实验一实验一 细菌的形态细菌的形态结构观察和染色结构观察和染色2021/6/301目目 的的 要要 求求u观察细菌菌落的特征。观察细菌菌落的特征。u掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。及操作步骤。u在油镜下观察细菌个体的形态在油镜下观察细菌个体的形态。u了解了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。孢、荚膜及鞭毛染色。 2021/6/302奥林帕斯奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜双筒生物显微镜镜筒镜筒物镜转换器物镜转换器载物台载物台载物台调节纽载物台调节纽粗调节器粗调节器细调节器细调节器电源电源光强调节钮光强调节钮孔径光阑孔径光阑视场光阑视场光阑双筒目镜双筒目镜摄像头摄像头物镜物镜镜座镜座镜臂镜臂荧光发射装置荧光发射装置2021/6/303奥林帕斯生物显微镜的使用方法奥林帕斯生物显微镜的使用方法1.接通电源。接通电源。2.打开主开关。打开主开关。3.转动光强调节钮，使亮度适中。转动光强调节钮，使亮度适中。4.把标本固定在载物台上。把标本固定在载物台上。5.用用低低倍倍物物镜镜，旋旋转转粗粗调调和和微微调调来进行对焦。来进行对焦。6.调节双目镜筒间距和视度差。调节双目镜筒间距和视度差。7.再适当调节照明度。再适当调节照明度。8.使焦点正确地对准标本。使焦点正确地对准标本。8.调节孔径光阑。调节孔径光阑。9.依次用低、中、高倍镜观察。依次用低、中、高倍镜观察。10.油油镜镜观观察察：高高倍倍镜镜下下找找到到清清晰晰的的物物象象后后，下下降降载载物物台台，在在标标本本中中央央滴滴一一滴滴香香柏柏油油，使使油油镜镜镜镜头头浸浸入入香香柏柏油油中中，再再细细调调至至看看清物象为止。清物象为止。11.换换片片：另另换换新新片片，必必须须从从第第9条条开开始始操操作。作。 12.观观察察完完毕毕，下下降降载载物物台台，取取下下载载物物台台上上的的载载玻玻片片，将将4的的目目镜镜对对准准载载物物台台，再再用用擦擦镜镜纸纸擦擦去去镜镜头头上上的的油油，然然后后用用擦擦镜镜纸纸沾沾取取少少量量乙乙醇醇/水水擦擦去去残残留留的的油油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。水。13.用用毕毕复复原原：先先将将电电压压调调节节旋旋钮钮复复原原，关关闭主开关，切断电源。闭主开关，切断电源。2021/6/304显微镜保养和使用中的注意事项显微镜保养和使用中的注意事项1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件, ,以免损坏。以免损坏。2.2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。3.3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。免压碎玻片或损伤镜面。4.4.光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。害，并且无法进行图像采集。5.5.观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。时聚焦。6.6.观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。2021/6/305油镜使用的原理油镜使用的原理 u油镜，即油浸接物镜。油镜，即油浸接物镜。u当当光光线线由由反反光光镜镜通通过过玻玻片片与与镜镜头头之之间间的的空空气气时时，由由于于空空气气与与玻玻片片的的密密度度不不同同，使使光光线线受受到到曲曲折折，发发生生散散射，降低了视野的照明度。射，降低了视野的照明度。u若若中中间间的的介介质质是是一一层层油油（其其折折射射率率与与玻玻片片的的相相近近），则则几几乎乎不不发发生生折折射射，增增加加了了视视野野的的进进光光量量，从从而而使物象更加清晰。使物象更加清晰。2021/6/306基基 本本 原原 理理 (一一)简单染色法原理简单染色法原理(二二)革兰氏染色法原理革兰氏染色法原理(三三)抗酸染色原理抗酸染色原理(四四)芽孢染色原理芽孢染色原理(五五)荚膜染色原理荚膜染色原理(六六)鞭毛染色原理鞭毛染色原理 2021/6/307染色剂和染色原理染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：2021/6/308实验内容实验内容（简单染色的方法和步骤）（简单染色的方法和步骤）涂片涂片自然干燥自然干燥微火固定微火固定染色染色l min冲洗冲洗吸干吸干镜检镜检2021/6/309实验内容实验内容（革兰氏染色的方法（革兰氏染色的方法和步骤）和步骤）涂片，干燥、固定涂片，干燥、固定草酸铵结晶紫染液染色草酸铵结晶紫染液染色lmin，用，用水冲洗水冲洗用革氏碘液媒染用革氏碘液媒染lmin，用水冲去，用水冲去碘液碘液用用95乙醇脱色乙醇脱色10-30s，至乙醇，至乙醇液不呈现紫色液不呈现紫色蕃红染液复染蕃红染液复染lmin，用水冲洗，用水冲洗吸干并镜检吸干并镜检2021/6/3010实验内容实验内容（了解了解抗酸染色的方法和步骤）抗酸染色的方法和步骤）1制片制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80恒温水浴恒温水浴3h杀死菌体。取杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。菌悬液涂片，自然干燥。2染色染色 滴加石炭酸复红染液滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热现，不断补充染液，加热810min，弃染液。，弃染液。3脱色脱色 用用3盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。4水洗水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。5复染复染 加美蓝染液染加美蓝染液染lmin。6水洗后自然干燥、镜检水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。蓝色。2021/6/3011实验内容实验内容（了解了解芽孢染色的方法和步骤）芽孢染色的方法和步骤）u孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6的孔雀绿的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色饱和水溶液，间断加热染色10min后后(注意添加染液注意添加染液勿使涂片干燥勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用，用水冲洗。再用0.5蕃红液染色蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。养体呈现红色。2021/6/3012实验内容实验内容（了解了解荚膜染色的方法和步骤）荚膜染色的方法和步骤）1制片制片 加加一一滴滴6葡葡萄萄糖糖水水溶溶液液于于载载片片一一端端，挑挑取取少少量量胶胶质质芽芽孢孢杆杆菌菌与与其其混混合合，再再加加一一滴滴黑黑色色素素充充分分混混匀匀。用用推推片片法法制制片片，将将菌菌液液铺铺成成薄薄层层，自自然然干干燥。燥。2固定固定 滴加滴加l2滴无水乙醇覆盖涂片，固定滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。，自然干燥。3染色，冲洗染色，冲洗 滴加结晶紫，染色滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。u有有荚荚膜膜的的菌菌、菌菌体体呈呈紫紫色色，背背景景灰灰黑黑色色，荚荚膜膜不不着着色色呈呈无无色色透透明明圈圈。无无荚荚膜膜的的菌菌，由由于于干干燥燥菌菌体体收收缩缩，菌菌体体四四周周也也可可能能出出现现一一圈圈狭狭窄窄的的不不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。2021/6/3013实验内容实验内容（了解了解鞭毛染色的方法和步骤）鞭毛染色的方法和步骤）1载片的清洗：将载片洗净浸泡在载片的清洗：将载片洗净浸泡在95乙醇中备用。乙醇中备用。2实实验验菌菌种种的的准准备备：将将枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌在在新新制制备备的的肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨斜斜面面培培养养基基上上(斜斜面面下下部部要要有有少少量量冷冷凝凝水水)，连连续续移移种种34次次，每每次次培培养养1218h，最后一次培养最后一次培养1216h。3制制片片：擦擦干干载载片片，在在载载片片一一端端加加一一滴滴蒸蒸馏馏水水，用用接接种种环环挑挑取取少少许许菌菌苔苔底底部部有有水水部部分分的的菌菌体体(注注意意不不要要挑挑出出培培养养基基)，将将接接种种环环悬悬放放在在水水滴滴中中片片刻刻，将将载载片片稍稍倾倾斜斜，使使菌菌液液随随水水滴滴缓缓缓缓流流到到另另一一端端，可可再再返返转转一一次次使使菌菌液液流流经面积扩大，然后放平，自然干燥。经面积扩大，然后放平，自然干燥。4染染色色（利利夫夫森森氏氏染染色色法法） ：用用蜡蜡笔笔将将涂涂菌菌区区圈圈起起，滴滴加加染染液液，过过数数分分钟钟后后，当当染染液液的的1/2以以上上区区域域表表面面出出现现金金属属光光泽泽膜膜时时，用用水水轻轻轻轻将将金金属属膜膜及染液冲洗干净，自然干燥。及染液冲洗干净，自然干燥。u镜镜检检镜镜检检时时应应在在涂涂片片上上按按顺顺序序进进行行观观察察，经经常常是是在在部部分分涂涂片片区区的的菌菌体体染染出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。2021/6/3014实实 验验 材材 料料 (一一)菌种菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。(二二)染液染液1.简单染色：草酸铵结晶紫染液。简单染色：草酸铵结晶紫染液。2.革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95乙醇、蕃红染液。乙醇、蕃红染液。2021/6/3015实实 验验 材材 料料 (三三)标本标本细菌三型、细菌三型、四联球菌、四联球菌、荚膜、芽孢。荚膜、芽孢。(四四)其他物品其他物品无菌水、显微镜、载片、无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、盖玻片、酒精灯、吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。2021/6/3016实验内容实验内容 (一一) 成片观察成片观察(1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和螺旋菌的形态。螺旋菌的形态。(2)观察四联球菌的形态及观察四联球菌的形态及排列排列方式。方式。(3)观察观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮菌的荚膜的形态。菌的荚膜的形态。2021/6/3017实验内容实验内容 (二二)观观察察平平板板上上的的细细菌菌菌菌落落，识识别别大大肠肠杆杆菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌和和金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌的菌落特征。的菌落特征。u注注意意菌菌落落的的形形状状、高高度度、大大小小、颜颜色色，是是否否湿湿润润、光光泽泽、透透明明度度、边边缘缘状状况况等等。等等。2021/6/3018实验内容实验内容 (三三)简单染色简单染色(只做只做金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌)。(四四)革革兰兰氏氏染染色色法法：大大肠肠杆杆菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆菌和金黄色葡萄球菌。杆菌和金黄色葡萄球菌。2021/6/3019实验报告内容实验报告内容(一一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。(二二)绘绘图图：画画出出大大肠肠杆杆菌菌、枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌的的细细胞胞形形态态图。图。(三三)记记录录3种种菌菌的的革革兰兰氏氏染染色色结结果果；分分辨辨出出革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌或或阴阴性性菌菌。如如果染色结果不理想，请分析原因。果染色结果不理想，请分析原因。微生物名称微生物名称形状形状大小大小含水程度含水程度菌落菌落颜色色透明度透明度与培养基与培养基结合程度合程度嗅味嗅味大大肠杆菌杆菌枯草芽枯草芽孢杆菌杆菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2021/6/3020思考题思考题u(一一)为为什什么么必必须须用用培培养养24h以以内内的的菌菌体体进进行行革革兰兰氏氏染染色？色？u(二二)要要得得到到正正确确的的革革兰兰氏氏染染色色结结果果，必必须须注注意意哪哪些些操操作？哪一步是关键步骤？为什么？作？哪一步是关键步骤？为什么？2021/6/3021实验一 结束 请交报告！2021/6/3022 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！