色谱色谱-质谱联用技术及其应用质谱联用技术及其应用福州大学测试中心福州大学测试中心卢巧梅卢巧梅2019.10.181:授课内容授课内容l色谱技术色谱技术l质谱技术质谱技术l气相色谱气相色谱-质谱联用技术质谱联用技术l液相色谱液相色谱-质谱联用技术质谱联用技术2:概述概述色谱：化合物分离色谱：化合物分离质谱：纯物质结构分析质谱：纯物质结构分析色谱色谱-质谱联用：结合共同优点质谱联用：结合共同优点GC-MS；LC-MS；CE-MS关键点：接口技术关键点：接口技术3:色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因此得名为色谱法。以后此形成各种不同颜色的谱带，因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱二字虽已失去色谱二字虽已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。原来含义，但仍被人们沿用至今。一一 色谱技术色谱技术4:色谱的原理色谱的原理定义：色谱是一种把混合物中多组分分离的实验技术。定义：色谱是一种把混合物中多组分分离的实验技术。即利用物质的物理化学性质建立的分离分析方法。即利用物质的物理化学性质建立的分离分析方法。实质：分别实质：分别目的：定性或定量分析目的：定性或定量分析5:固定相和流动相固定相和流动相 l填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相固体或液体填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相固体或液体称为固定相；称为固定相；l自上而下运动的一相一般是气体或液体称为流动相；自上而下运动的一相一般是气体或液体称为流动相；l装有固定相的管子玻璃管或不锈钢管称为色谱柱。装有固定相的管子玻璃管或不锈钢管称为色谱柱。l当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。次序从固定相中流出。6:按分离机理分类按分离机理分类分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用的在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用的结果。结果。注意注意7:8:色谱法的流出曲线及有关术语色谱法的流出曲线及有关术语9:色谱峰所能提供的重要信息色谱峰所能提供的重要信息1样品中所含组分的最少个数样品中所含组分的最少个数2保留值保留值-定性分析定性分析3色谱峰面积或峰高）色谱峰面积或峰高）-定量分析定量分析4色谱峰的保留值和区域宽度色谱峰的保留值和区域宽度-评价色谱柱的分离效能评价色谱柱的分离效能5根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件10:二二质谱技术质谱技术 质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比m/z的测定来进的测定来进行分析的一种方法。行分析的一种方法。 被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的不同，把离子按运动行为的不同，把离子按m/z分开而得到质谱，并得到样品的分开而得到质谱，并得到样品的定性定量结果。定性定量结果。11:2.1 质谱的发展质谱的发展40年代年代同位素测定和无机元素分析同位素测定和无机元素分析50年代年代有机物分析有机物分析60年代年代气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用80年代年代新的质谱技术新的质谱技术接口技术基质辅助激光解吸电离源，接口技术基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源）电喷雾电离源，大气压化学电离源）新质谱仪液相色谱新质谱仪液相色谱-质谱联用仪，质谱联用仪，富立叶变换质谱仪等）富立叶变换质谱仪等）目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、资料、环境、药物、刑侦、目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、资料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。生命科学、运动医学等各个领域。1911年年世界第一台质谱装置世界第一台质谱装置J.J.Thomson）70年代年代计算机技术引入计算机技术引入12: 质谱不属波谱范围； 质谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量 的改变无关； 质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱, 谱图与分子结构有关； 质谱法进样量少, 灵敏度高, 分析速度快； 质谱法可提供分子量, 确定分子式。 2.2质谱特点质谱特点13: 质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的 m/z 的离子来进行分离分析的。 质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。 2.3质谱仪的基本结构质谱仪的基本结构计算机数据处理系统真空系统 加速区进样系统离子源质量分析器检测器 14:l质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。l一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。得更高的真空度。2.3.1真空系统真空系统二级真空系统！二级真空系统！15:真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作16: 进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。不能造成真空度的降低。进样方式：进样方式：1 1 直接进样直接进样2 2 仪器联用的进样仪器联用的进样 （GCGC、LCLC、CECE）2.3.2进样系统进样系统17:离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。息的离子。2.3.3离子源离子源Note：质谱检测的是离子；质谱检测的是离子；离子源离子源=接口接口18:电子轰击电离电子轰击电离 Electron Impact Ionization, EI化学离子化化学离子化 Chemical Ionization, CI场电离，场解吸场电离，场解吸 Field Ionization FI, Field Desorption FD快原子轰击快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI电喷雾电离电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI大气压化学电离大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI离子化方法离子化方法19:电子轰击电离电子轰击电离 EI EI源应用最为广泛，它主要用于挥发性样品的电离。源应用最为广泛，它主要用于挥发性样品的电离。 原理：由原理：由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。品分子电离。 所有的标准质谱图都是在所有的标准质谱图都是在70 eV下做出的。有机物分子下做出的。有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。键的断裂形成碎片离子。 由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。得到化合物的结构信息。20:21:有些化合物稳定性差，用有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子；方式不易得到分子离子；为了得到分子量可以采用为了得到分子量可以采用CI电离方式。电离方式。特点：特点：最强峰为准分子离子；最强峰为准分子离子；谱图简单；谱图简单；不适用难挥发试样；不适用难挥发试样；+气体分子气体分子试样分子试样分子+准分子离子准分子离子电子电子(M+1)+;(M+17) +;(M+29) +;化学电离化学电离CI）22:化学电离化学电离 CI CI反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。以以CH4为为例：例：CI源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。23:M + CH5+ MH + + CH4 M + C2H5+ MH + + C2H4 M + C2H5+ M H + + C2H6 加合离子与样品分子反应：准分子离子QM+生成的M+H+和M-H+比样品分子M多一个H或少一个H，称为准分子离子。化学电离源是一种软电离方式，有些用EI方式得不到分子离子的样品，改用CI后可以得到准分子离子，因而可以求得分子量。24:场致电离场致电离特点：特点：强电场将分子中拉出一个电子；强电场将分子中拉出一个电子；分子离子峰强；分子离子峰强；碎片离子峰少；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；不适合化合物结构鉴定；阳极+阴极dAbundance0.651.462.623.363.593.934.104.444.635.126.50UV0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.004000080000120000160000200000240000280000Time-Abundance1.462.613.353.603.924.084.434.635.096.49ESTIC三唑三唑(Triazolam)(Triazolam)安定安定(Diazepam)(Diazepam)12.5ng/component12.5ng/component72: 其中两个峰的质谱图其中两个峰的质谱图TRIAZOLAMMW=342DIAZEPAMMW=284Abundance343.214016018020022024026028030032034036038040020004000600080001000012000m/z-345.2346.214016018020022024026028030032034036038040020006000100001400018000m/z-Abundance285.2287.3isotoperatioisotoperatioshows2Clshows2Clisotoperatioisotoperatioshows1Clshows1ClNNNNClCH3ClNNOClCH373:舒喘宁舒喘宁Salbutamol )Salbutamol )降解产物分析降解产物分析min51015202530020406080100120nm200250300350Norm.4080120160min246810121416mAU05101520* * * * * * *m/z346m/z346MSTICMSTICm/z224m/z224m/z282m/z282在药物降解中,降解产物可能保留了紫外发光基团,其紫外光谱图类似,所以无法通过紫外来对降解产物进行鉴定,而利用质谱则通过质谱图可以鉴定降解产物UVSignalandspectraUVSignalandspectraMSTICandEICsMSTICandEICs74:磺胺药物分析磺胺药物分析sulfamethizolesulfamethizoleMW270MW270sulfadimethoxinesulfadimethoxineMW310MW310sulfachloropyridazinesulfachloropyridazineMW284MW284sulfamethazinesulfamethazineMW278MW278min1234520000040000060000080000010000001200000H2NNNSCH3SOONHH2NSOONNNHH2NSOONNNHOOH2NSOONNClNH共流出峰的鉴定共流出峰的鉴定75:胆汁酸及代谢物的分析胆汁酸及代谢物的分析BPC76:脱氧胆酸分析中脱氧胆酸分析中m/z 391m/z 391的一级和二级质谱图的一级和二级质谱图77:78:推测的脱氧胆酸代谢机理推测的脱氧胆酸代谢机理79:甲基橙染料降解产物的分析甲基橙染料降解产物的分析80: ass spectra of methyl orange degradation products81: Fragmentation scheme of methyl orange degradation products.82:色谱质谱技术参考书目色谱质谱技术参考书目83:色谱质谱技术参考书目色谱质谱技术参考书目84:祝大家祝大家一帆风顺！一帆风顺！85: