第第4040章、重组章、重组DNADNA技术技术1. 目的基因的获取目的基因的获取2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建3. 外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接4. 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌5. 重组体的筛选重组体的筛选6. 克隆基因的表达克隆基因的表达(一)目的基因的获取1.化学合成法化学合成法2.基因组基因组DNA3.cDNA4.聚合酶链反应聚合酶链反应基本概念基因（基因（gene）：）：P219基因基因组组（genome）：）：P292基因组基因组学学（genomics）：）： 研究基因组的研究基因组的结构、信息与功能结构、信息与功能的的科学。科学。基因组基因组计划计划：HGPP440后后基因组基因组功能功能基因组基因组基因文库基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library)聚合酶链反应（PCR）Polymerase Chain Reaction基本原理：基本原理： 变性、变性、 退火、退火、 延伸延伸(二)克隆载体的选择和构建 质粒质粒DNA 克隆载体克隆载体 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA(三) 外源基因与载体的连接连接策略连接策略1. 粘端粘端DNA间的连接 (1) 同一限制性内切酶切割位点连接 (2) 不同限制性内切酶切割位点连接 2. 平端平端DNA间的连接 3. 同聚物加尾同聚物加尾连接 4. 人工接头人工接头连接( (四四) )重组重组DNADNA分子导入受体菌分子导入受体菌 无性繁殖无性繁殖 感受态细胞感受态细胞: 容易接受外源容易接受外源DNA的状态的状态. 方式方式: 转化、转染、感染转化、转染、感染l导入大肠杆菌导入大肠杆菌1. 氯化钙转化法氯化钙转化法2. 电击法电击法3. 体外包装感染法体外包装感染法导入哺乳动物细胞1. 显微注射法显微注射法2. 电穿孔法电穿孔法3. DNA-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀4. DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法5. 病毒感染法病毒感染法6. 脂质体介导法脂质体介导法7. 细胞融合法细胞融合法8. 原生质体融合法原生质体融合法9. 微细胞介导法微细胞介导法(五 )重 组 体 的 筛 选 直接选择法直接选择法1. 抗药性选择抗药性选择2. 标志补救标志补救3. 分子杂交法分子杂交法间接筛选法间接筛选法 核酸水平核酸水平*1. 酶切图谱酶切图谱*2. 核酸探针核酸探针*3. PCR*4. 序列测定序列测定蛋白质水平蛋白质水平免疫学的技术：免疫学的技术： SDS-PAGE、Western blot、ELISA、 放放 免免 、免疫沉淀、免疫沉淀、荧光荧光抗体抗体等等(六)克隆基因的表达原核表达体系原核表达体系表达载体的标准：表达载体的标准： 1. 含有大肠杆菌适宜的选择标志含有大肠杆菌适宜的选择标志 2. 具有能调控转录、产生大量具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子的强启动子 3. 含有适当的翻译控制序列含有适当的翻译控制序列 4. 含有合理设计的多接头克隆位点含有合理设计的多接头克隆位点l真核表达体系真核表达体系 关键步骤是将重组关键步骤是将重组DNA导入真核细胞导入真核细胞DNA克隆的基本过程1.分：分：分离目的基因2.切：切：对目的基因和载体适当切割3.接：接：目的基因与载体连接4.转：转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛：筛选出含有重组体的受菌体基因工程技术策略分：分： 基因载体基因载体 目的基因目的基因 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 直接分离直接分离 cDNA 人工合成人工合成 基因文库基因文库切：切： 限制性内切酶限制性内切酶 有缺口的载体有缺口的载体 目的基因目的基因接：接： 连接酶连接酶 粘端连接粘端连接 平端连接平端连接 尾接法尾接法 重组体重组体转：转： 转化转化 转染转染 体外包装体外包装 带重组体的宿主带重组体的宿主筛：筛： 表型筛选表型筛选 电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交基因工程技术与医学的关系基因工程技术与医学的关系1.1.生命科学研究的趋势生命科学研究的趋势2.2.疾病基因的发现疾病基因的发现3.3.发展生物制药发展生物制药4.4.基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗5.5.遗传病的预防遗传病的预防基 因 工 程 的 目 的1.1.醫學用途醫學用途: : 超過種基因治療法已經在超過種基因治療法已經在全球推行全球推行2.2.改善農業改善農業: : 糧食產量大增，解決飢荒；抵抗糧食產量大增，解決飢荒；抵抗病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛，保存病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛，保存期更長。期更長。3.3.稀有動物的保育稀有動物的保育: : 拯救瀕臨絕種的動物拯救瀕臨絕種的動物4.4.其他其他: :政治用途、經濟用途、娛樂用途等。政治用途、經濟用途、娛樂用途等。 转转基基因因作作物物，目目前前最最常常见见的的是是转转入入抗抗除除草草剂剂基基因因，这这样样的的转转基基因因作作物物可可以以抵抵抗抗普普通通的的、较较温温和和的的除除草草剂剂，因因此此农农民民用用这这类类除除草草剂剂就就可可以以除除去去野野草草，而而不不 必必采采用用那那些些毒毒性性较较强强、较较有有针针对对性的除草剂。性的除草剂。其其次次是是转转入入抗抗虫虫害害基基因因，用用得得最最多多的的是是从从芽芽孢孢杆杆菌菌克克隆隆出出来来的的一一种种基基因因，有有了了这这种种基基因因的的作作物物会会制制造造一一种种毒毒性性蛋蛋白白，对对其其他他生生物物无无毒毒，但但能能杀杀死死某某些些特特定定的的害害虫虫，这这样样农农民民就就可可以以减减少少喷喷洒洒杀杀虫虫剂剂。据据统统计计，在在过过去去的的四四年年内内，美美国国由由于于推推广广抗抗虫虫害害转转基基因因作作物物，少少喷喷洒洒 了了270万万磅磅的的杀杀虫虫剂剂。转转基基因因作作物物还还能能增增加加产产品品，例例如如抗虫害转基因玉米能增抗虫害转基因玉米能增 产产515。转转基基因因技技术术也也可可用用于于改改变变食食物物的的营营养养成成分分，例例如如减减少少土土豆豆的的水水分分， 这这样样炸炸出出来来的的土土豆豆片片更更脆脆；降降低低植植物物油油中中的的不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸，能能延延长长储储存存期期限限。 转转基基因因西西红红柿柿不不仅仅容容易易运运输输、保保存存，而而且且味味道道也也更更佳佳。菲菲律律宾宾的的国国际际水水稻稻研研究究 院院正正在在试试验验“金金水水稻稻”，通通过过转转基基因因技技术术让让水水稻稻制制造造贝贝塔塔胡胡萝萝卜卜素素（维维生生素素A的的 前前体体），有有助助于于消消灭灭在在亚亚洲洲地地区区广广泛泛存存在在的的维维生生素素A缺缺乏乏症症。转转基基因因技技术术也也可可提提 高高水水稻稻中中铁铁元元素素的的含含量量，以以减减少少亚洲妇女常见的贫血症。亚洲妇女常见的贫血症。 转基因作物的历史很短。转基因作物的历史很短。1992年，中国种植了年，中国种植了世界上第一批商用转基因作世界上第一批商用转基因作 物转基因烟草。物转基因烟草。1994年，美国市场上才首次出现了转基因食品，年，美国市场上才首次出现了转基因食品，一种软化一种软化 缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨大优势，推广非常快。到大优势，推广非常快。到2000年，年， 全世界已有全世界已有4420万公顷的土地种植转基因作物，其中美国万公顷的土地种植转基因作物，其中美国占占68，阿根廷占，阿根廷占23， 加拿大占加拿大占7，中国，中国占占1，其他国家占，其他国家占1。大豆、玉米、棉花和。大豆、玉米、棉花和油菜是主要的油菜是主要的 转基因作物，在美国，有近一半转基因作物，在美国，有近一半的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是转的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是转 基因作物。美国超级市场上的食物制品中，约基因作物。美国超级市场上的食物制品中，约60含有转基因的成分。在公众的含有转基因的成分。在公众的 反对声中，反对声中，目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业化目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业化国家，转基因作物的国家，转基因作物的 种植面积有减少的趋向。种植面积有减少的趋向。美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美国美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美国是农产是农产 品出口大国，欧洲、日本对转基因作物品出口大国，欧洲、日本对转基因作物进口的限制，也打击了美国农民的积极性。进口的限制，也打击了美国农民的积极性。 Transgenic tobacco plant with gene for firefly luciferase关关于于基基因因工工程程的的争争议议A.A.花那麼多經費研究基因工程，卻不能妥善照顧花那麼多經費研究基因工程，卻不能妥善照顧貧困的病人，不關心是否建立比較健全的公共貧困的病人，不關心是否建立比較健全的公共衛生體系，來有效預防和治療疾病，或是訂定衛生體系，來有效預防和治療疾病，或是訂定較完整的社會福利措施，這樣是否合乎倫理？較完整的社會福利措施，這樣是否合乎倫理？ B.B.掌握基因工程科技的強國是否藉著優勢來宰制掌握基因工程科技的強國是否藉著優勢來宰制弱小國家？基因工程技術落入犯罪集團或野心弱小國家？基因工程技術落入犯罪集團或野心家手中怎麼辦？提高了糧食產量，是否造成另家手中怎麼辦？提高了糧食產量，是否造成另一個資源分配不均的問題？一個資源分配不均的問題？ Arguments on Human Cloning A.A.人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出賣？新的基因組合的專利是屬於科學家賣？新的基因組合的專利是屬於科學家( (醫生醫生) )的，還是那個複製人的？如何保護專利權？的，還是那個複製人的？如何保護專利權？如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷偷用你的細胞複製人怎麼辦？偷用你的細胞複製人怎麼辦？ Arguments on Human Cloning Ethical Considerations. .複製人的養育責任是誰？複製人長大以後是否複製人的養育責任是誰？複製人長大以後是否告知其出身？告知其出身？ . .誰是他的父母？被複製人與被複製人的配偶？誰是他的父母？被複製人與被複製人的配偶？被複製人的父母？科學家被複製人的父母？科學家( (醫生醫生 ) )？代理孕母？代理孕母？ . .複製人推翻家庭婚姻制度，使得生育不再是家複製人推翻家庭婚姻制度，使得生育不再是家庭婚姻內的產物，他可能沒有自己的家庭。庭婚姻內的產物，他可能沒有自己的家庭。 . .社會應該如何看待複製人？如何免受歧視？人社會應該如何看待複製人？如何免受歧視？人權、社會地位、法律身分如何定義？權、社會地位、法律身分如何定義？ 生命价值问题生命价值问题. .一個人有權決定另一個人的基因嗎？有權決定另一個人的生命一個人有權決定另一個人的基因嗎？有權決定另一個人的生命嗎？嗎？ . .複製人因為科學家複製人因為科學家( (醫生醫生) )的疏忽造成的生理缺陷，導致心理不的疏忽造成的生理缺陷，導致心理不平衡的問題。平衡的問題。 . .社會一定偏好複製傑出或特殊人士社會一定偏好複製傑出或特殊人士( (如愛因斯坦或希特勒如愛因斯坦或希特勒) )，所，所以複製人處處被別人拿來和被複製者比較，可能他沒有被複製者以複製人處處被別人拿來和被複製者比較，可能他沒有被複製者有極高的成就而感到挫折。複製人沒有自由選擇自己前途，活在有極高的成就而感到挫折。複製人沒有自由選擇自己前途，活在被複製者的陰影，被物化，市場化。他選擇人生的方向、興趣、被複製者的陰影，被物化，市場化。他選擇人生的方向、興趣、生活被剝奪，因為社會要求麥克喬丹的複製人打籃球，可是他生活被剝奪，因為社會要求麥克喬丹的複製人打籃球，可是他 喜歡踢足球。他會羨慕別人沒有這些問題，並且怨恨自己的命運、喜歡踢足球。他會羨慕別人沒有這些問題，並且怨恨自己的命運、怨恨科學家怨恨科學家( ( 醫生醫生) )、怨恨被複製者、怨恨被複製者. . . .製造出一堆體育高手，那麼運動會有何意義？製造出一堆品種製造出一堆體育高手，那麼運動會有何意義？製造出一堆品種優良的人類，那麼由自然生育的，而且品種較差的人、殘障的人，優良的人類，那麼由自然生育的，而且品種較差的人、殘障的人，他們的生命有何意義？複製人顛覆了社會對人的價值的觀念，對他們的生命有何意義？複製人顛覆了社會對人的價值的觀念，對人成功有新的解釋人成功有新的解釋: :那是因為他品種好啊！那是因為他品種好啊！ 醫療倫理、道德責任與科學研究問題醫療倫理、道德責任與科學研究問題. .複製自己來取得器官合乎道德嗎？這是不道德的，現複製自己來取得器官合乎道德嗎？這是不道德的，現行法律會以傷害罪來起訴。因為複製人不是他的備份，行法律會以傷害罪來起訴。因為複製人不是他的備份，任他宰割的。退一步來問，用基因工程故意造出腦死的、任他宰割的。退一步來問，用基因工程故意造出腦死的、無頭的、早死的複製人來移植器官合乎道德嗎？無頭的、早死的複製人來移植器官合乎道德嗎？ . .用基因重組產生一種類似人類的動物來移植器官，或用基因重組產生一種類似人類的動物來移植器官，或是把動物注射人類基因是把動物注射人類基因 ，那麼這個動物要含有多，那麼這個動物要含有多少人類基因才能擁有人權呢？少人類基因才能擁有人權呢？90%90%的人類基因嗎？的人類基因嗎？ 80%80%呢？呢？50%50%呢？呢？ . .造出四肢發達、頭腦簡單的人，來供人使役的不道德造出四肢發達、頭腦簡單的人，來供人使役的不道德作法。作法。 . .診斷錯誤的責任承擔、複製人有缺陷的責任問題。診斷錯誤的責任承擔、複製人有缺陷的責任問題。. .代理孕母的道德問題。她是否淪為孵卵機器，把代理孕母的道德問題。她是否淪為孵卵機器，把子宮出租十個月？子宮出租十個月？ 问问：试试管管婴婴儿儿刚刚出出来来的的时时候候不不为为世世人人所所容容，但但后后来来也也渐渐渐渐被被接接受受了了，克克 隆隆人人在在将将来来会会不不会会也也被被人人们们接接受呢？受呢？ 兰兰德德：试试管管婴婴儿儿和和克克隆隆人人有有本本质质区区别别，试试管管婴婴儿儿说说到到底底还还是是精精子子和和卵卵子子 的的结结合合，是是一一种种自自然然的的生生育育方方式式。我我看看不不出出克克隆隆人人有有何何必必要要和和好好处处。我我很很高高 兴兴地地看看到到，美美国国已已经经出出台台了了禁禁止止克克隆隆人人的的法法律律。 我我还还想想说说说说细细胞胞治治疗疗和和干干细细胞胞研研究究。我我绝绝对对支支持持这这种种技技术术，它它不不是是克克隆隆 人人，而而是是克克隆隆细细胞胞，比比如如克克隆隆出出一一个个可可以以发发育育成成胰胰腺腺的的细细胞胞来来治治疗疗糖糖尿尿病病。 有有人人用用克克隆隆性性治治疗疗来来描描述述细细胞胞治治疗疗，我我认认为为克克隆隆性性治治疗疗这这个个词词非非常常不不好好，容容 易易和和克克隆隆人人产产生生混混淆淆。不不幸幸的的是是，包包括括美美国国国国会会一一些些议议员员在在内内的的很很多多人人就就闹闹 不不清清楚楚细细胞治疗和克隆人的区别。胞治疗和克隆人的区别。年年月月日日英英国国自自然然杂杂志志关关 于于人人类类基因组草图论文的第一作者基因组草图论文的第一作者 问问：世世界界上上所所有有生生物物的的基基因因一一旦旦全全部部被被破破解解，会不会一切都像玩拼图一会不会一切都像玩拼图一 样？样？ 柯柯林林斯斯：这这是是一一个个很很严严肃肃的的问问题题，但但它它的的答答案案也也非非常常简简单单，那那就就是是“不不 ”。我我们们现现在在就就像像一一个个无无知知的的孩孩子子，刚刚刚刚走走进进一一个个硕硕大大的的图图书书馆馆，图图书书馆馆中中 摆摆着着许许许许多多多多生生命命的的天天书书，它它们们是是自自然然花花了了几几十十亿亿年年时时间间写写就就的的。我我们们现现在在 知知道道的的不不过过是是其其中中一一点点点点，千千万万不不要要自自以以为为是是。我我们们阅阅读读这这些些生生命命天天书书的的时时 候候，应应当当对对上上帝帝的的创创造造深深地感恩，而不是去扮演上帝的角色。深深地感恩，而不是去扮演上帝的角色。美美国国国国家家人人类类基基因因组组研研究究所所所所长长、美美国国科科学学院院院士院士 本 章 内 容 小 结概念：概念：接合、转化、转导、转染、转座接合、转化、转导、转染、转座重组重组DNA技术、载体、质粒、基因组技术、载体、质粒、基因组DNA、cDNA等等自然界基因重组的几种方式自然界基因重组的几种方式重组重组DNA技术的基本原理，用五个字概括技术的基本原理，用五个字概括目的基因获取的几种方式目的基因获取的几种方式外源基因与载体连接的几种方式外源基因与载体连接的几种方式