1、课题学习目标：、课题学习目标： 简述蛋白质提取和分离的基本原简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。 2 2、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 3 3、课题难点：、课题难点：样品的预处理样品的预处理 色谱柱填色谱柱填 料的处理和色谱柱的装填。料的处理和色谱柱的装填。思考：思考：1、分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 1 1、分离生物大分子的基本思路、分离生物大分子的基本思路 选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2 2、蛋白质分离和提取的原理、蛋白质分离和提取的原理 根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类的蛋白质。类的蛋白质。 一、基础知识一、基础知识3 3、提取分离方法、提取分离方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 （一）（一） 凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法）分配色谱法）2.2.凝胶凝胶 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯内部有许多贯穿的穿的通道。通道。 根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质蛋白质相对分子质量的大小，量的大小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶，的凝胶，来进行分离。来进行分离。1.1.概念概念3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质相对分子量较小的蛋白质容易容易进入凝胶内部进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的通道，路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量相对分子量较大较大的蛋白质的蛋白质无法进入凝胶内无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。移动速度较快。依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示分离过程：分离过程： 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。 1 1、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质 ( )( ) A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快即时应用：即时应用：D2 2、相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中、相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（的进行过程可表示为图中哪一个（ ）B1 1、什么是缓冲液？、什么是缓冲液？2 2、缓冲液的作用是什么？、缓冲液的作用是什么？思考：思考：3 3、缓冲液是如何配制的？你所学过的人、缓冲液是如何配制的？你所学过的人 体血液的缓冲物质有哪些？体血液的缓冲物质有哪些？4 4、本实验加的是什么缓冲液？为何要加、本实验加的是什么缓冲液？为何要加 缓冲液？缓冲液？ （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念: :在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外界的外界的酸或碱酸或碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH基本保持不基本保持不变变的混合溶液。的混合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影值的影响，维持响，维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用作用: :思考：思考：说出人体血液中缓冲对。说出人体血液中缓冲对。 NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3通常由通常由12种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而溶解于水中配制而成成,调节缓冲剂的调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得就可以制得在不同在不同PH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。3.配制：配制：（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具 有可解离的基团，在有可解离的基团，在一定的一定的PHPH下，这些基团会下，这些基团会 带上正电或负电。带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷带电荷相反相反的电极移动。的电极移动。分离样品中各种分子分离样品中各种分子, ,带电性质的差异以及分子带电性质的差异以及分子 本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。（三）（三）电泳：电泳：影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素决定决定运动方向运动方向形成形成库仑力库仑力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小3.3.类型类型: :琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 在电场的作用下在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 1 1、测定蛋白质分子量、测定蛋白质分子量: :常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚聚丙烯酰胺凝胶电泳。丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,NN,N- -亚亚甲基双丙烯酰胺甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳: : 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决于它取决于它所带所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。2.2.原理：原理： SDSSDS能使能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，别，使使电泳迁移率完全取决于分子的大小电泳迁移率完全取决于分子的大小。3. SDS3. SDS作用机理作用机理: :3.3.使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小 C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异即时应用：即时应用： 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程1.样品处理：样品处理： 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。的血液来分离血红蛋白。思考思考:1.1. 用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子一分子O2或一分子或一分子CO2，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血血液液血浆血浆水水 分分固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁血红素基团四个亚铁血红素基团2.血液有哪些成分？血液有哪些成分？思考思考:(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤: :去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化. .1 1、采集血样、采集血样2 2、低速短时间低速短时间离心离心: :速度越高和时间越长，会使白细速度越高和时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果胞等一同沉淀，达不到分离的效果. .3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水盐水洗涤：洗涤：下层暗红色的红细胞下层暗红色的红细胞+ +五倍体积的五倍体积的0.90.9 的的NaClNaCl溶液溶液洗涤，搅拌洗涤，搅拌10min10min5 5、低速、低速短时间短时间离心离心6 6、重复、重复3 3、4 4、5 5步骤三次步骤三次 目的目的: :操作：操作：注：洗涤次数过少注：洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。上清液中已没无法除去血浆蛋白。上清液中已没有黄色，说明红细胞已洗涤干净。有黄色，说明红细胞已洗涤干净。(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积加加40体积的甲苯体积的甲苯（溶解细胞膜）（溶解细胞膜）置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌搅拌10min（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）红细胞破裂，释放出血红蛋白红细胞破裂，释放出血红蛋白(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度的速度离心离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1层（最上层）：层（最上层）：第第2层（中上层）：层（中上层）：第第3层（中下层）：层（中下层）：第第4层（最下层）：层（最下层）：分离：分离：过程：过程：甲苯层甲苯层（无色透明）（无色透明）脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）（白色薄层固体）血红蛋白的水溶液层血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）（红色透明液体）杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色）。（暗红色）。滤纸过滤：除去滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层分液漏斗中静置：分出下层的分液漏斗中静置：分出下层的红色透红色透明液体明液体(4)(4)透透 析：析：( (粗分离粗分离粗分离粗分离) )过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液的血红蛋白溶液装入装入透析袋中，将透析袋放入透析袋中，将透析袋放入盛有盛有300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷的磷酸缓冲液酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），），透析透析12h12h。目的：目的：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL透析袋能使小分子透析袋能使小分子透析袋能使小分子透析袋能使小分子自由进出，而大分自由进出，而大分自由进出，而大分自由进出，而大分子保留在袋内。子保留在袋内。子保留在袋内。子保留在袋内。原理：原理：原理：原理：4.4.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是（多选）的是（多选） ( )( ) A A血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白 B B红细胞无细胞核红细胞无细胞核 C C红细胞蛋白质含量高红细胞蛋白质含量高 D D红细胞红细胞DNADNA含量高含量高5 5、下列操作正确的是（、下列操作正确的是（ ）A. A. 分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B. B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C. C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. D. 透析时要用透析时要用20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液，透析的磷酸缓冲液，透析12h12h即时应用：即时应用：ABCD2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作: :（1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端磨平两端磨平。底塞的制作：底塞的制作： 打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端。端。注意：玻璃管的上部不得注意：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作顶塞的制作：打孔：打孔安装玻璃管。安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择： A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。 B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程表示凝胶的交联程度，膨胀程 度及分离范围。度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胶膨胀时吸水7.57.5克克。凝胶的前处理：凝胶的前处理： 配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液： 计算并称取一定量的凝胶浸泡于计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：（2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填1、装填时尽量紧密：、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。B、装填：、装填：将将凝胶悬浮液一次性凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。注意：注意： 洗涤平衡：洗涤平衡： 连接缓冲液洗脱瓶，在连接缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高高的操作压下，用的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗充分洗涤平衡涤平衡12h12h。注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶表面，否则、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果可能有气泡混入，影响分离效果2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm高高高高（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调节缓冲液面：调节缓冲液面： 打开下端出口，使打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的样品加到色谱柱的顶端顶端， 注意：注意： 1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。 2 2、贴壁加样、贴壁加样 3 3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样、吸管管口贴着管壁环绕移动加样样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内， 样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口洗脱：洗脱：加入加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，的磷酸缓冲液到适当高度， 连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：待待红色的蛋白质接近色谱柱底端红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出时，用试管收集流出 液，每液，每5ml5ml收集一试管，连续收集收集一试管，连续收集。（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：正注意：正确的加样操作是：确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。思考：思考： 让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和范围内，维持结构和功能正常。功能正常。 1 1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？处理的目的是什么？2 2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察通过观察颜色颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序包括：血红蛋白提取和分离的程序包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品的处理：样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液。样品的粗分离样品的粗分离: :透析透析去除分子量较小的杂质。去除分子量较小的杂质。样品的纯化：样品的纯化：凝胶色谱法凝胶色谱法除去除去相对分子质量较大相对分子质量较大 的的杂质蛋白。杂质蛋白。纯度鉴定纯度鉴定: :聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 观察处理的血液样品离心后观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。因。 此外，离心速度过高和时间过长，会使此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和白细胞和淋巴细胞一同沉淀淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？1 1、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。否装填得均匀。2 2、加入大分子的有色物质，、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果观察色带移动的情况。如果色色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。3 3、色谱柱出现色谱柱出现纹路或是气泡纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。除气泡，消除不了时要重新装柱。 红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；说明凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确。说明凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确。红色区带：歪曲、散乱、变宽，红色区带：歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，说明分离的效果不好， 这与凝胶色谱柱的装填有关。这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？A练习巩固：练习巩固：1、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（是（）A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料B用蒸馏水重复洗涤红用蒸馏水重复洗涤红细胞细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液2 2、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是（多项）理措施中，正确的是（多项）( )( )A A采集血样后要高速短时问离心获得血细胞采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B B洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。次数，否则血浆蛋白无法除净。C C在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白出血红蛋白D D释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来蛋白和其他杂质分离开来 BCD3 3、样品的加入和洗脱的操作不正确的是（、样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）A A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内内C C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D D用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加到色谱柱透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面的顶端，不要破坏凝胶面A4 4、下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正、下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（多项）（确的是（多项）（ ） A. A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红样品的处理就是通过一系列操作收集到血红 蛋白溶液蛋白溶液 B. B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂 质，此为样品的粗提取质，此为样品的粗提取 C. C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质 蛋白除去，即样品的纯化蛋白除去，即样品的纯化 D. D. 可通过可通过SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红 蛋白的纯度蛋白的纯度ACD5 5、（、（1 1）血红蛋白提取和分离可分为四步：）血红蛋白提取和分离可分为四步：_ 、_ 、_ _ 和和_ 。（2 2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加 入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红 蛋白溶液。蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的是加入柠檬酸钠的目的是_ 。 以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_ 、_ _ _、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的这就是样品的粗分离粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。透析袋能使小分子自由进出，透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内而大分子则保留在袋内样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定防止血液凝固防止血液凝固红细胞洗涤红细胞洗涤血红蛋白的释放血红蛋白的释放去除分子质量较小的杂质去除分子质量较小的杂质（4 4）然后通过）然后通过凝胶色谱法凝胶色谱法将样品进一步将样品进一步纯化纯化，最后经最后经SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进行纯度鉴定纯度鉴定。样品纯化的目的是样品纯化的目的是 _ _ 。血红蛋白有什么特点？血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈红色，在凝胶色谱分离时，可以通过血红蛋白呈红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察观察颜色颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后Thank You在别人的演说中思考，在自己的故事里成长Thinking In Other PeopleS Speeches，Growing Up In Your Own Story讲师：XXXXXX XX年XX月XX日