医学实验室认可技术要求医学实验室认可技术要求PCR专业的关键控制点专业的关键控制点沈佐君沈佐君医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业1医学实验室认可技术要求PCR专业的关键控制点沈佐君医学实验临床基因扩增检验实验室管理暂行办法临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发（卫医发200210号）号）医疗机构临床实验室管理办法医疗机构临床实验室管理办法（卫医发（卫医发200673号）号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）号）临床基因扩增检验实验室基本设置标准临床基因扩增检验实验室基本设置标准临床基因扩增检验实验室工作导则临床基因扩增检验实验室工作导则ISO15189准则（准则（CL02）CNAS-GL26医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的指南的指南CNAS医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明用说明参考依据医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业2临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发20021概述基因体外扩增检验通常称为基因体外扩增检验通常称为PCR检验；检验；该检验项目是目前我国临床检验项目中该检验项目是目前我国临床检验项目中唯一一项需要通过卫生部或省级临床检唯一一项需要通过卫生部或省级临床检验中心现场技术验收合格方可开展临床验中心现场技术验收合格方可开展临床检验的技术准入项目。检验的技术准入项目。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业3概述基因体外扩增检验通常称为PCR检验；医学实验室认可技概述对实验室的要求：对实验室的要求：实验室验收合格证书实验室验收合格证书人员上岗证书人员上岗证书实验室的布局实验室的布局仪器设备要求仪器设备要求质量手册、管理程序文件、操作程序文质量手册、管理程序文件、操作程序文件、作业指导书、记录表格等件、作业指导书、记录表格等医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业4概述对实验室的要求：医学实验室认可技术要求的关键控制点p1范围本文件规定了本文件规定了CNAS对医学实验室基因扩增检验领域的认可要对医学实验室基因扩增检验领域的认可要求，包括病原体求，包括病原体核酸扩增核酸扩增检验和病理学检查等领域涉及的检验和病理学检查等领域涉及的人体人体基因扩增检验。基因扩增检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本文件。其最新版本（包括修改单）适用于本文件。GB/T20468-2006临床实验室定量测定室内质量控制指南临床实验室定量测定室内质量控制指南卫办医政发卫办医政发2010194号医疗机构临床基因扩增管理办法号医疗机构临床基因扩增管理办法CNAS-RL02能力验证规则能力验证规则医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业51范围医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业54管理要求4.1.1从事基于组织从事基于组织/细胞形态学基础项目检细胞形态学基础项目检测的医学实验室，应具有病理学诊断资质。测的医学实验室，应具有病理学诊断资质。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业64管理要求4.1.1从事基于组织/细胞形态学基础项目5技术要求5.1人员人员5.1.2基因扩增实验室（以下简称实验室）操作人员应经基因扩增实验室（以下简称实验室）操作人员应经过有资质的培训机构培训合格取得上岗证后方可上岗。过有资质的培训机构培训合格取得上岗证后方可上岗。5.1.4实验室负责人至少应具有以下资格：中级职称，医实验室负责人至少应具有以下资格：中级职称，医学相关专业背景，二年以上基因扩增工作经验。学相关专业背景，二年以上基因扩增工作经验。5.1.11实验室应制定员工能力评审的内容和方法，每年实验室应制定员工能力评审的内容和方法，每年评审员工的工作能力；至少每半年评审新员工工作能力，评审员工的工作能力；至少每半年评审新员工工作能力，并保存胜任的证据。当职责变更时，应有政策规定对员并保存胜任的证据。当职责变更时，应有政策规定对员工进行再培训和再评审。没有通过评审的人员应经再培工进行再培训和再评审。没有通过评审的人员应经再培训和再评审，合格后才可继续上岗，并记录。训和再评审，合格后才可继续上岗，并记录。5.1.13实验室应提供工作人员对患者隐私及结果保密的实验室应提供工作人员对患者隐私及结果保密的声明及签字。声明及签字。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业75技术要求5.1人员医学实验室认可技术要求的关键控制5.1人 员操作人员考核的主要内容：操作人员考核的主要内容： 1.标本接收与处理：流程和标本是否合格的要点标本接收与处理：流程和标本是否合格的要点 2.试剂耗材质检：为何要质检、如何做试剂耗材质检：为何要质检、如何做 3.核酸提取：原理和操作技术要领核酸提取：原理和操作技术要领 4.防污染：措施和意识防污染：措施和意识 5.质量控制：程序和实际运行情况、失控的分析处质量控制：程序和实际运行情况、失控的分析处理理 6.结果分析与判断：结果审核、报告发放结果分析与判断：结果审核、报告发放医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业85.1人员操作人员考核的主要内容：医学实验室认可技术5.1人员在现场评审时要求安排人员比对：在现场评审时要求安排人员比对：临临床床基基因因扩扩增增检检验验的的操操作作主主要要是是标标本本处处理理中中的的核核酸酸提提取取步步骤骤，这这其其中中所所涉涉及及的的又又主主要要是是加加样样器器的的使使用用，尽尽管管操操作作简简单单，但但由由于于均均为为微微量量操操作作，最最后后扩扩增增放放大大，因因此此要要获获得得稳稳定定可可靠靠的的测测定定结结果果，操操作作人人员员需需要一定的专业技术知识和经验要一定的专业技术知识和经验。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业95.1人员在现场评审时要求安排人员比对：医学实验室认5.1人员在现场安排实验时应考虑到的问题：在现场安排实验时应考虑到的问题：标本数量：一般标本数量：一般5个；个；标本要求：一份阴性，其余标本要求：一份阴性，其余4份一般份一般要尽可能涵盖高、中、低、临界等浓要尽可能涵盖高、中、低、临界等浓度差，了解线性范围。度差，了解线性范围。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业105.1人员在现场安排实验时应考虑到的问题：医学5.2设施和环境条件(3-1)5.2.1实验室原则上分四个分隔开的工作区域：实验室原则上分四个分隔开的工作区域：试剂贮存和准备区；试剂贮存和准备区；标本制备区；标本制备区；扩增区；扩增区；扩增产物分析区。扩增产物分析区。如如使使用用自自动动分分析析仪仪（扩扩增增产产物物闭闭管管检检测测），（c）和和（d）区区可可合并。合并。上述每个区域应有充分空间以保证：上述每个区域应有充分空间以保证：样本处置符合分析前、后样本分区放置；样本处置符合分析前、后样本分区放置；仪器放置符合维修和操作要求；仪器放置符合维修和操作要求；标本制备区放置生物安全柜、离心机和冰箱等仪器设备；标本制备区放置生物安全柜、离心机和冰箱等仪器设备；打印检验报告时交叉污染的控制。打印检验报告时交叉污染的控制。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业115.2设施和环境条件(3-1)5.2.1实验室原则上分四个5.2设施和环境条件(3-2)5.2.2实实验验室室应应实实施施安安全全风风险险评评估估，应应针针对对各各工工作作区区制定针对性的防护措施及合适的警告。制定针对性的防护措施及合适的警告。5.2.4实实验验室室各各分分区区应应配配置置固固定定和和移移动动紫紫外外线线灯灯，波波长长为为254nm，照照射射时时离离实实验验台台的的高高度度为为6090cm。标本处理区应配置二级生物安全柜。标本处理区应配置二级生物安全柜。5.2.5实实验验室室应应依依据据所所用用分分析析设设备备和和实实验验过过程程对对环环境境温温、湿湿度度的的要要求求，制制定定实实验验室室温温、湿湿度度控控制制的的目目标标，有效地实施控制，并提供温、湿度监控记录。有效地实施控制，并提供温、湿度监控记录。实验室应依据用途（如：实验室应依据用途（如：RNA检测用水），制定适检测用水），制定适宜的水质标准（如：应除宜的水质标准（如：应除RNase），并定期检测。），并定期检测。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业125.2设施和环境条件(3-2)5.2.2实验室应实施安全5.2设施和环境条件(3-3)5.2.6基基因因扩扩增增检检验验各各工工作作区区域域应应有有明明确确的的标标记记，不不同同工工作作区区域域内内的的设设备备、物物品品不不能能混混用用。进进入入各各工工作作区区域域应应按按照照单单一一方方向向进进行行，即试剂贮存和准备区即试剂贮存和准备区标本制备区标本制备区扩增区扩增区扩增产物分析区。扩增产物分析区。不不同同的的工工作作区区域域宜宜使使用用不不同同的的工工作作服服（如如不不同同的的颜颜色色）。工工作作人人员离开各工作区域时，不能将工作服带出。员离开各工作区域时，不能将工作服带出。5.2.7实验室应有限制进入的标志和措施。实验室应有限制进入的标志和措施。5.2.9实实验验室室应应有有足足够够的的、温温度度适适宜宜的的储储存存空空间间（如如冰冰箱箱），用用以以保保存存临临床床样样品品和和试试剂剂，设设置置目目标标温温度度和和允允许许范范围围，并并记记录录。实实验验室应有温度失控时的处理措施，并记录。室应有温度失控时的处理措施，并记录。5.2.10实实验验室室应应有有经经过过培培训训的的内内务务管管理理人人员员（如如保保洁洁人人员员），实实验验室应有地面、台面的维护、清洁和消毒计划及相关的记录。室应有地面、台面的维护、清洁和消毒计划及相关的记录。危险物品的存放及处置应遵守相关法规，并应有相关的使用记录。危险物品的存放及处置应遵守相关法规，并应有相关的使用记录。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业135.2设施和环境条件(3-3)5.2.6基因扩增检验各工5.3实验室设备(3-1)5.3.1实实验验室室应应制制定定设设备备、试试剂剂和和耗耗材材的的采采购购、验验收收等等管管理理程程序序，应应有有根根据据工工作作量量保保证证实实验验持持续续进进行行的的试试剂剂/耗耗材材订订购购计计划划，以以及及试剂试剂/耗材最低贮存量要求。耗材最低贮存量要求。基基因因扩扩增增实实验验室室如如从从事事RNA的的检检测测，应应具具有有高高速速冷冷冻冻离离心心机机。在在使使用用PCR-ELISA方方法法检检测测扩扩增增产产物物时时，应应配配置置洗洗板板机机并并使使用用洗洗板机洗板。一次性的加样器吸头应带有滤芯。板机洗板。一次性的加样器吸头应带有滤芯。5.3.2强强检检设设备备按按国国家家相相关关要要求求执执行行，应应进进行行外外部部校校准准的的设设备备，可按制造商校准程序进行。可按制造商校准程序进行。对对分分析析设设备备校校准准的的基基本本项项目目至至少少应应包包括括：加加样样系系统统、检检测测系系统统、温温控控系系统统。应应内内部部校校准准的的辅辅助助设设备备，实实验验室室应应制制定定内内部部校校准准程程序。序。应定期对应定期对PCR仪、加样器、温度计和恒温设备进行校准。仪、加样器、温度计和恒温设备进行校准。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业145.3实验室设备(3-1)5.3.1实验室应制定设备、试校准与检定校准：校准：在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统所指示的量值，或实物量具或参考物质所代表的量值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作。检定：检定：查明和确认计量器具是否符合法定要求的程序，它包括检查、加标记和（或）出具检定证书。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业15校准与检定校准：在规定条件下，为确定测量仪器或测量系统5.3实验室设备(3-2)5.3.4实验室应保存与检验质量有关的设备管理记录。实验室应提供对试剂和耗材检查、接收或拒绝、贮存和使用的记录，包括批号、效期、实验室接收日期、接收人和使用日期等。试剂耗材的质检记录至少包括：外观检查：肉眼可看出的，如包装完整性；性能检测：通过实验才能判断的，如耗材的抑制物、试剂批间的差异（应涵盖低浓度和高浓度，如安排过去检测过的临界阳性的患者标本加上病理定性检查的部分）。对于试剂性能质检记录，应能反映该批试剂：1）核酸提取效）核酸提取效率，率，2）核酸扩增效率。）核酸扩增效率。商品试剂记录包括：使用效期和启用日期。自配试剂记录包括：试剂名称或成分；规格；储存要求；制备或复融的日期；有效期；配制人。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业165.3实验室设备(3-2)5.3.4实验室应保存与检验质试剂质检试剂质检强调采用强调采用患者患者标本进行试剂质检的意义：标本进行试剂质检的意义：PCR实验时两个关键步骤实验时两个关键步骤：（：（1）从标本从标本中提取核酸；（中提取核酸；（2）提取核酸的扩增。）提取核酸的扩增。商品化的质控品和标准曲线的结果良好，商品化的质控品和标准曲线的结果良好，并非能反映提取试剂的质量。并非能反映提取试剂的质量。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业17试剂质检强调采用患者标本进行试剂质检的意义：医学实验室样品序号样品序号结果结果1（老试剂）（老试剂）结果结果2（新试剂）（新试剂）偏差偏差判定标准判定标准结论结论对数值对数值对数值对数值 偏倚偏倚% 偏倚偏倚%符合符合/不符合不符合1000% 7.5%符合符合23.023.12+3.3% 7.5%符合符合34.584.325.7% 7.5%符合符合46.245.964.5% 7.5%符合符合58.568.87+3.6% 7.5%符合符合医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业18样品序号结果1（老试剂）结果2（新试剂）偏差判定标准结论对数5.3实验室设备(3-3)5.3.6 PCR5.3.6 PCR扩增仪应配备稳压电源。扩增仪应配备稳压电源。5.3.7 5.3.7 设备故障修复后，实验室应对该设备性能进行验证设备故障修复后，实验室应对该设备性能进行验证，必要时需进行校准必要时需进行校准。实验室应首先分析故障原因，如果设备故障影响了方法学性实验室应首先分析故障原因，如果设备故障影响了方法学性能，可通过以下合适的方式进行相关的检测、验证（适用于能，可通过以下合适的方式进行相关的检测、验证（适用于定量项目）：定量项目）：可校准的项目结果超出允许范围时，实施校准；可校准的项目结果超出允许范围时，实施校准；质控品检测结果应在质控范围内；质控品检测结果应在质控范围内；与其他仪器的检测结果比较，偏差符合附录与其他仪器的检测结果比较，偏差符合附录A A的要求；的要求；使用留样再测结果进行判别，偏差符合附录使用留样再测结果进行判别，偏差符合附录A A的要求的要求。 特别注意的是：特别注意的是：评价故障对之前检验结果的影响评价故障对之前检验结果的影响。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业195.3实验室设备(3-3)5.3.6PCR扩增仪应配备基因扩增检验项目分析性能标准基因扩增检验项目分析性能标准A.1应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求。A.2自建检测系统分析性能标准：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），重复性精密度1/4TEa；中间精密度1/3TEa。A.3设备故障修复后，分析系统比对：5份样本，覆盖测量范围，包括医学决定水平，至少4份样本测量结果偏倚1/2TEa。A.4实验室内分析系统定期比对：样本数n20，浓度应覆盖测量范围，包括医学决定水平，计算回归方程，计算在医学决定性水平下的系统误差（偏倚%），应1/2TEa。A.5留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样本，5个样本，覆盖测量范围，考虑医学决定水平，至少4个样本测量结果偏倚1/2TEa。A.6没有标准和室间质评要求时，实验室间结果比对合格标准可依据制造商声明的性能标准而制定。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业20基因扩增检验项目分析性能标准医学实验室认可技术要求的关键控制附录附录A:基因扩增检验项目分析性能标准基因扩增检验项目分析性能标准A.1应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求。应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求。A.2自建检测系统不精密度要求：以能力验证自建检测系统不精密度要求：以能力验证/室间质评评价界室间质评评价界限（靶值限（靶值 0.4对数值）作为允许总误差（对数值）作为允许总误差（TEa），重复性精密度），重复性精密度3/5TEa；中间精密度；中间精密度4/5TEa。A.3设备故障修复后，分析系统比对：设备故障修复后，分析系统比对：5份样本，覆盖测量范围，份样本，覆盖测量范围，至少至少4份样本测量结果偏倚份样本测量结果偏倚 7.5%。A.4实验室内分析系统定期比对：样本数实验室内分析系统定期比对：样本数n20，浓度应覆盖测量，浓度应覆盖测量范围，计算回归方程，计算系统误差应范围，计算回归方程，计算系统误差应 7.5%。A.5留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样本，留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样本，5个样本，覆盖测量范围，至少个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏倚个样本测量结果偏倚 7.5%。A.6没有标准和室间质评要求时，实验室间结果比对合格标准可没有标准和室间质评要求时，实验室间结果比对合格标准可依据制造商声明的性能标准而制定。依据制造商声明的性能标准而制定。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业21附录A:基因扩增检验项目分析性能标准医学实验室认可技术1X103取对数取对数3；3 0.4； 0.4/3 13.33%；1X108取对数取对数8；8 0.4； 0.4/8 5%。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业221X103医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业2项目项目CLIA88基于生物学变异基于生物学变异合适性能合适性能(%)最佳性能最佳性能(%)最低性能最低性能(%)钾钾T0.5mmol/L5.82.98.7钠钠T4mmol/L0.90.41.3氯氯T5%1.50.72.2钙钙T0.25mmol/L2.41.23.6磷磷T20%10.25.115.3葡萄糖葡萄糖T10%6.93.510.4总蛋白总蛋白T10%3.41.75.2白蛋白白蛋白T10%3.91.95.8肌酐肌酐T15%8.24.112.2尿素尿素T9%15.77.823.5尿酸尿酸T17%12.46.218.6丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶T20%32.116.048.1门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶T20%15.27.622.8-谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶T20%22.211.133.3乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶T20%11.45.717.0碱性磷酸酶碱性磷酸酶T30%11.75.817.5肌酸激酶肌酸激酶T30%30.315.245.5淀粉酶淀粉酶T30%14.67.321.9总胆红素总胆红素T20%31.115.546.6三酰甘油三酰甘油T25%27.914.041.9总胆固醇总胆固醇T10%8.54.212.7高密度脂蛋白胆固醇高密度脂蛋白胆固醇T30%11.15.516.6低密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇T30%13.66.820.4载脂蛋白载脂蛋白A1T30%9.14.513.6载脂蛋白载脂蛋白BT30%11.65.817.5pO2T3sN/AN/AN/ApCO2T8%5.72.98.6pHT0.04N/AN/AN/A糖化血红蛋白糖化血红蛋白N/A4.32.26.5糖化白蛋白糖化白蛋白N/A7.23.610.8前白蛋白前白蛋白N/A14.57.221.7医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业23项目CLIA88基于生物学变异合适性能(%)最佳性能(%)5.4检验前程序5.4.3b)样品采集手册中应规定基因扩增检验标本留取的具体要求：如高压或Rnase灭活的洁净试管、抗凝管正确使用等。一般全血和骨髓标本应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本宜进行抗凝处理，并尽快（3小时内）分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜在抽血后1小时内分离血清；分泌物、拭子、肿瘤组织等标本留取的注意事项等。5.4.10基于组织/细胞学形态基础的检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认标本是否满足检测要求。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业245.4检验前程序5.4.3b)样品采集手册中应规定基如何正确采集患者标本，确保分子诊断检验结果准确可靠？如何正确采集患者标本，确保分子诊断检验结果准确可靠？1、规定标本采集的时间、规定标本采集的时间此项规定一方面应便于病人与检验人员做好准备，集中收集标本及时检测，尤其是RNA标本应在采集后及时处理以防RNA的降解。人的汗液，甚至空气中，都可能含有RNA酶，当RNA遇到RNA酶时会降解，造成检测结果误差。另一方面应考虑疾病发展过程中，标本采集过早过晚都可能给出假阴性结果。比如，获得性梅毒分三期期（初期）梅毒：外生殖器溃疡渗出物中有大量的TP；期（中期）在梅毒疹与淋巴结中存在大量的TP；期（晚期）病变波及全身组织器官，病损处TP少。2、标本的类型和采集量、标本的类型和采集量标本的类型和采集量应根据所检测的病原体而定，并且重视和考虑同一病原体感染部位不同所采集的标本类型亦不同。比如，肺部结核应取深部晨痰；神经系统结核应取脑脊液；泌尿系统结核应取尿液（清晨一次全部尿量或24小时尿沉渣）；胸腔腹腔结核可取胸水、腹水；另外对于病变部位不明的病人亦可采取血液抗凝。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业25如何正确采集患者标本，确保分子诊断检验结果准确可靠？医学实验3、标本采集中的防污染措施、标本采集中的防污染措施（1）标本采集采用一次性材料。（2）标本应装在封闭的无菌一次性容器中。（3）标本应收集在专用的容器内，而不能与其他检测项目共用同一份标本，因为这样做大大增加了标本间污染的可能，若是进行RNA检测的标本易受RNA酶污染。4、标本的抗凝要求、标本的抗凝要求一般全血和骨髓标本应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本宜进行抗凝处理，并尽快（3小时内）分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜在抽血后1小时内分离血清；分泌物、拭子、肿瘤组织等标本留取的注意事项等。基于组织/细胞学形态基础的检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认标本是否满足检测要求。5、其它注意事项、其它注意事项对于取材来自男性尿道或女性生殖道的分泌物或拭子等标本，要特别注意是否取到病变的样本，否则容易出现假阴性。对这类样本，临床上往往存在一个误区，即临床医生希望检验科能报告定量的结果，如性病的治疗、优生优育检查。虽然PCR方法本身是可以准确定量的，但因取材无法定量，故此这类检验结果实际上无法准确定量。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业263、标本采集中的防污染措施医学实验室认可技术要求的关键控制点5.5检验程序5.5.1如如果果使使用用内内部部程程序序，如如自自建建检检测测系系统统，应应有有程程序序评评估估并并确确认认分分析析性性能能符符合合预预期期用用途途。对对于于定定量量检检测测项项目目内内容容应应至至少少包包括括正正确确度度、精精密密度、可报告范围、生物参考区间等。度、可报告范围、生物参考区间等。5.5.2实实验验室室应应在在应应用用于于医医学学检检验验之之前前验验证证所所使使用用的的检检验验方方法法和和程程序序的的分分析析性性能能，对对于于定定量量检检测测项项目目内内容容至至少少包包括括正正确确度度、精精密密度度、可可报报告告（或或线线性性）范范围围等等。对对于于定定性性检检测测项项目目内内容容应应包括灵敏度、特异性或符合率及重复性。包括灵敏度、特异性或符合率及重复性。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业275.5检验程序5.5.1如果使用内部程序，如自建检测系统5.6检验程序的质量保证(4-1)5.6.1实实验验室室应应制制定定室室内内质质量量控控制制程程序序，可可参参照照GB/T20468-2006临临床床实实验验室室定定量量测测定定室室内内质质量量控控制制指指南南。质质量量控控制制程序中应有针对核酸检测中防污染的具体措施。程序中应有针对核酸检测中防污染的具体措施。质质控控图图应应包包括括质质控控结结果果、质质控控品品名名称称、浓浓度度、批批号号和和有有效效期期、质质控控图图的的中中心心线线和和控控制制界界线线、分分析析仪仪器器名名称称和和唯唯一一标标识识、方方法法学学名名称称、检检验验项项目目名名称称、试试剂剂和和校校准准品品批批号号、每每个个数数据据点点的的日日期期和和时时间间、干干扰扰行行为为的的记记录录、质质控控人人员员及及审审核核人人员员的的签签字、失控时的分析处理程序和纠正措施等。字、失控时的分析处理程序和纠正措施等。对对于于定定性性检检测测项项目目，每每次次实实验验应应设设置置阴阴性性、弱弱阳阳性性和和阳阳性性质质控。质控规则应确保试验的稳定性和检验结果的可靠性。控。质控规则应确保试验的稳定性和检验结果的可靠性。实验室应检查失控对之前检验的影响。实验室应检查失控对之前检验的影响。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业285.6检验程序的质量保证(4-1)5.6.1实验室应制定5.6检验程序的质量保证(4-2)5.6.3对于定量检测项目，使用配套分析系统时，实验室可使用制造商提供的溯源性文件。使用非配套分析系统时，实验室应采用有证参考物质、正确度控制品等进行正确度验证或与经确认的参考方法进行结果比对以证明实验室检验结果的正确度。如以上无法实现，则通过如下方式提供结果可信度的证明：参加适宜的能力验证计划（PT）、室间质评计划（EQA），且在近期一个完整的周期内成绩合格，或与已获认可的实验室或其它使用相同检测方法的配套系统的同级别或高级别医疗机构实验室进行比对。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业295.6检验程序的质量保证(4-2)5.6.3对于定量检测5.6检验程序的质量保证(4-3)5.6.4实实验验室室应应按按照照CNAS-RL02能能力力验验证证规规则则的的要要求求参参加加相相应的能力验证活动。应的能力验证活动。应应采采用用相相同同的的检检测测系系统统检检测测质质控控样样本本与与患患者者样样本本；室室间间质质评评活活动动需需由由从从事事常常规规检检验验工工作作的的人人员员执执行行；应应有有禁禁止止与与其其他他实实验验室室之之间间核核对对上上报报PT、EQA结结果果的的规规定定；应应能能提提供供参参加加PT、EQA活活动动的的结结果果和和证证书书。实实验验室室应应对对“不不满满意意”和和“不不合合格格”的的PT、EQA结果建立分析和纠正措施，并记录。结果建立分析和纠正措施，并记录。实实验验室室负负责责人人或或指指定定负负责责人人应应监监控控室室间间质质量量评评价价活活动动的的结结果果，并在结果报告上签字。并在结果报告上签字。5.6.5对对没没有有开开展展PT或或EQA的的检检测测项项目目，实实验验室室应应通通过过与与其其他他实实验验室室（如如已已获获认认可可的的实实验验室室或或其其它它使使用用相相同同检检测测方方法法的的配配套套系系统统的的同同级级别别或或高高级级别别实实验验室室）比比对对的的方方式式，判判断断检检验验结结果果的的可可接受性。接受性。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业305.6检验程序的质量保证(4-3)5.6.4实验室应按照C5.6检验程序的质量保证(4-4)5.6.6实实验验室室用用两两套套及及以以上上检检测测系系统统检检测测同同一一项项目目时时，应应有有比比对对数数据据表表明明其其检检测测结结果果的的一一致致性性，比比对对频频次次每每年年至至少少2次次，每每次次不不少少于于5份份样样本本，浓浓度度水水平平覆覆盖盖测测量量范范围围；比比对对结结果果的的系系统统偏偏倚倚应应符符合合附附录录A的的要要求。求。使用不同生物参考区间的检测系统间不宜进行比对。使用不同生物参考区间的检测系统间不宜进行比对。5.6.7实实验验室室管管理理层层应应定定期期检检查查室室内内质质量量控控制制记记录录（最最少少每每月月一一次次）和和能能力力验验证证结结果果。应应有有针针对对内内部部质质量量控控制制和和外外部部质质量量评评价价“不不满满意意”结结果果采采取取纠纠正正措措施的记录。质量控制记录至少应保留施的记录。质量控制记录至少应保留2年。年。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业315.6检验程序的质量保证(4-4)5.6.6实验室用两套5.6检验程序的质量保证n一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理释出的原理n核酸的分离纯化核酸的分离纯化n靶核酸提取的质量靶核酸提取的质量 n临床标本及核酸提取中可能存在的抑制临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质和干扰物质 n核酸样本制备及扩增检测的质控核酸样本制备及扩增检测的质控 n产物检测的质控产物检测的质控 核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业325.6检验程序的质量保证一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内5.6检验程序的质量保证一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在则靶核酸亦可存在于细胞外。于细胞外。一般均使用去垢剂一般均使用去垢剂(如如Triton-100)裂解细胞，用一裂解细胞，用一种蛋白裂解酶种蛋白裂解酶(如蛋白酶如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业335.6检验程序的质量保证一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内5.6检验程序的质量保证核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。扰核酸扩增的物质去除。经典方法经典方法硅吸附法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。行评价。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业345.6检验程序的质量保证核酸的分离纯化核酸的分离纯化就是要5.6检验程序的质量保证靶核酸提取的质量靶核酸提取的质量纯化的靶核酸的完整性：纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：核酸提取的产率：可在可在A260读数测定。读数测定。核酸纯度：核酸纯度：可通过提取物可通过提取物A260/A280比率判定比率判定血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果。检测，比较所得到的结果。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业355.6检验程序的质量保证靶核酸提取的质量纯化的靶核酸的完整DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业36医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业365.6检验程序的质量保证临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质临床标本中：临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解、降解靶核酸的核酸酶等。靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂氯仿、乙醇等有机溶剂。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业375.6检验程序的质量保证临床标本及核酸提取中可能存在的抑制5.6检验程序的质量保证实验室应有室内质控方案和室间质评计实验室应有室内质控方案和室间质评计1.室内质量控制标准操作程序；室内质量控制标准操作程序；阳性对照、阴性对照、试剂空白对照、阳性对照、阴性对照、试剂空白对照、阳性（临界值）对照阳性（临界值）对照2.实验室应参加实验室应参加EQA。失控结果的分析，纠正措施及其效果评价等失控结果的分析，纠正措施及其效果评价等。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业385.6检验程序的质量保证实验室应有室内质控方案和室间质评计5.6检验程序的质量保证无商品化质控物时，可采用自制的质控物。无商品化质控物时，可采用自制的质控物。质控物的评价：均一性、瓶间差、稳定性等。质控物的评价：均一性、瓶间差、稳定性等。理想质控物：理想质控物：基质与待测样本一致；基质与待测样本一致；所含待测物浓度接近试验的决定性水平；所含待测物浓度接近试验的决定性水平；稳定；稳定；靶值或预期结果已定；靶值或预期结果已定；无已知的生物传染危险性；无已知的生物传染危险性；单批可大量获得；单批可大量获得；价廉。价廉。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业395.6检验程序的质量保证无商品化质控物时，可采用自制的质控5.7检验后程序检验结果的审核；检验结果的审核；原始样品及其他实验室样品的保存应符原始样品及其他实验室样品的保存应符合经批准的政策合经批准的政策；不再用于检验样品的安全处置应符合废不再用于检验样品的安全处置应符合废弃物处置的法规或有关废弃物管理的规弃物处置的法规或有关废弃物管理的规定。定。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业405.7检验后程序检验结果的审核；医学实验室认可技术要求的关5.8结果报告(2-1)检测结果的报告应准确、清晰、明确和客观；检测结果的报告应准确、清晰、明确和客观；定性测定报告定性测定报告“阴性阴性”或或“阳性阳性”，定量测定则以，定量测定则以拷贝数拷贝数/ml或或IU/ml报告，避免二者的混淆；报告，避免二者的混淆；每份报告应包括以下信息：标题，如每份报告应包括以下信息：标题，如“检测报告检测报告”、报告的唯一标识（如序号）、被检测标本的说明、报告的唯一标识（如序号）、被检测标本的说明、检测标本的特性和状态、检测标本的接收日期和进检测标本的特性和状态、检测标本的接收日期和进行检测的日期、采用的检测方法、实验操作及校核行检测的日期、采用的检测方法、实验操作及校核人员的签字及签发日期、检测报告中应给出参考结人员的签字及签发日期、检测报告中应给出参考结果或范围（检测下限）；果或范围（检测下限）；医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业415.8结果报告(2-1)检测结果的报告应准确、清晰、明确和5.8结果报告(2-2)由于任何原因导致报告的有效性发生疑问时，由于任何原因导致报告的有效性发生疑问时，实验室应立即通知临床相关科室予以改正；实验室应立即通知临床相关科室予以改正；当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其它电子和电磁设备传送结果时，实验室应保证它电子和电磁设备传送结果时，实验室应保证工作人员遵循文件化的程序，并为对方保密。工作人员遵循文件化的程序，并为对方保密。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业425.8结果报告(2-2)由于任何原因导致报告的有效性发生疑定量定量PCR试验HCV-RNA使用使用GBW09151标准准物物质验证准确性，定准确性，定值1.090.27105 IU/ml,实测0.79105 IU/ml，偏差偏差27.5%，超出定超出定值范范围，未未进行行处理理（5.6.3）。）。（0.790.791.091.09）/1.09*100% = 27.5%/1.09*100% = 27.5%假定一个靶假定一个靶值为1*101*104 4; ;如果如果检测结果果为1*101*103 3，则（1*101*103 3 -1*10-1*104 4）/ / 1*101*104 4 =0.9=90%;=0.9=90%;如果如果检测结果果为1*101*105 5，则（1*101*105 5 -1*10-1*104 4）/ / 1*101*104 4 =9=900%=9=900%。不符合项案例不符合项案例医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业43定量PCR试验HCV-RNA使用GBW09151标准物质验证HBV-DNA可报告范围为103108，HCV-RNA可报告范围为103107，标准曲线和室内质控的浓度设定都在104以上，建议观察103低浓度值。（5.6.1）。）。观察项案例观察项案例医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业44HBV-DNA可报告范围为103108，HCV-RNA可报医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业45医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业45医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业46医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业46 扩增及产物分析区（扩增及产物分析区（3 3区）区）实验前实验前 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭） 实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%70%）扩增仪操作： 开机自检及运行正常 按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定标准曲线计算值：标准曲线计算值：Slope值值： （ ）Intercept值值： （ ） r值值： （ ）室内质控结果：室内质控结果：结果： 填写室内质控记录、描质控图 是否失控：是否失控：否 是 实验结果：实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后：实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。 操作者：操作者： 失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按XXXSOP进行）医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业47扩增及产物分析区常用质控规则的符号及定义常用质控规则的符号及定义常用质控规则的符号及定义常用质控规则的符号及定义 符号符号符号符号定定定定 义义义义1 1 1 12S2S2S2S一个质控测定值超出一个质控测定值超出一个质控测定值超出一个质控测定值超出2s2s2s2s控制限。控制限。控制限。控制限。1 1 1 13S3S3S3S一个质控测定值超出一个质控测定值超出一个质控测定值超出一个质控测定值超出3s3s3s3s控制限。控制限。控制限。控制限。2 2 2 22S2S2S2S两个连续的质控测定值同时超出两个连续的质控测定值同时超出两个连续的质控测定值同时超出两个连续的质控测定值同时超出+2s+2s+2s+2s或或或或2s2s2s2s控制限。控制限。控制限。控制限。R R R R4S4S4S4S同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s4s4s4s控制限。控制限。控制限。控制限。4 4 4 41S1S1S1S四个连续的质控测定值同时超出四个连续的质控测定值同时超出四个连续的质控测定值同时超出四个连续的质控测定值同时超出+1s+1s+1s+1s或或或或1s1s1s1s控制限。控制限。控制限。控制限。7 7 7 7T T T T七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。10101010X X X X十个连续的质控测定值同时处于均值（十个连续的质控测定值同时处于均值（十个连续的质控测定值同时处于均值（十个连续的质控测定值同时处于均值（X X X X）的同一侧。）的同一侧。）的同一侧。）的同一侧。医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业48常用质控规则的符号及定义符号定义12S一个质控测定值谢谢谢！谢！医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业49谢谢！医学实验室认可技术要求的关键控制点pcr专业49