第六章毛细管电泳第六章毛细管电泳（Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresis）(CE)2021/8/221参考书1.1.林炳承，毛细管电泳导论，科学出版社，19962.2.陈义，毛细管电泳方法及应用（第二版），化学工业出版社，20063.3.邓延倬，高效毛细管电泳，科学出版社，20002021/8/2226.1 6.1 分离原理分离原理1. 电泳 电介质中带电粒子在电电介质中带电粒子在电场作用下以不同的速度场作用下以不同的速度向电荷相反方向迁移的向电荷相反方向迁移的现象。离子在电场中的现象。离子在电场中的迁移速度为：迁移速度为：q 离子所带的有效电荷；E 电场强度；f 平动摩擦系数； ( 对于球形离子： f =6； 离子的表观液态动力学半径； 介质的粘度 )；为淌度2021/8/2232. 电渗流电渗：另一种电动现象。当高电压通过含有缓电渗：另一种电动现象。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶液向阴极或阳冲溶液的毛细管柱时，管内的溶液向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。2021/8/224在典型的毛细管电泳分离中，电渗淌度大于电泳淌度，所以离子的洗脱顺序是: 阳离子-中性分子-阴离子。典型的毛细管电泳图谱2021/8/225改变电渗流方向的方法改变电渗流方向的方法: :（1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团（2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。2021/8/2266.2 6.2 毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点n n与传统的电泳的比较与传统的电泳的比较n n毛细管电泳的特点：高效、快速、微量、自动化毛细管电泳的特点：高效、快速、微量、自动化n nCECE与与HPLCHPLC比较比较 CE HPLCCE HPLCn n动力动力 强电场强电场 高压高压n n分离效率分离效率 10106 6/ /米米 50000/50000/米米 why?why?n n溶剂耗量溶剂耗量 极少极少 大大n n柱柱 便宜便宜 贵贵n n仪器成本仪器成本 低低 高高n n分离速度分离速度 更快更快 快快n n样品用量样品用量 100nL 100nL 几微升几微升2021/8/227原因:1. 塞状流体减小的谱带展宽2. 毛细管散热快，减小了焦尔热的影响2021/8/2286.3 毛细管电泳仪2021/8/2292021/8/2210n n高压电源高压电源n n0-300-300-300-30 kV kV kV kV 稳定、连续可调的直流电源稳定、连续可调的直流电源稳定、连续可调的直流电源稳定、连续可调的直流电源n n毛细管毛细管n n内径内径内径内径20-7520-7520-7520-75m m m m，外径，外径，外径，外径350-400350-400350-400350-400m m m m；n n进样装置与方式进样装置与方式n n电动进样，压力进样电动进样，压力进样电动进样，压力进样电动进样，压力进样n n检测器检测器n n紫外，荧光，激光诱导荧光，电化学，质谱紫外，荧光，激光诱导荧光，电化学，质谱紫外，荧光，激光诱导荧光，电化学，质谱紫外，荧光，激光诱导荧光，电化学，质谱2021/8/22116.4 6.4 毛细管电泳的分类毛细管电泳的分类按分离原理的不同，可将毛细管电泳分成：按分离原理的不同，可将毛细管电泳分成：n n毛细管区带电泳毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis, CZEcapillary zone electrophoresis, CZE n n毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis, CGEcapillary gel electrophoresis, CGE n n毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focus, CIEFcapillary isoelectric focus, CIEF n n毛细管等速电泳毛细管等速电泳 capillary isota- chophoresis, CITPcapillary isota- chophoresis, CITP n n胶束电动力学毛细管色谱胶束电动力学毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)MEKC)n n填充毛细管电色谱填充毛细管电色谱(capillary electroosmostic chromatography (capillary electroosmostic chromatography ，CEC)CEC)2021/8/2212毛细管区带电泳毛细管区带电泳基于试样中各个组分间荷质比的差异进行分离。该模式的特征是：整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用。如果试样中不同离子的迁移率差别很大，就能将不同离子分离。毛细管区带电泳可分离小离子，或衍生化生成离子的物质，如抗炎药物，氨基酸等物质。2021/8/2213毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳在多孔的凝胶基质上进行分离，凝胶的孔穴中含有缓冲混合物。最常用的凝胶是在交联剂的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例。扩散小，柱效极高。是将生物大分子如蛋白质、DNA片断等，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。 如DNA测序2021/8/2214毛细管等速电泳毛细管等速电泳试样引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率较高的前导离子溶液另一种是迁移率较低的尾随离子溶液。当施加电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速度不同，故电解质溶液将形成由负极到正极增加的离子浓度梯度，而电位梯度与电导率呈反比，故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。因此泳池内电解质溶液的电位梯度由正极向负极增加。由于离子的迁移速度与电场强度呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，形成紧紧相邻而又彼此完全分离的单组分区带。样品在线浓缩样品在线浓缩2021/8/2215毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦基于不同蛋白质或多肽之间等电点pH的差异进行分离。毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离。分辨率极高。2021/8/2216胶束电动力学毛细管色谱胶束电动力学毛细管色谱n n是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。相之间分配系数的差异进行分离。2021/8/2217毛细管电动色谱毛细管电动色谱n n利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。像毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。n n像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离；提供了微量体积试样溶液的高效分离；通过电渗通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。简化了输送体系。简化了输送体系。n n电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。液相色谱法高。2021/8/22186.5 6.5 应用应用2021/8/22192021/8/22202021/8/2221CE用于基因测序2021/8/2222