单位检测方法检测方法意义、主要作用意义、主要作用温度温度罐压罐压空气流量空气流量搅拌转速搅拌转速搅拌功率搅拌功率黏度黏度密度密度装量装量浊度浊度泡沫泡沫传质系数传质系数KLa加糖速率加糖速率加消泡荆速率加消泡荆速率加中间体或前加中间体或前体速率体速率加其他基质速加其他基质速率率：KPavvm；ln3hrnmkWPa8kgm3m3；L透光度透光度ghkghkgfhkgh划划h传感器传感器压力表压力表传感器传感器传感器传感器传感器传感器黏度计黏度计传感器传感器传感器传感器传感器传感器传感器传感器间接计算；在间接计算；在线监测线监测传感器传感器传感器传感器传感器传感器传感器传感器维持生长、合成维持生长、合成维持正压、增加维持正压、增加IX)供氧、排泄废气、提供氧、排泄废气、提高高KLa物料混合、提高物料混合、提高KLa反映搅拌情况、反映搅拌情况、KLa反映菌生长、反映菌生长、KLa反映发酵液性质反映发酵液性质反映发酵液数量反映发酵液数量反映菌生长情况反映菌生长情况反映发酵代谢情况反映发酵代谢情况反映供氧效率反映供氧效率反映耗氧情况反映耗氧情况反映泡沫情况反映泡沫情况反映前体、基质利用反映前体、基质利用情况情况反映基质利用情况反映基质利用情况温度温度对发酵过程的影响及其控制对发酵过程的影响及其控制 1 1、温度对微生物的影响：、温度对微生物的影响：l高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固，破坏微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生固，破坏微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生物。温度越高，微生物的死亡越快。物。温度越高，微生物的死亡越快。 l低温能抑制微生物的生长。低温能抑制微生物的生长。l各种微生物都有一个最适的生长温度范围，在各种微生物都有一个最适的生长温度范围，在此范围内，微生物的生长最快。此范围内，微生物的生长最快。 2、温度与酶反应在在一定范围内一定范围内, ,温度越高，酶反应速度越快，微温度越高，酶反应速度越快，微生物细胞生长代谢速率加快，产物提前生成；生物细胞生长代谢速率加快，产物提前生成；但因为酶本身很容易因热的作用而失活，温度但因为酶本身很容易因热的作用而失活，温度越高，酶的失活也越快，表现出微生物细胞容易越高，酶的失活也越快，表现出微生物细胞容易衰老，使发酵周期缩短，从而影响发酵过程最终衰老，使发酵周期缩短，从而影响发酵过程最终产物的产量。产物的产量。 3、温度与培养液的物理性质 改变培养液的物理性质会影响到微生物细胞的改变培养液的物理性质会影响到微生物细胞的生长。例如，温度通过影响氧在培养液中的溶解生长。例如，温度通过影响氧在培养液中的溶解浓度、氧传递速度等，而影响到整个发酵过程浓度、氧传递速度等，而影响到整个发酵过程。4、温度与代谢产物的生物合成方向 在四环素的发酵过程中，金色链霉菌同时代谢产在四环素的发酵过程中，金色链霉菌同时代谢产生生四环素和金霉素四环素和金霉素，当温度，当温度低于低于3030时，金色链时，金色链霉菌合成霉菌合成金霉素金霉素的能力较强，随着温度的升高，的能力较强，随着温度的升高，合成四环素的能力也逐渐增强，当温度提高到合成四环素的能力也逐渐增强，当温度提高到3535时时，则只合成，则只合成四环素四环素，而金霉素的合成几乎，而金霉素的合成几乎处于停止状态。处于停止状态。 5、同一菌株，其细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同例如，黑曲酶的最适生长温度为例如，黑曲酶的最适生长温度为3737，产生糖，产生糖化酶和柠檬酸的最适温度是化酶和柠檬酸的最适温度是32-3432-34；谷氨酸生产；谷氨酸生产菌生长的最适温度为菌生长的最适温度为30-3230-32, ,产生谷氨酸的最适产生谷氨酸的最适温度是温度是3 34-37 4-37 。pH值对发酵过程的影响及其控制（一）（一）pH值对发酵过程的影响值对发酵过程的影响大多数细菌的最适pH值为6.57.5，霉菌的最适pH值为4.05.8，酵母菌的最适pH值为3.86.0，放线菌的最适pH值为6.58.0。 例如，例如，黑曲霉在黑曲霉在pHpH值值2-32-3的情况下，发酵过程形成的情况下，发酵过程形成的产物是的产物是柠檬酸柠檬酸，而在，而在pHpH值接近值接近中性时中性时，却生成，却生成草草酸酸。又如，啤酒酵母菌的最适生长又如，啤酒酵母菌的最适生长pHpH值为值为4.54.55.05.0，此时，发酵产物是酒精；但当此时，发酵产物是酒精；但当pHpH大于大于7.57.5时，发酵产时，发酵产物除酒精外，还有醋酸和甘油。物除酒精外，还有醋酸和甘油。微生物生长的最适微生物生长的最适pHpH值和发酵产物形成的最适值和发酵产物形成的最适pHpH值往往是不同的。值往往是不同的。例如，青霉素生产菌生长的最适例如，青霉素生产菌生长的最适pHpH值为值为6.56.57.27.2，而青霉素合成的最适，而青霉素合成的最适pHpH值却为值却为6.26.26.36.3； （二）发酵过程中（二）发酵过程中pH值的变化情况值的变化情况一般，发酵过程中若消耗碱性物质或生成酸性物一般，发酵过程中若消耗碱性物质或生成酸性物质都会引起发酵液的质都会引起发酵液的pHpH值下降值下降。发酵液发酵液pHpH下降的主要原因：下降的主要原因：培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例不当，碳源过多氮比例不当，碳源过多消泡油加得过多；消泡油加得过多；微生物生理酸性物质的存在微生物生理酸性物质的存在发酵过程中若消耗酸性物质或生成碱性物质都会发酵过程中若消耗酸性物质或生成碱性物质都会引起发酵液的引起发酵液的pHpH值上升值上升. .发酵液发酵液pHpH值上升的主要原因：值上升的主要原因：培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例失衡，氮源过多氮比例失衡，氮源过多存在生理碱性物质；存在生理碱性物质；中间补料时，氨水或尿素等碱性物质加入过多中间补料时，氨水或尿素等碱性物质加入过多 （三）（三）发酵过程中发酵过程中pH值的控制值的控制采用的方法： (1) (1)调节培养基的起始调节培养基的起始pHpH值值，或加入缓冲溶，或加入缓冲溶液液( (如磷酸盐如磷酸盐) )或尽量使盐类和碳源的配比平衡或尽量使盐类和碳源的配比平衡 (2)(2)在发酵过程中在发酵过程中及时加入弱酸或弱碱及时加入弱酸或弱碱来调节来调节pHpH值值(3)(3)可可及时补料及时补料调节调节pHpH值值(4)(4)采用生理酸性盐作为氮源时，向培养液中采用生理酸性盐作为氮源时，向培养液中加入碳酸钙可以调节加入碳酸钙可以调节pHpH值值(5)(5)可用流加氨水或尿素的方法来调节发酵过可用流加氨水或尿素的方法来调节发酵过程中程中pHpH值的变化值的变化 溶解氧对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。泡沫泡沫对发酵过程的影响和控制对发酵过程的影响和控制（一）泡沫的形成及其对发酵过程的影响（一）泡沫的形成及其对发酵过程的影响发酵过程中产生泡沫的原因：发酵过程中产生泡沫的原因：外界引进的气流被机械地分散形成泡沫；外界引进的气流被机械地分散形成泡沫；发酵过程中产生的气体聚结形成的发酵泡发酵过程中产生的气体聚结形成的发酵泡沫。沫。过多的持久性泡沫会给发酵过程造成不利过多的持久性泡沫会给发酵过程造成不利的影响，主要表现在：的影响，主要表现在：使发酵罐的装填系数减少；使发酵罐的装填系数减少；造成大量逃液，导致产物的损失；造成大量逃液，导致产物的损失；泡沫泡沫“顶罐顶罐”，有可能使培养基从搅拌，有可能使培养基从搅拌轴处渗出，增加了染菌的机会；轴处渗出，增加了染菌的机会；由于泡沫的液位变动，以及不同生长周由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮或黏附在罐盖或罐壁期微生物随泡沫漂浮或黏附在罐盖或罐壁上，使微生物生长的环境发生改变，使微上，使微生物生长的环境发生改变，使微生物群体的非均一性增加；生物群体的非均一性增加；影响通气搅拌的正常进行，妨碍微生物的呼影响通气搅拌的正常进行，妨碍微生物的呼吸，造成发酵异常，导致最终产物产量下降；吸，造成发酵异常，导致最终产物产量下降；使微生物菌体提早自溶，这一过程的发展又使微生物菌体提早自溶，这一过程的发展又会促使更多的泡沫生成；会促使更多的泡沫生成；消泡剂的加入，会给最终产物的提取带来困消泡剂的加入，会给最终产物的提取带来困难。难。（二）（二）发酵过程中泡沫的消除与控制发酵过程中泡沫的消除与控制l发酵过程中消除和控制泡沫的主要措施：发酵过程中消除和控制泡沫的主要措施：(1)化学消泡法：优点：优点：来源广泛，消泡效果好来源广泛，消泡效果好作用迅速可靠，效率高，用量少作用迅速可靠，效率高，用量少不仅适用于大规模发酵生产，同时也适用不仅适用于大规模发酵生产，同时也适用于小规模的发酵实验。于小规模的发酵实验。l化学消泡剂一般应具备的特点：化学消泡剂一般应具备的特点：是表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡作是表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡作用迅速有效用迅速有效具有一定的亲水性具有一定的亲水性在水中的溶解度较小在水中的溶解度较小对人、畜及微生物细胞无毒性，不影响产物的对人、畜及微生物细胞无毒性，不影响产物的提取分离和产品的质量；提取分离和产品的质量；不影响氧在培养液中的溶解和传递；不影响氧在培养液中的溶解和传递；来源方便，价格便宜。来源方便，价格便宜。l常用的化学消泡剂主要有：常用的化学消泡剂主要有：天然油脂天然油脂( (玉米油、米糠油、豆油、菜油、棉玉米油、米糠油、豆油、菜油、棉子油及鱼油、猪油等子油及鱼油、猪油等) )高级醇类高级醇类( (聚二醇和十八醇聚二醇和十八醇) )脂肪酸和聚醚类脂肪酸和聚醚类( (聚氧丙烯甘油和丙烯甘油聚氧丙烯甘油和丙烯甘油) )硅酮类硅酮类( (聚二甲基硅氧烷及其衍生物聚二甲基硅氧烷及其衍生物) )氟化烷烃氟化烷烃 优点：优点：不需要在发酵液中添加任何其他物质，不需要在发酵液中添加任何其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对产物分离工艺的影响。产物分离工艺的影响。缺点：缺点：效果不如化学消泡迅速、可靠，还需要配备一效果不如化学消泡迅速、可靠，还需要配备一定的设备和消耗一定的动力，不能从根本上消定的设备和消耗一定的动力，不能从根本上消除引起泡沫的因素。除引起泡沫的因素。(2)机械消泡法：机械消泡法：3：灭菌技术：灭菌技术灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。系统。（一）灭菌项目（一）灭菌项目（二）灭菌方法（二）灭菌方法（三）灭菌的矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处（四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术（一）灭菌项目（一）灭菌项目1、在投入生产之前，必须对设备、管道、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。进行彻底清洗、和严格灭菌。2、对通入的培养基、通入的空气进行先、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。行灭菌。（二）灭菌方法（二）灭菌方法2、化学法1、加热法3、辐射法4、过滤法（三）灭菌的矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处对杀灭细菌的同时对杀灭细菌的同时1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。破坏。2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。（四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术可分为可分为6种技术：种技术：1、间歇灭菌法、间歇灭菌法2、加热灭菌法、加热灭菌法3、连续灭菌法、连续灭菌法4、空气加热灭菌法、空气加热灭菌法5、空气过滤灭菌法、空气过滤灭菌法6、营养物质瞬时高温杀菌法、营养物质瞬时高温杀菌法1：间歇灭菌法：间歇灭菌法又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。（1）灭菌方法）灭菌方法（2）注意事项）注意事项（3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点（1）灭菌方法）灭菌方法间歇灭菌的操作过程分为间歇灭菌的操作过程分为3个过程：个过程：加热加热-保温维持保温维持-冷却。冷却。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。主要的，冷却杀菌的作用最小。（2）注意事项）注意事项应当避免过长的加热时间，否则常常会破应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。坏培养基中的营养物质。系统经过灭菌操作之后，必须达到不留系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个个杂菌，否则，只要经过杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，昼夜的增殖，1个个杂菌就会增加到杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。批发酵液的失败。（3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点设备造价低廉。便于进行手动操作。2：加热灭菌法：加热灭菌法隧道灭菌箱设备3：连续灭菌法：连续灭菌法（1）定义）定义（2）技术分类）技术分类（3）连续灭菌法的优点）连续灭菌法的优点（4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足（1）定义）定义连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。（2）技术分类）技术分类连续灭菌法可以分为2种：（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。（3）连续灭菌法的优点）连续灭菌法的优点（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。（3）容易实现自控操作。（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用率。是目前很多制药厂经常采用的方法。（4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足（1）投资较大，（2）需要同时设置加热、冷却装置。4：空气加热灭菌法：空气加热灭菌法利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。不同温度下的空气细菌存活时间：200/15.1s， 250/5.1s，300/2.1s， 350/1.05s。干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。5：空气过滤灭菌法：空气过滤灭菌法是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤）绝对过滤（2）深层过滤）深层过滤陶瓷过滤机陶瓷过滤机（1）绝对过滤）绝对过滤如超滤膜过滤就属于绝对过滤是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗粒截留。（2）深层过滤）深层过滤是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。6：营养物质瞬时高温杀菌法：营养物质瞬时高温杀菌法一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。分离纯化技术分离纯化技术微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（二）初步分离，（三）产品提纯，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。（四）产品的最终分离。第四节 发酵下游加工过程发酵下游加工过程 1. 发酵产物的分离和纯化的目的及基本要求2.发酵液下游处理的流程和方法1.目的及基本要求.目的：发酵液中杂质含量较多，代谢产物的浓度较低，低浓度的发酵产品不能直接作为工业生产的原料或为我所用 基本要求（1）操作简单费用低（2）提取率高，能够达到要求纯度，废液中 最终产品含量低 （3）不影响产品质量 （4）提取所用试剂对设备腐蚀性小 （5）产生废物能够处理，对环境污染少 2.流程和方法下游技术两个阶段：（1）发酵液的预处理和固液分离（2）纯化 a 提取（初步纯化） b 精制（高度纯化） c 成品加工（一）固体物质的去除（一）固体物质的去除1、目的、目的2、常用的方法有、常用的方法有3、常用的设备、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术1、目的、目的（1）分离出完整的细胞。（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。（3）除去细胞有残留碎片。（4）除去没有转化的不溶性基质。（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。2、常用的方法、常用的方法（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。3、常用的设备、常用的设备（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备-管式离心沉降机。不锈钢板框压滤机不锈钢板框压滤机澄澄清清型型管管式式分分离离机机SSC600-NG三三足足式式沉沉降降离离心心机机19XKZ全自动压滤机全自动压滤机4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。（二）初步分离（二）初步分离进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发、蒸发2、萃取、萃取3、沉淀、沉淀4、膜分离、膜分离1、蒸发、蒸发蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。2、萃取、萃取萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类（1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取（2）双水相萃取）双水相萃取（1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。SFT-150超临界萃取反应仪超临界萃取反应仪利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。（2）双水相萃取）双水相萃取使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。3、沉淀、沉淀蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。NSG-630浓缩分离机浓缩分离机ZHN系列真空浓缩罐系列真空浓缩罐沉淀和盐折的结合沉淀和盐折的结合由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。4、膜分离、膜分离膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。膜分离的优点（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。膜分离的分类（1）反渗透法）反渗透法（2）超滤法）超滤法（1）反渗透法）反渗透法根据物理化学的原理，当含有溶质A的溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开的时候，由于系统渗透压的作用，渗透液C 便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透的压力就自然称为渗透压（）如果在溶液B一方施加压力（P），发现渗透液C进入溶液B的速率就会减小。当压力（P）=渗透压（）时，渗透现象就会停止。当压力（P）渗透压（）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。根据溶液所具有的反渗透特性，可以实现溶液的浓缩。（2）超滤法）超滤法是指在反渗透的基础之上，将隔离膜由原来的半透膜，改成带有较大孔径的薄膜。这样一来，在反渗透操作过程中，不但是溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子的杂质也连带一起进入到渗透液之中。与反渗透法相比，超滤法明显具有其优点-反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩的同时，还具有纯化作用。反渗透法反渗透法+超滤法的实际应用超滤法的实际应用（1）主要用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐等步骤，（2）在疫苗、血浆等生产中也常被使用。膜分离装置的分类（1）中空纤维束，（2）板-框膜分离装置，（3）螺旋状膜分离装置反渗透装置反渗透装置（三）产品提纯（三）产品提纯层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊的载体物质，称为固定相。含有待分离产物的溶液则称为流动相。当流动相流过固定相的时候，由于流动相中不同的物质与固定相之间产生了不同强度的结合力，因此各种物质在层析柱内停留的时间也各不相同，结果，它们将依次序的先后流出层析柱。层析法的分类1、吸附层析法、吸附层析法2、离子交换层析法、离子交换层析法3、凝胶层析法（分子筛）、凝胶层析法（分子筛）4、亲的层析法、亲的层析法1、吸附层析法、吸附层析法吸附层析法是利用各种物质与固定相之间由于吸附力的差异、而产生不同的结合力的原理，所进行的层析操作。固定相对溶质产生结合力，这种结合力是以离子键、氢键、范德华力所产生的。而流动相的洗脱作用又对溶质和固定相之间产生脱离作用。这样，吸附脱离再吸附再脱离，导致溶质沿着洗脱液的方向移动。其移动速率取决于固定相对溶质的吸附能力，吸附力弱，移动就快，吸附力强，移动就慢。2、离子交换层析法、离子交换层析法（1）基本原理）基本原理（2）离子交换过程）离子交换过程（3）常用的离子交换树脂）常用的离子交换树脂（4）离子交换层析法的应用）离子交换层析法的应用（1）基本原理）基本原理采用离子交换树脂作为固定相，离子交换树脂本身具有正离子基团和负离子基团，酸性电离基团可以交换阳离子，称为阳离子交换树脂。碱性电离基团可以交换阴离子，称为阴离子交换树脂。离子交换树脂同时具备极性基团和非极性基团。极性基团不断地与溶液中的离子进行交换，而非极性基团则构成树脂分子的骨架，起支撑作用。（2）离子交换过程）离子交换过程是一个同时包含吸附+吸收+穿透+扩散+离子交换+离子亲和，等等物理化学过程的综合作用的结果。溶液中的溶质离子扩散到树脂的表面溶质离子穿透树脂的表面扩散到树脂颗粒的内部溶质离子与树脂离子发生交换树脂离子穿透树脂的表面树脂离子扩散到溶液之中（3）常用的离子交换树脂）常用的离子交换树脂（1）羧甲基纤维素阳离子交换树脂（CM-纤维素）-当阳离子蛋白质流经交换树脂时，由于静电吸引的作用，蛋白质将与树脂结合，然后用缓冲液进行冲洗交换柱，结合力最弱的蛋白质首先被洗脱下来。不同的缓冲液将各处洗脱“捡到”其中的某一蛋白质组分。（2）二乙氨乙基纤维素阴离子交换树脂（DEAE-纤维素）-原理与CM-纤维素交换原理相同。（4）离子交换层析法的应用）离子交换层析法的应用离子交换层析法具有收率高、质量好、周期短、成本低、设备简单、适合工业化生产等优点。目前已经普遍应用于生物化学制药行业。离子交换柱离子交换柱3、凝胶层析法、凝胶层析法（1）基本原理）基本原理（2）常用的凝胶层析材料）常用的凝胶层析材料（3）凝胶层析的应用价值）凝胶层析的应用价值（1）基本原理）基本原理凝胶层析也称为凝胶过滤、分子筛层析、排阴层析、凝胶渗透层析等等。凝胶是一种具有多孔的、网状结构的分子筛。每一个颗粒就相当于一个筛子。当样品通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔，它们沿着凝胶颗料的间隙流动，因此速度较快而首先流出层析柱。相反，分子量较小的物质可以自由地进出凝胶网孔，它们不断地在凝胶颗粒之中来回流动，从而导致进出速度下降。（2）常用的凝胶层析材料）常用的凝胶层析材料（1）葡聚糖凝胶，（2）聚丙烯酰胺凝胶。AM90-1型凝胶层析仪型凝胶层析仪（3）凝胶层析的应用价值）凝胶层析的应用价值（1）可用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物质。能彻底分离分子量相差只有25%的二种蛋白质。（2）凝胶层析具有设备简单、分离迅速、不影响产物的分子生物学特性等优点。4、亲和层析法、亲和层析法是利用生物分子之间所具有的专一亲和力而设计出的一种层析方法。（1）亲和层析的原理）亲和层析的原理（2）亲和层析的例子）亲和层析的例子（1）亲和层析的原理）亲和层析的原理（1）载体活化-将载体在碱性条件下用溴化氢（CNBr）进行活化。（2）通过偶联反应制成亲的吸附剂-将某一种能够与生物分子进行可逆性结合的物质（称作配基）通过偶联反应联结到载体上，（3）含有生物分子的样品通过层析柱。（4）生物分子与配基结合而被吸附，（5）未能进行特异性结合的其它杂蛋白，通过洗涤而流出层析柱。（2）亲和层析的例子）亲和层析的例子层析目的-分离DNA解聚酶层析方法-以珠状的琼脂糖、或者聚丙烯酰胺作为载体，以DNA解聚酶的抑制物作为配基层析结果-（1）DNA解聚酶被特异性地结合在层析柱上，（2）其它物质全部流出（3）最后用适当的洗脱液通过层析柱，可获得纯度极高的DNA解聚酶九：干燥技术九：干燥技术干燥操作往往是生物产品生产的最后一步，干燥的目的就在于除去物料中的水分，便于保藏和运输。干燥注意事项-由于生物产品多数为热敏性物质，所以干燥过程必须注意使用那些干燥时间不太长、干燥温度不过高的设备。干燥技术和设备-（一）喷雾干燥（一）喷雾干燥（二）气流干燥（二）气流干燥（三）沸腾干燥（三）沸腾干燥（四）鼓式干燥（四）鼓式干燥（五）冷冻干燥（五）冷冻干燥（一）喷雾干燥（一）喷雾干燥喷雾干燥是利用不同的喷雾装置，如喷嘴、或者转盘，将浓缩液或者悬浮液喷成雾状，使它们形成具有极大表面积的分散液滴，在干燥室内缓缓沉降，并与热空气流发生强烈的热交换，在几秒到几十秒之内得到迅速干燥的方法。喷雾干燥由于干燥时间极短、避免了生物产品活性的破坏，适用于抗生素、酶制剂、热不稳定性蛋白质的干燥。高高速速离离心心喷喷雾雾干干燥燥机机（二）气流干燥（二）气流干燥是利用颗粒在气流中能够自由流动的特性，使物料与气流一起流经一段长的管道，颗粒物料在与气流一起流动的过程中，水分得到迅速汽化，因此，等到到达干燥管道出口处时，颗粒物料已经被干燥。PG系系列列气气流流干干燥燥机机（三）沸腾干燥（三）沸腾干燥是利用流态化技术，被干燥物料由最上层逐层往下移动，而热空气则自下而上，与物料呈现逆向流动，在每层面上，使物料呈现出“沸腾状态。”称为沸腾干燥法。沸腾干燥的缺点-（1）干燥时间过短，则干燥不透。（2）干燥时间过长，则生物产品的活性遭到破坏。GFG型型高高效效沸沸腾腾干干燥燥机机（四）鼓式干燥（四）鼓式干燥这种干燥器有二个相向转动的鼓，鼓内通入热空气，当溶液被加入到鼓面上流动时，就得到了汽化。最后，干燥的物料由刮刀刮下。鼓式干燥的应用范围-只能对那些热稳定性良好的药物进行干燥。HZG型型直直接接加加热热式式回回转转滚滚筒筒干干燥燥机机（五）冷冻干燥（五）冷冻干燥1、基本原理、基本原理2 2、冷冻干燥的程序、冷冻干燥的程序3 3、冷冻干燥的应用、冷冻干燥的应用4、冷冻干燥的设备、冷冻干燥的设备1、基本原理、基本原理又称升华干燥。将湿的物料在-50到-10之间冻结成固态，然后在高真空（1-0.001mmHg、1mmHg=133.332Pa）条件下，将其中的水分直接升华成气态，从而达到脱水、干燥的目的。2 2、冷冻干燥的程序、冷冻干燥的程序（1）冻结-一般生物制品的共晶点在-20，因此，通常将制品冻结在-35到40之间。再维持12小时，以保证冻结完全彻底。（2）升华-在低温-30到-10之间，利用高真空度（13.330Pa）时，将溶剂变成气体直接用真空泵抽走。通过升华过程，可驱除制品中90%的水分。（3）再干燥-将游离的冰晶升华完成之后，继续对制品进行加热，以驱除残余的水分。3 3、冷冻干燥的应用、冷冻干燥的应用冷冻干燥法由于处理温度较低，对于热敏性物质的处理特别有利。适宜于抗生素、维生素的干燥。SZG系列双锥回转真空干燥机系列双锥回转真空干燥机4、冷冻干燥的设备、冷冻干燥的设备（1）大规模生产设备由低温干燥箱+冷冻机+真空泵所构成。（2）小批量试制时可以在玻璃质冷冻干燥器中进行。将样品置于培养皿中，厚度不超过1cm，在冰箱中冻成硬块，再放入装有P2O5或者硅胶吸水剂的真空干燥器中，连续抽真空，来达到浓缩、干燥的目的。发酵工艺控制发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。有关的参数如表42所示。反映发酵过程变化的参数可以分为两类：一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数，它们包括反映物理环境和化学环境变化的参数，如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液黏度、浊度、pH、离子浓度、溶解氧、基质浓度等，称为直接参数。另一类是至今尚难于用传感器来检测的参数，包括细胞生长速率、产物合成速率和呼吸商等。后一类参数需要根据一些直接检测出来的参数，借助于电脑计算和特定的数学模型才能得到。因此这类参数被称为间接参数。上述参数中。对发酵过程影响较大的有温度、pH、溶解氧浓度等。 4.发酵设备4.1 厌氧发酵罐设备简单主要用于酒精、乳酸及啤酒等厌氧发酵4.2好氧发酵罐4.2.1机械搅拌式发酵罐（通用式发酵罐）：大部分通风发酵采用。特点:溶氧速率高，气液混合效果好,结构严密，有利于避免杂菌污染缺点：结构较复杂，动力消耗大4.2.1 通风搅拌式发酵罐通风目的：a)供给微生物所需要的氧b）代替搅拌器使发酵液均匀混合1）循环式通风发酵罐2）高位塔式发酵罐偶联中使用的生物反应器一般来说，发酵使用的各种类型的生物反应器均可在偶联技术中使用。偶联研究中使用最多的仍然是发酵上最常使用的批式搅拌罐和连续搅拌罐式反应器。另外，气升式反应器、流化床反应器、固定床式反应器等也有报导。713生物反应器与分离技术及设备的偶联按生物反应与产物分离的偶联方式，偶联技术分为原位偶联和异位偶联。原位偶联异位偶联7.2.偶联技术的应用 1真空发酵2气提发酵 3吸附发酵 原位吸附发酵 异位吸附发酵4膜分离发酵 5萃取发酵 有机溶剂萃取与发酵偶联 双水相萃取与发酵偶联 721真空发酵在发酵过程中，对发酵罐抽真空减压，使发酵产生的沸点较低易挥发组分从发酵液中分离出来，再通过冷却、吸附或吸收的方法将挥发产物回收，以达到连续发酵同时连续回收产物的目的。真空发酵只适用于厌氧发酵，如酒精发酵和丙酮丁醇发酵。在技术上真空发酵可采用原位真空发酵和异位真空发酵。722气提发酵利用氮气、氢气或二氧化碳气等惰性气体作为气提载体，通入发酵液中，将发酵产生的蒸气压大于水的挥发性产物携带出发酵罐，经冷却、吸附或吸收等方法将产物回收。惰性气体经压缩后可以循环使用。同样，此技术也是主要适用于厌氧发酵。7.2.3 吸附发酵根据偶联的技术特点，吸附发酵可分为原位吸附和异位吸附。1原位吸附发酵即直接将吸附剂加到发酵液中，及时地将发酵产生的产物吸附于吸附剂上，因产物不会再对发酵产生干扰，在动力学和反应平衡上有利。发酵结束后，将吸附剂分离回收，经过洗涤洗去沾附和混杂的细胞和杂质，然后将洗脱，可得到一定纯度的产物。 2异位吸附发酵在发酵过程中，将一部分发酵液引入吸附旁路进行产物吸附，并将吸附后的发酵液重新引回生物反应器，达到吸附回收产物和解除产物抑制作用的目的。对于含有大量细胞的发酵液，旁路吸附时若采用一般的柱式吸附有一定困难，而采用流态化床或沸腾床比较合适。为了达到连续生产的目的，多采用并联多个吸附装置的办法，以便进行切换轮流吸附、洗涤、洗脱、再生，达到反复使用的目的。724膜分离发酵膜分离是基于膜材料的孔径大小，对具有不同粒度的物质进行分离的技术。已在生物技术产品的回收、分离上应用成功，它的最大优点是分离过程无相变、无试剂，操作条件易控制，可连续化。7.2.5 萃取发酵萃取是化学工业的典型单元操作技术，在发酵工业上广泛用于分离抗生素、氨基酸、有机酸及其它发酵产品，为将萃取与发酵偶联奠定了基础。而近年发展的双水相萃取技术弥补了有机相萃取的不足，可用于萃取具有生物活性的生物大分子和其它活性物质，将其与发酵偶联开发出具有高度生物相容性的偶联技术。1有机溶剂萃取与发酵偶联有机溶剂的选择应当考虑以下因素：对发酵使用的微生物有高的生物相容性，即对发酵过程(包括细胞生长和产物合成)无不良影响，对需要萃取的产物有高的萃取选择性和容量；有低的挥发性和水溶性，高的沸点和闪点，以确保操作过程的安全；低的毒性和成本；表面张力低，吼化性能差；稳定性好，包括不被微生物利用和代谢，易回收；不会影响发酵过程的pH和其它特性。目前最常应用的有机溶剂有烷烃、芳烃、烯烃、醚、酯、醇、烃类衍生物、全氟化碳等。其中烷烃、芳烃和全氟化物的稳定性好，且具有增加氧溶解度作用。 2双水相萃取与发酵偶联双水相萃取与发酵偶联具有以下优点：双水相系统与生物反应的相容性高，特别是对生物活性物质有保护作用；生物产物在两相中分配系数可以通过双水相系统的组成参数加以控制，如改变PEG浓度、分子量、分子量分布、盐种类和浓度、系统pH、第二相组成的高聚物的性质等，使生物反应与产物分离在不同相中进行，可以适用于不同生物反应；界面张力小，不会引起生物活性物质失活，但相分离速度较快，两相的分离简单；原位萃取十分方便。 第五节 发酵工程的应用一、抗生素发酵生产二、氨基酸发酵生产三、维生素发酵生产（1）人工诱变法）人工诱变法抗生素产生菌用紫外线、抗生素产生菌用紫外线、射线、射线、X射线、射线、快中子等物理方法，或者用亚硝酸、秋水快中子等物理方法，或者用亚硝酸、秋水仙素、氮芥子气、硝基胍等化学诱变剂处仙素、氮芥子气、硝基胍等化学诱变剂处理，来提高抗生素的产量。理，来提高抗生素的产量。（2）原生质体融合法）原生质体融合法Pesti于于1979年提出用原生质体融合法来提年提出用原生质体融合法来提高青霉素的产量。高青霉素的产量。我国四川抗生素研究所于我国四川抗生素研究所于1983年通过原生年通过原生质体融合法生产麦迪霉素，产量提高质体融合法生产麦迪霉素，产量提高40%。（3）体外）体外DNA重组法重组法采用体外DNA重组技术来改良抗生素生产菌。英国D.Flopwood首次在链霉菌之间进行了基因转移。产生出世界首创的杂合抗生素-麦迪紫红素。六：发酵生产过程六：发酵生产过程生产用菌种生产用菌种-原始材料原始材料-培养基培养基-程序程序-生产细则生产细则-以青霉素为例讲解以青霉素为例讲解（1）青霉素（）青霉素（penicillin）所用菌种所用菌种所用菌种所用菌种-黄青霉黄青霉黄青霉黄青霉菌菌菌菌原始材料原始材料原始材料原始材料-氨基氨基氨基氨基已二酸、半胱氨酸、已二酸、半胱氨酸、已二酸、半胱氨酸、已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。缬氨酸。缬氨酸。缬氨酸。发酵方法发酵方法发酵方法发酵方法-加前体加前体加前体加前体物质的深层发酵法。物质的深层发酵法。物质的深层发酵法。物质的深层发酵法。青霉素发现者弗莱明青霉素发现者弗莱明沙土管菌种沙土管菌种转移到固体琼脂斜面培养基上，转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养培养5-6天，获得芽孢天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养进入移种瓶培养进入移种瓶培养进种子罐，接种量为进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，进繁殖罐，28培养培养48-96小时小时进入发酵罐，开始生产。进入发酵罐，开始生产。鼓式过滤鼓式过滤第一次萃取器第一次萃取器纯化柱纯化柱第二次萃取器第二次萃取器第三次萃取器第三次萃取器真空结晶釜真空结晶釜瓷过滤器瓷过滤器结晶洗涤釜结晶洗涤釜真空干燥器（结束）真空干燥器（结束）程序程序一、应用发酵工程的生产实例一、应用发酵工程的生产实例1.谷氨酸（味精）的生产谷氨酸（味精）的生产菌种菌种谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌培养液培养液豆饼（或马铃薯）水解液、玉米浆、豆饼（或马铃薯）水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素（生长因子）镁、生物素（生长因子）灭菌灭菌培养液投入发酵罐中，通入培养液投入发酵罐中，通入98kPa的蒸汽灭菌，冷却，接种，培养的蒸汽灭菌，冷却，接种，培养谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径在工厂里是怎在工厂里是怎样应用谷氨酸棒样应用谷氨酸棒状杆菌来生产谷状杆菌来生产谷氨酸的？氨酸的？ 谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌通入无菌空气气通入无菌空气气30370CpH为为782832h不断搅拌不断搅拌加料口加料口搅拌器搅拌器冷却水进口冷却水进口电动机电动机pH检测及检测及控制装置控制装置排气口排气口冷却水出口冷却水出口无菌空气无菌空气放料口放料口培养液培养液发酵过程发酵过程提取谷氨酸提取谷氨酸6、分离提纯、分离提纯温度温度30-37C，pH7-8，经过28-32h，培养培养液中就会液中就会产生大量的谷氨酸生大量的谷氨酸50-100g/L提取出谷氨酸提取出谷氨酸用适量的用适量的Na2CO3溶液中和溶液中和过滤浓缩离心离心味精味精谷氨酸谷氨酸 + Na2CO3谷氨酸钠谷氨酸钠过滤浓缩离心分离过滤浓缩离心分离