实验十实验十 双缩脲法测定双缩脲法测定蛋白质浓度蛋白质浓度一、实验目的1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法学习常见蛋白质含量测定的原理和方法2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析维生素维生素B12溶液的吸收光谱溶液的吸收光谱主要方法：主要方法：（1）比较吸收光谱曲线）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长）比较最大吸收波长蛋蛋白白质质的的最最大大吸吸收收波波长长为为280nm；核酸的最大吸收波长为核酸的最大吸收波长为260nm。（3）比较吸光度的比值）比较吸光度的比值 纯纯DNA：（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1原理原理Beer-Lambert（比尔）定律：（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=cl 其其中中：T为为透透光光率率；A为为吸吸光光率率；I0为为入入射射光光强强度度；I为透射光强度；为透射光强度；为为摩摩尔尔消消光光系系数数；C为为溶溶液液浓浓度度；L为为溶溶液液光光程程的的厚厚度度 2常用方法常用方法（1）标准曲线法）标准曲线法标准曲线与样品的测定条件必须一致。标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知，已知CS，测定，测定AS、AX可求得可求得CX。（3）摩尔吸光系数法）摩尔吸光系数法C=A/ （ 为为L=1cm，C为为1 mol/L时时的的吸吸光光系系数数，也也称为摩尔吸光系数。称为摩尔吸光系数。 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被被测测的的天天然然含含氮氮化化合合物物与与浓浓硫硫酸酸共共热热时时分分解解出出氨氨，氨氨与与硫硫酸酸反反应应生生成成硫硫酸酸铵铵。在在凯凯氏氏定定氮氮仪仪中中加加入入强强碱碱碱碱化化消消化化液液，使使硫硫酸酸铵铵分分解解出出氨氨。用用水水蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏法法将将氨氨蒸蒸入入无无机机酸酸溶溶液液中中，然然后后再再用用标标准准酸酸溶溶液液进进行行滴滴定定，滴滴定定所所用用无无机机酸酸的的量量(mol)相相当当于于被被测测样样品品中中氨氨的的量量（mol），根根据据所所测测得得的的氨氨量量即即可可计计算样品的含氮量。算样品的含氮量。 因因为为蛋蛋白白质质含含氮氮量量通通常常在在16 %左左右右，所所以以将将凯凯氏氏定定氮氮法法测测得得的的含含氮氮量量乘乘上上系系数数6.25，便便得得到到该该样样品的蛋白质含量。品的蛋白质含量。 Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度 蛋蛋白白质质含含有有两两个个以以上上的的肽肽键键(CONH)，因因此此有有双双缩缩脲脲反反应应，在在碱碱性性溶溶液液中中，能能与与Cu2+形形成成络络合合物物。Folin酚酚反反应应是是在在双双缩缩脲脲反反应应的的基基础础上上，引引进进Folin试试剂剂(磷磷钼钼酸酸磷磷钨钨酸酸试试剂剂)，蛋蛋白白质质铜铜络络合合物物能能还还原原磷磷钼钼酸酸磷磷钨钨酸酸试试剂剂，生生成成蓝蓝色色物物质质。在在一一定定条条件件下下，蓝蓝色色强强度度与与蛋蛋白白质质的的量量成成正正比比例例。本本法法的的优优点点是是操操作作简简便便、灵灵敏敏度度高高、较较紫紫外外吸吸收收法法灵灵敏敏1020倍倍，较较双双缩缩脲脲法法灵灵敏敏100倍倍。其其不不足足之之处处是是此此反反应应受受多多种种因因素素干干扰扰。（Tris缓缓冲冲剂剂、蔗蔗糖糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基基的的苯苯环环含含有有共共轭轭双双键键，因因此此蛋蛋白白质质具具有有吸吸收收紫紫外外线线的的性性质质，吸吸收收高高峰峰在在280 nm波波长长处处。在在此此波波长长范范围围内内，蛋蛋白白质质溶溶液液的的光光吸吸收收值值(OD280)与与其其含含量量呈呈正正比比关关系系，可可用作定量测定。用作定量测定。 利利用用紫紫外外吸吸收收法法测测定定蛋蛋白白质质含含量量的的优优点点是是迅迅速速、简简便便、不不消消耗耗样样品品、可可回回收收利利用用、低低浓浓度度盐盐类类不不干干扰测定。扰测定。 含有核酸的样品：含有核酸的样品：蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A2800.74A260 总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）二辛可宁酸、二羧基二喹啉） 准准确确灵灵敏敏：BCA试试剂剂的的蛋蛋白白质质测测定定范范围围是是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是试剂测定范围是0.5-20g/ml 快快速速：45分分钟钟内内完完成成测测定定，比比经经典典的的Lowry法法快快4倍而且更加方便倍而且更加方便 经经济济实实用用：除除试试管管外外，测测定定可可在在微微孔孔板板中中进进行行，大大大节约样品和试剂用量大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝基本原理：基本原理： 碱碱性性条条件件下下，蛋蛋白白将将Cu2+还还原原为为Cu+，Cu+与与BCA试试剂剂形形成成紫紫颜颜色色的的络络合合物物，测测定定其其在在562nm处处的的吸吸收收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考考马马斯斯亮亮蓝蓝在在一一定定蛋蛋白白质质浓浓度度范范围围内内，蛋蛋白白质质和和染染料料结结合合符符合合比比尔尔定定律律 ，因因此此可可以以通通过过测测定定染染料料在在595nm处处光光吸吸收收的的增增加加量量得得到到与与其其结结合合的的蛋蛋白白质质量量。该该法法简简单单、迅迅速速、干干扰扰物物质质少少、灵灵敏敏度度高高（比比Lowry法法灵敏灵敏4倍）。倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质* * 双双缩缩脲脲反反应应：双双缩缩脲脲在在碱碱性性条条件件下下与与铜铜离离子子结结合合生生成成紫紫红红色色化化合合物物，颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度成成正正比比。本法测定蛋白质范围本法测定蛋白质范围1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲双缩脲 三、操作步骤三、操作步骤1.取取15支试管，按下表编号、加试剂支试管，按下表编号、加试剂2.各管各管混匀混匀后，加入双缩脲试剂后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应反应30min。3.以以0号管调零号管调零，测定各管，测定各管540nm光吸收值。光吸收值。四、结果处理四、结果处理1.绘制标准曲线绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，为纵坐标，绘绘制标准曲线制标准曲线。2.样品的计算样品的计算 根据样品的根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（量（mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。），再根据样品的体积算出样品的浓度。五、注意事项五、注意事项1. 须于显色后须于显色后30min内测定内测定，且各管由显色到比色时间，且各管由显色到比色时间应尽可能应尽可能一致一致。2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3. 比色杯的使用比色杯的使用微量表达法10-3 (g, m, L) milligram 毫（克）毫（克） mg10-6 microgram 微（克）微（克） g10-9 nanogram 纳（克）纳（克） ng10-12 picogram 皮皮 （克）（克） pg10-15 femtogram 飞（克）飞（克） fg10-18 attogram 阿、渺（克）阿、渺（克） ag 10-24 zepto（仄普托）（仄普托） 沙（克）沙（克） zgppm: parts per million 1 g/ml 1ppmppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppbppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt五、分光光度计的使用五、分光光度计的使用仪器操作键介绍仪器操作键介绍“方式设定方式设定”键（键（MODE）：用于设置测试方式）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键键 ： 用用 于于 自自 动动 调调 整整100.0%T(100.0透射比透射比)或或0ABS(零吸光度零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比键：用于自动调整零透射比“波长设置波长设置”旋钮：用于设置分析波长旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热打开电源开关，使仪器预热20分钟分钟 用用“波长设置波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路入光路 盖好样品室盖，按盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调调100%透射透射比比 按按“方式键方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式）将测试方式设置为吸光度方式(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零调零A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，实验完成后，关闭电源，洗净比色皿洗净比色皿，并盖好盖布。，并盖好盖布。返回 722型分光光度计的外形型分光光度计的外形光路光路光路光路