第十章第十章 植物遗传转化技术和方法植物遗传转化技术和方法第一节第一节 植物遗传转化的发展植物遗传转化的发展第二节第二节 根癌农杆菌介导的植物转基因根癌农杆菌介导的植物转基因第三节第三节 基因枪介导的植物转基因基因枪介导的植物转基因第四节第四节 其他植物转基因技术其他植物转基因技术本章主要内容本章主要内容第第10章章 植物遗传转化技术和方法植物遗传转化技术和方法本章教学目的与要求本章教学目的与要求l农杆菌农杆菌T-DNAT-DNA导入植物基因组整个过程导入植物基因组整个过程l影响影响T-DNAT-DNA转移的主要因素转移的主要因素l农杆菌介导的转基因的过程农杆菌介导的转基因的过程l基因枪法转基因的优缺点基因枪法转基因的优缺点第第10章章 植物遗传转化技术和方法植物遗传转化技术和方法第一节第一节 植物遗传转化的发展植物遗传转化的发展l尝试阶段：尝试阶段：2020世纪世纪60-7060-70年代年代l发展阶段：发展阶段：2020世纪世纪80-9080-90年代年代 物种的增加物种的增加 转基因方法的改进及创新转基因方法的改进及创新l转基因商业化发展阶段转基因商业化发展阶段 大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等九种作物的转基因品种投入了商业化生产木瓜等九种作物的转基因品种投入了商业化生产 植物遗传转化的方法植物遗传转化的方法l（1）间接转化法）间接转化法农杆菌介导转化法农杆菌介导转化法 l（2）直接转化法）直接转化法l A、 基因枪转化法基因枪转化法l B、 电击法电击法l C、花粉管通道法、花粉管通道法l D、 PEG介导基因转化法介导基因转化法第二节第二节 根癌农杆菌介导的植物转基因根癌农杆菌介导的植物转基因根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤一、根癌农杆菌的生物学特性一、根癌农杆菌的生物学特性l根癌农杆菌属于农杆菌属的革兰氏阴性菌，最适生长温度为根癌农杆菌属于农杆菌属的革兰氏阴性菌，最适生长温度为25-3025-30，最适，最适pHpH范围范围6.0-9.06.0-9.0l根癌农杆菌广泛侵染双子叶植物，据不完全统计，约有根癌农杆菌广泛侵染双子叶植物，据不完全统计，约有9393属属643643种双子叶植物种双子叶植物对根癌农杆菌敏感对根癌农杆菌敏感l裸子植物同样具有敏感性，能诱发肿瘤裸子植物同样具有敏感性，能诱发肿瘤l近年研究显示：农杆菌对有些单子叶植物也有侵染能力近年研究显示：农杆菌对有些单子叶植物也有侵染能力二、常用的农杆菌菌株：二、常用的农杆菌菌株：菌株类型菌株类型菌株菌株致瘤性致瘤性染色体背景染色体背景所含质粒所含质粒胭脂碱型胭脂碱型C58致瘤致瘤C58pTiC58ABI非致瘤非致瘤C58pTiMP90RKA208SE致瘤致瘤C58PTiT37-SEMOG301非致瘤非致瘤C58PTiC58/pBR322LBA958非致瘤非致瘤C58PTiC58GV3850非致瘤非致瘤C58pTiGV3850T37致瘤致瘤T37pTi37章鱼碱型章鱼碱型Ach5致瘤致瘤Ach5pTiAch5LBA4404非致瘤非致瘤Ach5pTiAL4404MOG101非致瘤非致瘤C58MOG101/pMOG410农杆碱型或琥珀碱型农杆碱型或琥珀碱型A281超致瘤超致瘤C58pTiB0542EHA101超致瘤超致瘤C58pTiB0542非致瘤非致瘤C58pTiB0542EHA105超致瘤超致瘤C58pTiB0542非致瘤非致瘤C58pTiB0542农杆菌农杆菌T-DNAT-DNA导入植物基因组整个过程：导入植物基因组整个过程： 三、农杆菌转化的分子机理三、农杆菌转化的分子机理（1 1）农杆菌对受体的识别）农杆菌对受体的识别（2 2）农杆菌附着到植物受体细胞）农杆菌附着到植物受体细胞（3 3）诱导启动毒性区基因表达）诱导启动毒性区基因表达（4 4）类似接合孔复合体的合成和装配）类似接合孔复合体的合成和装配（5 5）T-DNAT-DNA的加工和转运的加工和转运（6 6）T-DNAT-DNA的整合的整合 农杆菌对植物受体识别农杆菌对植物受体识别的基础是细菌的趋化性：的基础是细菌的趋化性：受伤植物组织产生的一受伤植物组织产生的一些糖类、氨基酸类、酚些糖类、氨基酸类、酚类物质，菌株对这些化类物质，菌株对这些化学物质产生趋向性反应。学物质产生趋向性反应。(1) (1) 农杆菌对受体的识别农杆菌对受体的识别 （2 2）农杆菌附着到受体细胞）农杆菌附着到受体细胞根癌农杆菌附着于植物细胞是根癌农杆菌附着于植物细胞是T-DNAT-DNA加工和转移的前提加工和转移的前提植物细胞表面的农杆菌附着位点是有限的，根癌农杆菌和发根农杆菌的附着位植物细胞表面的农杆菌附着位点是有限的，根癌农杆菌和发根农杆菌的附着位点不同。每个植物细胞可以同时附着多种不同的农杆菌菌株，但仅仅只能被一点不同。每个植物细胞可以同时附着多种不同的农杆菌菌株，但仅仅只能被一个或少数几个菌株所转化。个或少数几个菌株所转化。只有在创伤部位生存了只有在创伤部位生存了8 81616小时之后的小时之后的菌株才能诱发肿瘤，菌株才能诱发肿瘤，这段时间称为细胞调这段时间称为细胞调节期。在调节期内，农杆菌会产生细微的节期。在调节期内，农杆菌会产生细微的纤丝而将自身缚附在植物细胞壁表面。纤丝而将自身缚附在植物细胞壁表面。（3 3）诱导和启动毒性区基因表达）诱导和启动毒性区基因表达 l当农杆菌在生长培养基上大量繁殖时，当农杆菌在生长培养基上大量繁殖时，所有的所有的T T区基因均处于非转录活性状区基因均处于非转录活性状态态l当把植物受伤细胞提取液加入培养基当把植物受伤细胞提取液加入培养基时，所有的时，所有的T T区基因均被诱导和活化区基因均被诱导和活化l植物细胞分泌物（糖、氨基酸和酚类物质等）既是农杆菌定向附着到植物细胞表面的物质，也能诱导和启动毒性区基因的表达，为T-DNA的转运做准备（4 4）类似接合孔复合体的合成和装配）类似接合孔复合体的合成和装配lT-DNAT-DNA的转运的第一步是通过细菌细胞膜的转运的第一步是通过细菌细胞膜l农杆菌必须形成一个跨膜通道农杆菌必须形成一个跨膜通道l现在认为，现在认为，VirBVirB蛋白蛋白可能充当了这个角色，这些蛋白可能一起在膜可能充当了这个角色，这些蛋白可能一起在膜上形成一种类似于细菌结合转移时所必需的结构，即接合孔，上形成一种类似于细菌结合转移时所必需的结构，即接合孔，T-T-DNADNA通过这种孔由农杆菌进入植物细胞通过这种孔由农杆菌进入植物细胞（5 5）T-DNAT-DNA的加工和转运的加工和转运lVirVir基因操纵子被激活后，基因操纵子被激活后，VirD1VirD1和和VirD2VirD2蛋白在边界重复序列的特定位蛋白在边界重复序列的特定位点上点上（一般认为在末端第（一般认为在末端第3 3和第和第4 4碱基处）碱基处）切下单链切下单链T-DNAT-DNAl同时，同时，T T链的链的5 5端与端与VirD2VirD2蛋白共价结合蛋白共价结合，以免，以免5 5端受到端受到5 5外切酶的外切酶的攻击攻击lVirE2VirE2蛋白与单链蛋白与单链T-DNAT-DNA非共价结合非共价结合，形成细长的核酸，形成细长的核酸蛋白质丝，抵抗蛋白质丝，抵抗3 3和和5 5外切核酸酶及内切核酸酶的降解外切核酸酶及内切核酸酶的降解l加工好的单链加工好的单链T-DNAT-DNA复合体穿过由复合体穿过由VirBVirB蛋白形成的类接合孔进入植物受蛋白形成的类接合孔进入植物受体细胞，然后由体细胞，然后由VirD2VirD2和和VirE2VirE2的核导向作用进入植物细胞核的核导向作用进入植物细胞核（6 6）T-DNAT-DNA的整合的整合当单链的当单链的T-DNAT-DNA转移到植物细胞之后，在有关的转移到植物细胞之后，在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，便会合成出互补植物细胞酶体系的催化作用下，便会合成出互补链形成双链形式的链形成双链形式的T-DNAT-DNA分子。分子。 在一系列酶的参在一系列酶的参与下整合进植物基因组。与下整合进植物基因组。 这种整合是一种随机的：这种整合是一种随机的：优先整合到转录活跃的植物基因位点；优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNAT-DNA与植物与植物DNADNA连接处富含连接处富含A A、T T碱基；碱基；植物植物DNADNA上的插入位点与上的插入位点与T-DNAT-DNA边界序列有一定程边界序列有一定程度的同源性度的同源性 四、四、T-DNAT-DNA转移的影响因素转移的影响因素（1 1）农杆菌菌株）农杆菌菌株一般而言，三类农杆菌菌株的侵染力的排列顺序为：农杆碱型一般而言，三类农杆菌菌株的侵染力的排列顺序为：农杆碱型（琥珀碱型）菌株（如（琥珀碱型）菌株（如A281A281） 胭脂碱型菌株（胭脂碱型菌株（C58C58） 章鱼碱型菌章鱼碱型菌株（株（Ach5Ach5，LBA4404LBA4404）棉花中棉花中EHA105EHA105（农杆碱型）（农杆碱型）LBA4404LBA4404（章鱼碱性）（章鱼碱性）（2 2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期高侵染活力的菌株一般处在对数生长期，也即高侵染活力的菌株一般处在对数生长期，也即0.30.31.0 OD1.0 OD范围。范围。1.0 OD1x101.0 OD1x108 8 cell/mlcell/ml。 一般用一般用0.3 0.3 1.0OD1.0OD农杆菌菌液接种植物材料农杆菌菌液接种植物材料（3 3）基因活化的诱导物）基因活化的诱导物VirVir区基因的活化是农杆菌区基因的活化是农杆菌TiTi质粒转移的先决条件质粒转移的先决条件酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿和低酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸、磷酸饥饿和低pHpH都影响都影响VirVir区基因的活化。区基因的活化。常用的诱导物：乙酰丁香酮（常用的诱导物：乙酰丁香酮（ASAS）和羟基乙酰丁香酮（）和羟基乙酰丁香酮（HO-ASHO-AS）（4 4）外植体的类型和生理状态）外植体的类型和生理状态19971997年年VillemontVillemont研究指出，转化只发生在细胞分裂的一个研究指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短时期内，只有处于细胞分裂较短时期内，只有处于细胞分裂S S期的细胞才具有被外源基期的细胞才具有被外源基因转化的能力。因此，细胞具有分裂能力是转化的基本条件。因转化的能力。因此，细胞具有分裂能力是转化的基本条件。一般来说，发育早期（幼年期）的组织细胞转化能力较强。一般来说，发育早期（幼年期）的组织细胞转化能力较强。（5 5）外植体的预培养）外植体的预培养每种外植体均有其最佳预培养时间，时间太长反而降低外植体的每种外植体均有其最佳预培养时间，时间太长反而降低外植体的转化率，转化率，2 23 3天为宜天为宜外植体的预培养有以下作用：外植体的预培养有以下作用：l促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源DNADNA状态状态l田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离体培养的条件体培养的条件l有利于外植体能与培养基平整接触：外植体在开始培养过程中，由于有利于外植体能与培养基平整接触：外植体在开始培养过程中，由于其迅速生长而出现上翘和卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基致使其迅速生长而出现上翘和卷曲，使农杆菌的接种切面离开培养基致使农杆菌生长受抑制而实现对受体的转化农杆菌生长受抑制而实现对受体的转化（6 6）外植体的接种及共培养）外植体的接种及共培养外植体的接种外植体的接种: : 指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。种类（种类（materials）接种时间（接种时间（min）接种菌液浓度（接种菌液浓度（OD）小麦未成熟胚和胚性愈伤组织小麦未成熟胚和胚性愈伤组织600.51.0水稻胚性愈伤组织水稻胚性愈伤组织151.01.5玉米未成熟胚玉米未成熟胚101.0棉花下胚轴棉花下胚轴100.31.0大豆子叶节大豆子叶节10300.30.6农农杆杆菌菌与与外外植植体体共共培培养养在在整整个个转转化化过过程程中中非非常常重重要要，农农杆杆菌菌的的附附着着，T-DNAT-DNA的转移和整合都在这个时期内完成的转移和整合都在这个时期内完成农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化，只有在创伤部位生存农杆菌附着外植体表面后并不能立刻转化，只有在创伤部位生存8 816h16h之后之后的菌株才能诱发肿瘤。因此，共培养时间必须长于的菌株才能诱发肿瘤。因此，共培养时间必须长于8 816h16h。共培养：指农杆菌与外植体共同培养的过程。共培养：指农杆菌与外植体共同培养的过程。五、转化细胞的选择培养五、转化细胞的选择培养转转化化细细胞胞和和非非转转化化细细胞胞在在非非选选择择培培养养基基上上生生长长存存在在着着竞竞争争，而而且且往往往往非非转转化化细细胞胞在在这这种种条条件件下下生生长长更更具具优优势势，转化难以成功。转化难以成功。一一般般在在转转化化载载体体构构建建时时就就应应该该考考虑虑后后期期转转化化细细胞胞的的选选择择问问题题。多多在在转转化化载载体体上上加加入入一一个个选选择择标标记记基基因因。这这样样，在在选选择择培培养养中中加加入入选选择择试试剂剂可可以以抑抑制制非非转转化化细细胞胞的的生生长长，而对转化细胞的生长无抑制作用，从而起到选择效果。而对转化细胞的生长无抑制作用，从而起到选择效果。六、各种农杆菌转化技术六、各种农杆菌转化技术l（一）整株感染（一）整株感染l（二）叶盘法（二）叶盘法l（三）原生质体法（三）原生质体法l（四）替代性转化法（四）替代性转化法七、农杆菌转化的具体技术七、农杆菌转化的具体技术（一）农杆菌侵染拟南芥（一）农杆菌侵染拟南芥花序花序的转化方法的转化方法l农杆菌菌株农杆菌菌株EHA105，卡那霉素选择，卡那霉素选择l1. 在营养土中种植一定数量的拟南芥，至花期在营养土中种植一定数量的拟南芥，至花期。l2. 农杆菌的活化：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管农杆菌的活化：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，在冰上融化，接菌于接菌于YEP液体培养基中，液体培养基中，28摇菌约摇菌约30hr，将活化的菌液按，将活化的菌液按1:400转至卡娜霉素和利福平的培转至卡娜霉素和利福平的培养基中，养基中，28摇菌约摇菌约14hr，测，测OD值，值，OD值在值在1.5-3.0时时。收集菌体，用收集菌体，用渗透培养基里（渗透培养基里（1/2MS + 10%蔗糖蔗糖 + 20l Silwet-77），使），使OD为为0.81.0左右可用于转化。左右可用于转化。l进行花序侵染前先剪掉角果和花，然后将拟南芥的花序浸进行花序侵染前先剪掉角果和花，然后将拟南芥的花序浸泡于含农杆菌的渗透培养基里泡于含农杆菌的渗透培养基里2-3分钟，可用吸管轻轻搅拌分钟，可用吸管轻轻搅拌农杆菌浸染缓冲液，以利于转化，浸染结束后将植株平放农杆菌浸染缓冲液，以利于转化，浸染结束后将植株平放于吸水纸上干燥数分钟，以免农杆菌菌液滴落到莲座叶上，于吸水纸上干燥数分钟，以免农杆菌菌液滴落到莲座叶上，同时也避免过高浓度的农杆菌对植株有毒害作用。同时也避免过高浓度的农杆菌对植株有毒害作用。l转化完成后套黑色塑料袋进行暗培养，转化完成后套黑色塑料袋进行暗培养，1天后，揭开塑料袋天后，揭开塑料袋进行光照培养直至角果成熟。进行光照培养直至角果成熟。l收获收获T1代转基因种子进行筛选，得到的阳性转化植株移栽代转基因种子进行筛选，得到的阳性转化植株移栽至营养土中培养。至营养土中培养。（二）、农杆菌转化棉花（二）、农杆菌转化棉花下胚轴下胚轴的方法的方法农杆菌菌株农杆菌菌株LBA4404，卡那霉素选择，卡那霉素选择1.1.农农杆菌杆菌菌株的培养：菌株的培养：2.超低温超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿平皿上划线，上划线，28暗培养暗培养36-48hr，待皿内长出清晰的单菌落，待皿内长出清晰的单菌落，接种于含卡那霉素和利福平的接种于含卡那霉素和利福平的LB培养基中，培养基中，28摇菌摇菌36-48hr，待菌液浑浊，取，待菌液浑浊，取1ml菌液涂布于含卡那霉素和利福平菌液涂布于含卡那霉素和利福平的的LB固体培养基上，固体培养基上，28暗培养暗培养36-48hr，待皿内长出足够，待皿内长出足够的的菌落菌落后后，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL（含（含乙酰丁香酮50mg/L）培养基培养基中，中，28、200rpm摇摇30min，OD值在值在0.5-1.0之间之间即可用于侵染即可用于侵染。2. 2. 无菌苗制备无菌苗制备3. 3. 外植体与农杆菌共培养外植体与农杆菌共培养 取取7d7d左右的棉花无菌苗置于无菌平皿，迅速切成左右的棉花无菌苗置于无菌平皿，迅速切成0.5-0.7cm0.5-0.7cm左右左右的小段，放入农杆菌工程菌液，放置的小段，放入农杆菌工程菌液，放置5-10min5-10min；期间摇动三角瓶；期间摇动三角瓶数次，然后取出下胚轴小段，置于干燥的无菌滤纸上，吸干材数次，然后取出下胚轴小段，置于干燥的无菌滤纸上，吸干材料表面的菌液，料表面的菌液，吹吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基共培养培养基(MS无机盐无机盐+B5有机物有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+葡萄糖葡萄糖30g/l + 琼脂琼脂7.5g/l, pH 5.6 )中，中，19-21, 暗暗培养培养48小时结束共培养。小时结束共培养。4. 4. 将共培养后的材料接入筛选培养基（将共培养后的材料接入筛选培养基（MS无机盐无机盐+B5有机物有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+葡萄糖葡萄糖30g/l + 琼脂琼脂7.5g/l+卡那霉素卡那霉素50mg/l+头孢霉素头孢霉素200mg/l, pH 5.6 )中中，2828暗培养，每三周继暗培养，每三周继代一次代一次5. 5. 将筛选培养基的抗性愈伤组织接入胚状体诱导培养基，将筛选培养基的抗性愈伤组织接入胚状体诱导培养基，2828光光照培养。把诱导产生的胚状体接入胚状体萌发培养基长芽；再进照培养。把诱导产生的胚状体接入胚状体萌发培养基长芽；再进一步置于生根培养基生成完整的转基因植株。一步置于生根培养基生成完整的转基因植株。6. 6. 将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3 35d5d；然后移到自然条；然后移到自然条件下生长，直至成熟。件下生长，直至成熟。（三）农杆菌转化水稻的（三）农杆菌转化水稻的愈伤组织愈伤组织l1.农杆菌的活化：农杆菌的活化：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，冰上融化，YEP平皿上划线，平皿上划线，28暗培养暗培养36-48hr，待皿，待皿内长出清晰的单菌落，内长出清晰的单菌落，接种于含卡那霉素和利福平的接种于含卡那霉素和利福平的LB培养基中，培养基中，28摇菌摇菌6-8hr至至OD=0.5，再将要好的菌以，再将要好的菌以1:1000的比例接种到的比例接种到ABC培养基中，过夜摇菌，取摇好的培养基中，过夜摇菌，取摇好的菌液菌液30ml，离心收集菌液，用，离心收集菌液，用AAM培养基重悬，培养基重悬，OD值值=0.4之间即可用于侵染。之间即可用于侵染。2. 2. 农杆菌与水稻愈伤组织共培养农杆菌与水稻愈伤组织共培养: :取预培养取预培养15d15d的质地均匀健康的胚性愈的质地均匀健康的胚性愈伤组织接入伤组织接入100ml100ml锥形瓶，加入农杆菌菌液，浸泡锥形瓶，加入农杆菌菌液，浸泡30min30min，倒去菌液，用，倒去菌液，用灭菌滤纸上吸干表面菌液，接入共培养培养基灭菌滤纸上吸干表面菌液，接入共培养培养基25 25 ，暗培养，暗培养2 23D3D3. 3. 抗性愈伤的选择与培养：将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗抗性愈伤的选择与培养：将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5 56 6次，次，再加入灭菌水（含再加入灭菌水（含1000mg/l1000mg/l头孢霉素）在头孢霉素）在 25 25 ，120r/min120r/min下摇动下摇动3h 3h ，倒灭菌水，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基，倒灭菌水，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基（2mg/l 500mg/l2mg/l 500mg/l头孢霉素、头孢霉素、200mg/l200mg/l氨苄青霉素、氨苄青霉素、50mg/l50mg/l潮霉素），潮霉素），2525弱光培养弱光培养2020天左右。天左右。4. 4. 植株再生与移栽：将筛选培养基的抗性愈伤组织接入分化培养基，直植株再生与移栽：将筛选培养基的抗性愈伤组织接入分化培养基，直至分化成苗，根系好的再生植株直接移栽，发育不良的可以嫁接移栽至分化成苗，根系好的再生植株直接移栽，发育不良的可以嫁接移栽 。八、农杆菌介导的遗传转化具有以下特点八、农杆菌介导的遗传转化具有以下特点优点：优点：l操作简便操作简便l转化效率高转化效率高l转化机理明确转化机理明确l外源基因多以低拷贝插入、遗传稳定。外源基因多以低拷贝插入、遗传稳定。缺点：缺点：l转化周期长导致体细胞无性系变异严重转化周期长导致体细胞无性系变异严重l基因型依赖性强基因型依赖性强l需要深厚的组织培养基础需要深厚的组织培养基础第三节第三节 基因枪法基因枪法基因枪法（基因枪法（gene gun)gene gun)又称离子枪法、又称离子枪法、微弹轰击法、生物炸弹法微弹轰击法、生物炸弹法一、基因枪转化的基本原理一、基因枪转化的基本原理将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化 二、基因枪转化的优点二、基因枪转化的优点l无宿主限制：无宿主限制：基因枪技术没有物种限制，对双子叶和基因枪技术没有物种限制，对双子叶和单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。l靶受体类型广泛：靶受体类型广泛：几乎所有具有潜在分生能力的组织几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用作基因枪转化的受体。或细胞都可以用作基因枪转化的受体。l操作简便快速，转化周期短操作简便快速，转化周期短l转化频率低转化频率低l嵌合体较多嵌合体较多l结果的重复性差结果的重复性差l转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默l遗传稳定性差遗传稳定性差l实验成本较高实验成本较高l外源外源DNADNA的整合机理等理论问题不清楚的整合机理等理论问题不清楚三、基因枪转化的缺点三、基因枪转化的缺点四、基因枪转化的操作方法四、基因枪转化的操作方法小麦的幼胚基因枪转化小麦的幼胚基因枪转化1. 1. 无菌材料的获得和培养无菌材料的获得和培养 取大田小麦开花后取大田小麦开花后14-1814-18的麦穗，剥出幼嫩种子，用的麦穗，剥出幼嫩种子，用0.10.1升汞灭升汞灭菌菌10min10min，于超净工作台上挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基，于超净工作台上挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基MS2MS2（MSMS2,4D2,4D mg/lABA0.5 ABA0.5 mg/l水解乳蛋白水解乳蛋白500500mg/l蔗糖蔗糖3%3%）上，）上，2525，暗培养。后将产生的淡黄色新鲜愈伤组织在转化前暗培养。后将产生的淡黄色新鲜愈伤组织在转化前4-64-6进行渗透进行渗透处理，渗透培养基为处理，渗透培养基为MS2+0.2MS2+0.2mg/l甘露醇甘露醇0.20.2mg/l山梨醇。轰击材料集中山梨醇。轰击材料集中置于培养皿（直径置于培养皿（直径9cm9cm）中心不大于）中心不大于3 3的范围内，的范围内，2525，暗培养。，暗培养。2. 质粒及其制备质粒及其制备 质粒的制备采用碱裂解法，经质粒的制备采用碱裂解法，经PEG 纯化，保存于纯化，保存于-20备用。备用。3.基因基因枪转化化基因基因枪型号型号:PDS1000HeSystem（美国（美国BioRad公司）公司）按按轰击参数参数进行行转化：金粉直径化：金粉直径为1，包裹子，包裹子弹的沉淀的沉淀剂用用502.5MCa(NO3)220L40PEG4000，每，每枪轰击的金粉用的金粉用量量为0.25gDNA/125g金粉，可裂金粉，可裂圆片片压力力为1350psi（磅磅/平方平方英寸英寸)，轰击距离距离为12cm，每皿，每皿轰击一次。一次。4.转化体的化体的筛选和再生和再生转化后的愈化后的愈伤组织继续在渗透培养基中培养，然后在渗透培养基中培养，然后转到原培养基到原培养基中中过渡培养周。用渡培养周。用筛选培养基培养基MSJ（MS2,4D0.5mg/l水水解乳蛋白解乳蛋白500mg/l维生素生素B10.5mg/lKCl1000mg/lGln200mg/l蔗糖蔗糖3%）筛选2-3次，每次，每14天天继代一次。代一次。筛选后的愈后的愈伤组织转入附加入附加/的培养基的培养基MSK（MSKT0.5mg/lNAA0.2mg/l蔗糖蔗糖3%）中）中进行分化，每天光照行分化，每天光照16,23。待分。待分化出的化出的绿芽芽长至至23cm高高时，转至生根培养基至生根培养基MSI（MSIBA5mg/l5蔗糖）中，附加蔗糖）中，附加PPT10-30mg/l进行生根和行生根和筛选。四、转化率及其影响因素四、转化率及其影响因素l大豆茎尖基因枪轰击转化率高达大豆茎尖基因枪轰击转化率高达2%2%，但有的报道只有，但有的报道只有1010-4-4，一，一般在般在1010-3-31010-2-2频率范围。影响转化率的因素很多：频率范围。影响转化率的因素很多：l金属微粒的影响金属微粒的影响lDNADNA沉淀辅助剂的影响沉淀辅助剂的影响lDNADNA的纯度及浓度对转化率的影响的纯度及浓度对转化率的影响l微弹速度的影响微弹速度的影响( (微弹的速度是影响转化率最重要因素微弹的速度是影响转化率最重要因素) )。l植物材料的内在因素的影响植物材料的内在因素的影响第四节第四节 其他植物转基因技术其他植物转基因技术l一、电激法一、电激法l二、二、PEG转化法转化法l三、花粉管通道法三、花粉管通道法l四、激光微束穿刺法四、激光微束穿刺法l五、超声波转化法五、超声波转化法l六、浸泡法六、浸泡法l七、子房注射法七、子房注射法l八、低能离子束法八、低能离子束法l九、显微注射法九、显微注射法l十、脂质体介导转化法十、脂质体介导转化法l十一、病毒载体转化十一、病毒载体转化一、一、电激法电激法u可用于外源可用于外源DNA的直接导入的直接导入u基本原理是利用新鲜分离的原生质体在高压电脉冲作用下在基本原理是利用新鲜分离的原生质体在高压电脉冲作用下在质膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源质膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。的摄取。u有两种不同的处理方式：一种是采用较低的电压处理较长时有两种不同的处理方式：一种是采用较低的电压处理较长时间，另一种是采用高压电处理很短的时间。间，另一种是采用高压电处理很短的时间。u优点：操作简便，适用于对农杆菌感染不敏感的植物，适于优点：操作简便，适用于对农杆菌感染不敏感的植物，适于瞬间表达（瞬间表达（transientexpression）的研究）的研究u缺点：易造成原生质体的损伤，使植板率降低。缺点：易造成原生质体的损伤，使植板率降低。二、二、PEG介导法介导法u可用于外源可用于外源DNA（质粒）直接导入（质粒）直接导入u将原生质体悬浮于含有将原生质体悬浮于含有DNA的介质中，用分子量为的介质中，用分子量为40006000的的PEG在在pH89下促进下促进DNA的摄取，从而使细胞转化。的摄取，从而使细胞转化。u很多因素都会影响很多因素都会影响PEG诱导的转化，如加入诱导的转化，如加入DNA和和PEG的次的次序，携带序，携带DNA（carrierDNA），加入的），加入的PEG的浓度等，原生的浓度等，原生质体所处的时期等质体所处的时期等u利用利用PEG法已使多种重要的禾谷类作物，如水稻、高粱、小麦法已使多种重要的禾谷类作物，如水稻、高粱、小麦的原生质体获得了基因植物。的原生质体获得了基因植物。主要步骤：主要步骤：u 胚性悬浮细胞系的建立胚性悬浮细胞系的建立u 原生质体游离及纯化原生质体游离及纯化u PEG的转化的转化u 原生质体培养原生质体培养三、三、花粉管通道法花粉管通道法u将外源将外源DNA沿着花粉管经过珠心沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移，实质是受精过程转化因的转移，实质是受精过程转化u目前已应用于水稻、小麦、棉花、目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。研究。u方法存在争议方法存在争议u可用于外源可用于外源DNA直接导入直接导入主要步骤（大豆转化）：主要步骤（大豆转化）：l导入的时间：盛花期，下午导入的时间：盛花期，下午2 2点之后点之后l花蕾大小的选择：花冠高于花蕾大小的选择：花冠高于花萼花萼0.5-1mm0.5-1mm的花蕾的花蕾l导入方法：切部分柱头导入方法：切部分柱头 不不切柱头切柱头花粉管通道法的优缺点花粉管通道法的优缺点l优点优点不依赖于植物组织培养和诱不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培导再生植株等一整套人工培养过程养过程花粉管通道是天然存在的，花粉管通道是天然存在的，理论上讲，该方法可用于任理论上讲，该方法可用于任何开花植物，从而极大地扩何开花植物，从而极大地扩展了受体植物种和品种的范展了受体植物种和品种的范围。围。方法简便，适合大规模的遗方法简便，适合大规模的遗传转化传转化l缺点缺点进行外源基因转化的时间受受体进行外源基因转化的时间受受体作物自然花期的限制，同时必须作物自然花期的限制，同时必须充分了解每一种植物的开花受精充分了解每一种植物的开花受精生物学特性及其时间进程。生物学特性及其时间进程。在田间进行操作，受环境条件的在田间进行操作，受环境条件的影响较大。影响较大。操作的经验性很强，需要一定的操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧技术摸索和技巧对单籽粒的小花农作物，操作难对单籽粒的小花农作物，操作难度大。度大。四、激光微束穿刺法四、激光微束穿刺法l外源外源DNA的直接导入的直接导入l子叶细胞在高渗液中浸泡一定时间后，细胞内外会形成一个渗透压梯度，子叶细胞在高渗液中浸泡一定时间后，细胞内外会形成一个渗透压梯度，内高外低，用激光微束进行细胞膜穿孔，外源内高外低，用激光微束进行细胞膜穿孔，外源DNA便通过直径便通过直径23 的的穿刺孔顺着渗透压梯度进入细胞内，在很短时间内，细胞穿孔自然闭合，穿刺孔顺着渗透压梯度进入细胞内，在很短时间内，细胞穿孔自然闭合，而进入细胞内的外源而进入细胞内的外源DNA便随机整合到植物组便随机整合到植物组DNA上。上。l这种方法适合于多种植物及其不同的幼嫩器官、悬浮细胞和愈伤组织等，这种方法适合于多种植物及其不同的幼嫩器官、悬浮细胞和愈伤组织等，尤其对单子叶植物的外源基因导入十分有用。尤其对单子叶植物的外源基因导入十分有用。l操作简便，对细胞的损伤小，可准确定位于被照射的细胞，实验重复性好操作简便，对细胞的损伤小，可准确定位于被照射的细胞，实验重复性好五、超声波转化方法五、超声波转化方法l可用于外源可用于外源DNA的直接导入的直接导入l转化植物原生质体、植物悬浮细胞、植物组织块、小麦幼胚等转化植物原生质体、植物悬浮细胞、植物组织块、小麦幼胚等l转化过程比较简单，将待转化的无菌生物体与质粒转化过程比较简单，将待转化的无菌生物体与质粒DNA加入到有超声波加入到有超声波缓冲液的容器中缓冲液的容器中(如一小离心管如一小离心管)，迅速混匀后将超声波发生器变幅杆末，迅速混匀后将超声波发生器变幅杆末端插入液面下，采用不同的声频、声强及时间进行处理。端插入液面下，采用不同的声频、声强及时间进行处理。超声波可采用连续和脉冲两种方式。处理后的生物细胞转到新鲜的培养超声波可采用连续和脉冲两种方式。处理后的生物细胞转到新鲜的培养基上培养，即可长出转化了的生物体。超声波发生器可采用普通的超声基上培养，即可长出转化了的生物体。超声波发生器可采用普通的超声波匀浆器。波匀浆器。l超声波被用来辅助提高农杆菌对植物的转化效率超声波被用来辅助提高农杆菌对植物的转化效率六、浸泡法六、浸泡法l外源外源DNA（质粒或（质粒或DNA片段）直接导入片段）直接导入lDNA浸种、浸种、DNA 浸苗、浸苗、DNA 浸胚、浸胚、DNA 浸芽浸芽l简单、快速、方便简单、快速、方便l水稻、苎麻、小麦中有报道水稻、苎麻、小麦中有报道七、子房注射法七、子房注射法l子房注射法是一种外源子房注射法是一种外源 DNA直接转移技术，实际上是在直接转移技术，实际上是在分子水平上进行远缘杂交，可以直接将外源分子水平上进行远缘杂交，可以直接将外源 DNA 导入导入受体。受体。l子房注射法较为简便，而且进行外源子房注射法较为简便，而且进行外源 DNA 导入的时间导入的时间比采用花粉管通道的方法较为宽松。比采用花粉管通道的方法较为宽松。l在水稻、棉花、西瓜、黄瓜等多种作物上有成功报道。在水稻、棉花、西瓜、黄瓜等多种作物上有成功报道。八、低能离子束法八、低能离子束法原理：原理：l一定能量和一定能量和剂量的剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构，结果在局部产生刻蚀和壁和细胞膜的结构，结果在局部产生刻蚀和穿孔穿孔，为外源遗传，为外源遗传物质进入细胞提供微通道物质进入细胞提供微通道；l用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性负电性，减弱了对，减弱了对带负电的带负电的外源外源 DNA 的静电斥力，从而促进了的静电斥力，从而促进了外源外源 DNA 的吸的吸附和进入附和进入；l离子束离子束的直接和间接作用打断了细胞内的的直接和间接作用打断了细胞内的染色体染色体 DNA 结构，结构，有利于将外源有利于将外源遗传物质整合遗传物质整合到到受体受体基因组中。基因组中。九、九、显微注射法显微注射法l先把原生质或培养的细胞固定在琼脂、低熔点的琼脂糖中，或先把原生质或培养的细胞固定在琼脂、低熔点的琼脂糖中，或用聚赖氨酸处理附着在玻璃平板上，也可通过一固着的毛细管用聚赖氨酸处理附着在玻璃平板上，也可通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口，将原生质体吸着在管口，l通过一极细的毛细管将一定量的通过一极细的毛细管将一定量的DNA注入细胞内，甚至直接注注入细胞内，甚至直接注入核内。入核内。l此法已在烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体上获得成功。此法已在烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体上获得成功。l微注射法的优点是转化效率高，在用线形微注射法的优点是转化效率高，在用线形DNA的一些试验中，的一些试验中，转化效率甚至高达转化效率甚至高达60以上，无需特殊的选择系统以上，无需特殊的选择系统十、脂质体介导转化法十、脂质体介导转化法l脂质体法就是将包含外源基因脂质体法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合，从而达到转基因生质体融合，从而达到转基因的目的。的目的。l个步骤：个步骤：原生质体分离和纯化、原生质体分离和纯化、脂质体的制备、脂质体的制备、原生质体与脂质体的融合原生质体与脂质体的融合转化体的培养、筛选和鉴定。转化体的培养、筛选和鉴定。十一、病毒载体转化十一、病毒载体转化l双链双链 DNA 病毒、单链病毒、单链 DNA 病毒和病毒和 RNA 病毒都可以把病毒都可以把基因转移到完整的植物体或组织中，并得到表达。基因转移到完整的植物体或组织中，并得到表达。l单链单链 RNA植物病毒载体系统植物病毒载体系统l单链单链 DNA 植物病毒载体系统植物病毒载体系统l双链双链 DNA 植物病毒载体系统。植物病毒载体系统。（一）单链（一）单链RNA植物病毒载体系统植物病毒载体系统l用反转录酶和用反转录酶和DNA聚合酶将单链的病毒聚合酶将单链的病毒RNA合成双链的合成双链的cDNA拷贝；拷贝；l将其克隆到原核生物的质粒或黏粒（将其克隆到原核生物的质粒或黏粒（cosmid）载体上，）载体上，通过常规的遗传操作和分子生物学的方法改造载体通过常规的遗传操作和分子生物学的方法改造载体DNA，将外源基因插入到病毒的，将外源基因插入到病毒的cDNA部分部分l最后，通过体外转录将带有外源基因的病毒最后，通过体外转录将带有外源基因的病毒DNA感染并感染并进入植物寄主细胞。进入植物寄主细胞。（二）单链（二）单链DNA植物病毒载体系统植物病毒载体系统l双生病毒的病毒颗粒一般成对存在，基因组比较小，其分子双生病毒的病毒颗粒一般成对存在，基因组比较小，其分子为为2.53.5kb，单链的环状，单链的环状DNA分子组成。分子组成。l双生病毒成对的两个颗粒所包含的基因组可以不同，但只有双生病毒成对的两个颗粒所包含的基因组可以不同，但只有当两种当两种DNA混合时才具有感染性。所以，如果病毒的复制基混合时才具有感染性。所以，如果病毒的复制基因只在一种因只在一种DNA上，那么就可以在另一种上，那么就可以在另一种DNA上插入外源上插入外源基因而不影响基因组的复制。基因而不影响基因组的复制。l缺陷：这些病毒的感染部位仅局限在植株的维管组织，而且缺陷：这些病毒的感染部位仅局限在植株的维管组织，而且大部分靠媒介昆虫传毒，不能机械转移接种；另外，这些病大部分靠媒介昆虫传毒，不能机械转移接种；另外，这些病毒都是球形颗粒，插入外源毒都是球形颗粒，插入外源DNA的片段不能太大。的片段不能太大。（三）双链（三）双链DNA植物病毒载体系统植物病毒载体系统lCaMV基因组基因组是双链环状是双链环状的的DNA，长度大约长度大约为为8kb。lCaMV的的大多数限制性酶大多数限制性酶切位点切位点中插入中插入外源外源DNA都会都会导致病毒导致病毒失去感染性，而且它不能包装具有大于原基因失去感染性，而且它不能包装具有大于原基因组组300bp的的重组重组体基因组体基因组。所以。所以，按外源基因插入或取代的方法，按外源基因插入或取代的方法发展发展CaMV克克隆载体隆载体有着有着难以难以克服的困难克服的困难。lCaMV载体系统载体系统的的改造策略：改造策略：由缺陷型由缺陷型的的CaMV病毒病毒同辅助病毒组成同辅助病毒组成互补的互补的载体系统载体系统；将将CaMV的的DNA整合到整合到Ti质粒质粒DNA中中组成混合的载体系统。组成混合的载体系统。本章小结与思考题：本章小结与思考题：l农杆菌农杆菌T-DNAT-DNA导入植物基因组整个过程？导入植物基因组整个过程？l影响影响T-DNAT-DNA转移的主要因素有哪些？转移的主要因素有哪些？l请选取一种植物，写出农杆菌介导的转基因的整个过程，并画出线路图。请选取一种植物，写出农杆菌介导的转基因的整个过程，并画出线路图。l基因枪法转基因的优缺点有哪些？基因枪法转基因的优缺点有哪些？第第10章章 植物遗传转化技术和方法植物遗传转化技术和方法第第10章章 植物遗传转化技术和方法植物遗传转化技术和方法谢谢大家谢谢大家