新基因功能研究的策略与方法 目 录 ? 生物信息学预测 ? 研究基因的时空表达模式 ? 细胞及动物水平验证 生物信息学预测 ? 序列相似性分析 ? DNA序列的开放阅读框查找 ? 蛋白质理化性质分析 序列相似性分析 相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断 序列间的相似性越高，是同源序列可能性就更高 核苷酸序列相似性分析 BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的序列 序列决定结构，结构决定功能 氨基酸序列相似性分析 BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索蛋白质数据库中的序列 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则Score值越大。 E value:随机匹配的可能性 Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比 11 DNA序列的开放阅读框查找 预测其编码蛋白质的氨基酸序列 https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ 12 ? 限制性核酸内切酶切位点 ? 外显子、内含子剪切位点分析 蛋白质的理化性质分析 亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏水性、 web.expasy.org/protparam 疏水性分析 ExPASy的ProtScale程序 http:/www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl 蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱 ?蛋白跨膜结构分析 www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 信号肽预测与识别 www.cbs.dtu.dk/services/signalP 蛋白质卷曲螺旋预测 www.ch.embnet.org/software/COLIS_form.html ? 磷酸化位点预测与识别 ? www.phosphosite.org 研究基因的时空表达模式 基因表达的时空性是指基因的表达在个体发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、衰老等生命现象的分子基础。 基因表达的时空性特征为基因功能的研究提供了重要的信息：如果基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、发展有关。 研究基因的时空表达模式 ? mRNA水平的表达谱分析 ? 蛋白水平的表达谱分析 mRNA水平的表达谱分析 ? Northern Blotting ? 原位杂交 ? RT-PCR ? cDNA微阵列 蛋白水平的表达谱分析 ? Western Bloting ? 免疫组化技术 ? 双向凝胶电泳 ? 生物质谱技术 细胞及动物水平验证 ? 基因过表达细胞模型 ? 基因沉默细胞模型 基因过表达细胞模型 ? 定义：通过载体将目的基因转入某一特定细胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为的变化，从而了解该基因的功能。 ? 应用：1）化学法 细胞感染 2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反应，从而影响目的基因表达。 拟南芥中鉴定到一个蛋白长盐处理时间时，其转录AtPP2-B11，在延F-box水平和蛋白水平均出现显著诱导表达。过表达AtPP2-B11表现出明显的高盐耐受性，的转基因拟南芥而相应的生株对盐胁迫更敏感。RNA干扰株比野iTRAQ胁迫下有定量分析显示，在盐蛋白受到4311AtPP2-B11个差异表达调控。 基因沉默细胞模型 ? 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组 ? 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰 基因沉默在人细胞作用模式 ? 第一种为型其主要特征是RNA-RNA 模引导链与RNA 的低拷贝转录子结合RNAPII 合成从而导致沉默。 , ? 第二种为型其主要特征是在转RNA-DNA 模录过程中与靶标的一条, RNA 引导链成二聚体DNA 形默。 , 从而导致沉反义技术 ?或生物合成的特异互补性原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转DNA或RNA片段（或录、抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞的mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节，生长分化等。 ? 分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA ASON技术（反义寡核苷酸技术） 是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因表达，以达到调控表达基因的目的。ASON一般设计在编码区或3非编码区，长度以1520nt较为合适。ASON包括反义DNA和反义RNA。 RNAi技术 ? 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达到阻止基因表达、产生“功能失活”的目的。 ? 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、周期短；用于研究特定基因在特定组织细胞的特定发育阶段中的功能。 细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在Dicer酶的作用下降解成小 RNA；小RNA的双链解开，其中一条链被优先装载入 RNA诱导沉默复合物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的 RNA靶分子；被装载入RISC复合物当中的向导链 -ssRNA随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶（Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的mRNA靶分子。