专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离教学目标教学目标:1、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法素的微生物的实验方法下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A. B.C. D.C兔、牛等兔、牛等草食性动物草食性动物的肠胃中的共生微生物可的肠胃中的共生微生物可合成纤维素酶分解纤维素。合成纤维素酶分解纤维素。蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；人不能消化纤维素。人不能消化纤维素。52021/3/11取二支取二支20mL20mL的试管的试管纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？的作用是什么？62021/3/11( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样? 培养的目的培养的目的? ? 选择培养基的选择培养基的特点特点? ?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红刚果红染色法染色法产生透产生透明圈明圈92021/3/11 课题课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得得到菌落。到菌落。本课题通过本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。骤基本一致。 旁栏思考旁栏思考1 本实验的流程与课题本实验的流程与课题2 2中的实中的实验流程有哪些异同？验流程有哪些异同？ 选择纤维素丰富的环境选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于获得目的微生物的几率要高于普通环境普通环境旁栏思考旁栏思考2 取样的环境是怎样的，作出这取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？种选择的理由是什么？根据根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；【资料一资料一】土壤取样土壤取样 人工设置适宜环境，使纤维素人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。分解菌相对聚集。 将纸埋于深约将纸埋于深约10cm的腐殖土的腐殖土壤中。壤中。旁栏思考旁栏思考3将滤纸埋在土壤中有什么作用？将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。样品中分离所需要的微生物。 选择培养的选择培养的目的：目的：制备选择培养基：制备选择培养基：操作：操作： 将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震震荡培养荡培养12天，直至培养液变浑浊。天，直至培养液变浑浊。也可重复也可重复选择培养。选择培养。【资料二资料二】选择培养选择培养152021/3/11培养基成分分析培养基成分分析162021/3/11A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 说明：说明：说明：说明：分析分析分析分析“ “纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方” ”可知，该可知，该可知，该可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。172021/3/11（2）若设置一个对照实验说明选择培养）若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将的作用，应控制的变量是将_改为改为_。C C C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？葡萄糖葡萄糖纤维素粉纤维素粉用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基182021/3/11【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应（后置染色法）红进行颜色反应（后置染色法）方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红（前置染色法）（前置染色法）漂洗作用漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这这样就留下大大小小的透明圈样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解大的透明圈当然分解纤维素的能就强。纤维素的能就强。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？192021/3/11颜色反应基颜色反应基本上是纤维本上是纤维素分解菌的素分解菌的作用作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发刚果红会使菌落之间发生混杂生混杂操作简便操作简便不存在菌落不存在菌落混杂问题混杂问题 产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，产生模糊透明圈， 有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足思考：这两种方法各有哪些优点与不足方法一：方法一：先先培养微生物，培养微生物，再加入刚果再加入刚果红进行颜色红进行颜色反应反应方法二：方法二：在在倒平板时就倒平板时就加入刚果红加入刚果红在选择培养的条件下，可以使那些能够适应在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到制，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用的作用旁栏思考旁栏思考4为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物所需的微生物？四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同的分离结果。242021/3/11 1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行 _实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。发酵。2.2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 五、课题延伸五、课题延伸252021/3/11分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结262021/3/11将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养,浓缩所需微生物浓缩所需微生物272021/3/11在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法282021/3/11