毛细管电泳法毛细管电泳法在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电极方向迁移的现象，称之为电泳电泳. .由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。不同，可实现分离。 193 1930 0年，年，TiselinsTiselins( (瑞典瑞典) )将蛋白质混合液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，由溶液电泳，第一次第一次将人血清提取的蛋白质混将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和合液分离出白蛋白和、球蛋白；发现球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 1948 1948年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖；经典电泳分析经典电泳分析 traditional electrophoresis 利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。法和技术叫电泳法或电泳技术。 按按形状分类形状分类：U U型管电泳、柱状电泳、板电泳；型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按按载体分类载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。法与其他分析相比。 1981 1981年，年，JorgensonJorgenson和和LuckasLuckas，用用7575m m内径石英毛细管内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达进行电泳分析，柱效高达4040万万/ /m m，促进电泳技术发生了根本促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与变革，迅速发展成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分析相媲美的崭新的分离分析技术技术高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCEHPCE）。高效毛细管电泳高效毛细管电泳 high performance capillary electrophoresis高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： mmmm内径的毛细管柱；内径的毛细管柱； 二是采用了高达数千伏的电压。二是采用了高达数千伏的电压。 毛毛细细管管的的采采用用使使产产生生的的热热量量能能够够较较快快散散发发，大大大大减减小小了了温度效应，使电场电压可以很高。温度效应，使电场电压可以很高。 电电压压升升高高，电电场场推推动动力力大大，又又可可进进一一步步使使柱柱径径变变小小，柱柱长增加，长增加， 高高效效毛毛细细管管电电泳泳的的柱柱效效远远高高于于高高效效液液相相色色谱谱，理理论论塔塔板板数高达几十万块数高达几十万块/ /米，特殊柱子可以达到数百万。米，特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳的特点高效毛细管电泳的特点1.1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 minmin内分离了内分离了2424种阳离子；分离柱效：种阳离子；分离柱效：10105 510107 7/ /m m理论塔板数；理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；进样量极少，水介质中进行； 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； 毛细管电泳基础理论毛细管电泳基础理论电泳电泳是在电场作用下带电粒子在缓冲液中的定是在电场作用下带电粒子在缓冲液中的定向移动向移动电泳淌度电泳淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。淌度不同是电泳分离的基础。1.1.绝对淌度绝对淌度( (absolute mobility)absolute mobility)abab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.2.有效淌度有效淌度( (effective mobility)effective mobility)effeff 实际溶液中的淌度实际溶液中的淌度( (实验中测定的实验中测定的) )。 effeff=a ai ii i a ai i 溶质溶质i i 的解离度；的解离度；i i 溶质溶质i i 在解离状态下的绝对在解离状态下的绝对淌度淌度3.3.表观淌度表观淌度 apap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： u uapap= =apap E E apap= = e effff+ + o os s 电泳淌度电泳淌度电渗现象与电渗流电渗现象与电渗流当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液- -固界面形固界面形成双电层，二者之间存在电位差。成双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫表面的移动的现象叫电渗现象电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液电渗现象中整体移动着的液体叫体叫电渗流电渗流（electroosmotic electroosmotic flow flow ，简称简称EOFEOF）。）。 HPCEHPCE中的电渗现象与电渗流中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3pH3时，表面电离成时，表面电离成- -SiOSiO- -, ,管内管内壁带负电荷，形成双电层。壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度的溶液整体向负极移动，速度u uosos。电渗流的大小电渗流的大小电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度u uosos表示，取决于电渗表示，取决于电渗淌度淌度o os s和电场强度和电场强度E E。即即 u uosos = = o os s E E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的ZetaZeta电势，电势，即即o os s = = 0 00 0真空介电常数；真空介电常数；介电常数；介电常数；毛细毛细管壁的管壁的ZetaZeta电势。电势。电渗流的方向电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法： （1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；表面键合阳离子基团； （2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。HPCEHPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。电渗流速度正比于工作电压。 不同材料毛细管的表面电不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大荷特性不同，产生的电渗流大小不同；小不同；（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液对于石英毛细管，溶液pHpH增高时，表面电离多，电荷密增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁度增加，管壁zetazeta电势增大，电渗流增大，电势增大，电渗流增大，pH=7pH=7，达到最大达到最大； pH3pH 电泳电泳时时, ,阴离子在阴离子在负极最后流出负极最后流出, ,在这种情况下在这种情况下, ,不但不但可以按类分离可以按类分离, ,同种类离子由于同种类离子由于差差速迁移速迁移被相互分离。被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；操作条件操作条件1. 1. 电压电压2. 2. 缓冲液的种类缓冲液的种类较好的缓冲能力较好的缓冲能力在检测波长的吸收低在检测波长的吸收低自身的淌度低，即分子大而荷电小自身的淌度低，即分子大而荷电小合适的合适的pH, pH, 与被测无的等电点相差与被测无的等电点相差11个个pHpH单位单位尽量使用酸性缓冲液，减少吸附和电渗流尽量使用酸性缓冲液，减少吸附和电渗流4. 4. 缓冲液的缓冲液的pHpH 5. 5. 添加剂添加剂3. 3. 缓冲液的浓度缓冲液的浓度 1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带电的胶束。 在电场力的作在电场力的作用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中移动。移动。胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 2. 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且u u电渗流电渗流 u u电泳电泳 ，负电胶束以较慢的，负电胶束以较慢的速度向负极移动；速度向负极移动；4.4.可用来分离中性物质，扩可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用展了高效毛细管电泳的应用范围；范围； 5.5.色谱与电泳分离模式的结色谱与电泳分离模式的结合。合。 3. 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；组分与胶束结合的较牢，流出时间长；毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/ /质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模模式很难分离，采用式很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。 特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。毛细管电色谱毛细管电色谱整合了毛细管电泳与微径液相整合了毛细管电泳与微径液相色谱的优点，大大提高了样品色谱的优点，大大提高了样品的分离能力，的分离能力，代表了分析学界代表了分析学界高效微分离的趋势，尤其适用高效微分离的趋势，尤其适用于复杂生物及化学体系的研究于复杂生物及化学体系的研究样品在毛细管柱中的保留行为样品在毛细管柱中的保留行为同时受到同时受到电泳电泳及其在流动相与及其在流动相与固定相之间固定相之间分配系数分配系数的影响的影响pCEC对被分离样品细微之处对被分离样品细微之处的分辩能力得到极大的提高的分辩能力得到极大的提高毛细管电泳仪毛细管电泳仪 电压：电压：0 03030kVkV； 分离柱不涂敷任何固定液；分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：（可检测到：1010-19-191010-21-21 mol/Lmol/L）仪器流程与主要部件仪器流程与主要部件（1 1）0 030 30 kV kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3 3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4 4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%0.1%；（5 5）电源极性易转换；）电源极性易转换；2. 2. 毛细管柱毛细管柱 （1 1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；性能差； （2 2）规格：内径）规格：内径20207575m m，外径外径350350400400m m；长长度度=1=1m m 化学惰性，机械稳定性好；化学惰性，机械稳定性好；4. 4. 检测器检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化； 类型类型 检测限检测限/ /mol mol 特点特点紫外紫外- -可见可见 10 10-13-131010-15-15 加二极管阵列，光谱信息加二极管阵列，光谱信息荧光荧光 10 10-15-151010-17 -17 灵敏度高，样品需衍生灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光激光诱导荧光 10 10-18-181010-20 -20 灵敏度极高，样品需衍生灵敏度极高，样品需衍生电导电导 10 10-18-181010-19 -19 离子灵敏，需专用的装置；离子灵敏，需专用的装置；毛细管电泳的进样方式毛细管电泳的进样方式 1. 1. 流体力学进样方式流体力学进样方式 （1 1）进样端加压）进样端加压 （2 2）出口端抽真空）出口端抽真空 （3 3）虹吸进样）虹吸进样进样量：毛细管长度的进样量：毛细管长度的1%-2%1%-2%；纳升级、非常小；纳升级、非常小毛细管一端插入样品瓶，加电压；毛细管一端插入样品瓶，加电压；2. 2. 电动进样方式电动进样方式 进样不均进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；量大； 离子丢失离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；去； 特别适合黏度大的试样特别适合黏度大的试样；3. 3. 扩散进样扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。试样通过扩散作用进入分离柱端口处。应用应用离子分析离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一迁移方向和电渗流方向一致；致；minmin内分离了内分离了2424种金属离种金属离子；子； 阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度；阴离子分析阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率反、速度接近，分析时间长、效率低；低； 质量小、电荷密度大的离子如：质量小、电荷密度大的离子如：SOSO4 4-2-2、ClCl- -、F F- -等，电泳速率大于电等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；检测；minmin内分离内分离3636种阴离子；阴极进样，种阴离子；阴极进样，阳极检测；阳极检测；离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析；药物分析药物分析 检测体液或细胞中检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；病的辅助手段； 采用毛细管区带电采用毛细管区带电泳方式，在泳方式，在1111minmin内内分离分离1717种药物；种药物；氨基酸与蛋白质分析氨基酸与蛋白质分析采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；