第七章第七章 微生物的生长与控制微生物的生长与控制生命个体重量的增加和体积的增大生命个体重量的增加和体积的增大生生 长长生命个体数目的增加生命个体数目的增加 繁繁 殖殖群体中个体数目的增加。可以用重群体中个体数目的增加。可以用重量、数量、浓度等来衡量。量、数量、浓度等来衡量。群体生长群体生长群体生长群体生长 = 个体生长个体生长 + 个体繁殖个体繁殖第一节第一节 微生物纯培养的分离方法微生物纯培养的分离方法纯培养纯培养(pure culture):在实验条件下由一个细胞经在实验条件下由一个细胞经培养繁殖而得到的后代。培养繁殖而得到的后代。平板划线分离法平板划线分离法稀释平板法稀释平板法单孢子或单细胞分离法单孢子或单细胞分离法选择性培养基分离法选择性培养基分离法 平板划线分离法（平板划线分离法（Streak PlateStreak Plate）特点：快速、方便。特点：快速、方便。 分区划线（适用于分区划线（适用于浓度较大浓度较大的样品）的样品） 连续划线（适用于连续划线（适用于浓度较小浓度较小的样品）的样品）稀释平板法稀释平板法（ Spread Plate Spread Plate ）应用广泛，适合于各应用广泛，适合于各大类微生物的分离大类微生物的分离单孢子或单细胞分离法单孢子或单细胞分离法 采用显微分离技术从混杂群体中直接分离单个细胞或采用显微分离技术从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。单个个体进行培养以获得纯培养的方法。毛细管法：毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。生物。显微操作仪：显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。子以获得纯培养。选择性培养分离法选择性培养分离法 利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离 Ashby Ashby培养基、培养基、MartinMartin培养、高氏培养、高氏1 1号等。号等。富集培养富集培养 方法一：方法一：可利用该分离对象对某种营养物有特殊可利用该分离对象对某种营养物有特殊“嗜好嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物。的原理，专门在培养基中加入该营养物。如如 加加入纤维素、石蜡油、较浓的糖液等来富集相应的入纤维素、石蜡油、较浓的糖液等来富集相应的M M。 方法二：方法二：利用该分离对象对某种抑菌物质所特有的利用该分离对象对某种抑菌物质所特有的抗性，而使其大量繁殖。抗性，而使其大量繁殖。如加入抗生素。如加入抗生素。 同时用于选择性的其他理化因子还有温度、氧、同时用于选择性的其他理化因子还有温度、氧、pHpH、渗透压等。渗透压等。第二节第二节 微生物生长繁殖的测定微生物生长繁殖的测定 测测定目的：定目的：评价培养条件、营养物质等对微生物生长的评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制( (或杀或杀死死) )作用的效果；作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；客观地反映微生物生长的规律；个体计数法个体计数法直接法直接法间接法间接法血球计数板法血球计数板法涂片染色法涂片染色法平板菌落数法平板菌落数法薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法比浊法比浊法重量法重量法生理指标法生理指标法直接法直接法- -血球计数板法血球计数板法1.1.个体个体计数法计数法 1适用范围：适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1 1）细菌细胞太小，较透明；（）细菌细胞太小，较透明；（2 2）在油镜下看）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。不清网格线，超出油镜工作距离。特点：特点：快速，准确；不易区分死菌和活菌。快速，准确；不易区分死菌和活菌。解决方法：解决方法：用美蓝液对酵母菌染色后，其活细胞用美蓝液对酵母菌染色后，其活细胞为无色，而死细胞则为蓝色为无色，而死细胞则为蓝色直接法直接法- -涂片染色法涂片染色法应用：应用：适于土壤、牛奶中细菌计数。适于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取用镜台测微尺计算出视野面积；取0.10.1mlml菌液菌液 涂于涂于1 1cmcm2 2面积上，计数后代入公式：面积上，计数后代入公式： 每每mlml原菌液含菌数原菌液含菌数= =视野中平均菌数视野中平均菌数涂布面积涂布面积/ /视野面积视野面积1010 稀释倍数稀释倍数间接法间接法-平板菌落计数法平板菌落计数法原理原理：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。可以通过生长形成菌落。 特点：特点：最为常用最为常用, ,只计活菌数，但操作较烦琐且只计活菌数，但操作较烦琐且要求操作者技术熟练。要求操作者技术熟练。改进技术：改进技术：现在已出现多种微型、快速、商品化现在已出现多种微型、快速、商品化的用于菌落计数的密封琼脂板。原理是利用的用于菌落计数的密封琼脂板。原理是利用活菌活菌批示剂批示剂TTCTTC（2,3,5-2,3,5-氯化三苯基四氮唑氯化三苯基四氮唑) )，它可使，它可使菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰红色。菌落在很微小时就染成易于辨认的玫瑰红色。常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。品中所含菌数。间接法间接法-薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法原理原理: :在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。度。特点：特点：快速、快速、简便；但易受便；但易受干干扰。间接法间接法- -比浊法比浊法测定范围：多细胞及丝状真菌的生长测定范围：多细胞及丝状真菌的生长将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来, ,然后烘干然后烘干( (干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。称重。（微生物的干重一般为其湿重的（微生物的干重一般为其湿重的1020%）2.2.重量法重量法 测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.256.25，就可，就可测得粗蛋白的含量。测得粗蛋白的含量。其他方法其他方法含碳、磷、含碳、磷、DNADNA、RNARNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。3.3.生理指标测定法生理指标测定法 第三节第三节 微生物的生长规律微生物的生长规律 一、单细胞微生物的群体生长规律一、单细胞微生物的群体生长规律 生长曲线生长曲线(growth curve):(growth curve):定量描述液体培养基中定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线微生物群体生长规律的实验曲线. .方法方法: : 将少量细菌的纯培养体接种到恒容积的液体将少量细菌的纯培养体接种到恒容积的液体培养基中培养基中, ,在适宜的条件下培养在适宜的条件下培养, ,定期测定菌体数定期测定菌体数量量, , 以培养时间为横坐标，以菌数对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，以菌数对数为纵坐标，作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。的曲线。按照生长速率常数（按照生长速率常数（growth race constant），即每小，即每小时分裂次数（时分裂次数（R）的不同，可将生长曲线分为）的不同，可将生长曲线分为:延滞期、延滞期、对数期、稳定期、衰亡期。对数期、稳定期、衰亡期。1.延滞期（延滞期（ lag phase）其它名称：停滞期、调整期、适应期其它名称：停滞期、调整期、适应期现象：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。活菌数没增加，曲线平行于横轴。特点：分裂迟缓，代谢活跃。特点：分裂迟缓，代谢活跃。生长速率常数生长速率常数=0；细胞形态变大或增长；细胞形态变大或增长；细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA含量增高；含量增高；合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），合成加快），易产生诱导酶。易产生诱导酶。原因：原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。的中间产物。通通过过遗遗传传学学方方法法改改变变种种的的遗遗传传特特性性-繁繁殖殖速速度度快快的菌种的菌种；利用对数生长期的细胞作为利用对数生长期的细胞作为“种子种子”；尽尽量量使使接接种种前前后后所所使使用用的的培培养养基基组组成成不不要要相相差差太太大；大；适当扩大接种量适当扩大接种量（群体优势（群体优势-适应性增强）适应性增强）缩短延滞期措施：缩短延滞期措施：2.对数期对数期（logarithmic phase） 其他名称：指数期其他名称：指数期 现象：现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。直线关系。 特点：生长速率常数最大，即代时最短特点：生长速率常数最大，即代时最短* *；细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等菌体大小、形态、生理特征等比较一致；比较一致；代谢最旺盛，营养消耗快。代谢最旺盛，营养消耗快。代时（代时（generation timegeneration time，G G）：）：单个细胞完成一次分单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。裂所需时间，亦即增加一代所需时间。影响代时的因素：影响代时的因素：v菌种；菌种；v营养成分；营养成分；v营养物浓度营养物浓度* *；v培养温度。培养温度。公式：公式：G=t1t0/n x2=x12 n n=(lgx2 - lgx1)/lg2导出导出 G = (t1t0 )/3.3(lgx2 - lgx1)例如：一培养液中微生物数目由开始的例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经），经4h （ t ）后增加到后增加到49，000，000（ b ），），这样，这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112借助于借助于 n 和和 t ，还可以计算出不同培养条件下的，还可以计算出不同培养条件下的代时代时G， G t / n在本例中，在本例中， G 460 / 12 20min该种微生物的代时为该种微生物的代时为20分钟。在分钟。在4小时内共繁殖了小时内共繁殖了12代。代。不同种细菌的代时不同种细菌的代时菌名菌名培养基培养基 培养温度培养温度 代时代时E. coli（大肠杆菌）大肠杆菌） 肉汤肉汤 3717minE. coli 牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 37 1618E. aerogenes 组合组合 372944B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）嗜酸乳杆菌）牛奶牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）乳酸链球菌）牛奶牛奶3726S. lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）褐球固氮菌）葡萄糖葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）活跃硝化杆菌）组合组合271200不同温度下的代时不同温度下的代时温度对微生物的代时有明显影响：温度对微生物的代时有明显影响： E. Coli 在不同温度下的代时在不同温度下的代时温度（温度（）代时（分）代时（分）温度（温度（）代时（分）代时（分）10860352215120371720904017.525404520302947.577营养物浓度与对数期生长速率和产量营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：作用方式： 影响微生物的生长速率和总生长量影响微生物的生长速率和总生长量8.08.0mg/mlmg/ml6.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml0.1mg/ml只最大收只最大收获量受影响获量受影响生长速度和最大生长速度和最大收获量受影响收获量受影响时间时间细胞数或菌体量细胞数或菌体量凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养，称为生长限制因子（某营养，称为生长限制因子（growth-limited factor)应用意义：应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；菌体密度； 是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态遗传研究或进行染色、形态观察等观察等的良好材料的良好材料；3.稳定期稳定期（stationary phase） 又称：恒定期或最高生长期又称：恒定期或最高生长期特点：生长速率常数特点：生长速率常数R为零为零新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物微生物的的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。开始产芽孢。此时期的微生物开始此时期的微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物。产生原因：产生原因：营养物几乎耗尽；营养物几乎耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适；营养物的比例失调，如碳氮比不合适；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（物化条件（pHpH、氧化还原势等）不合适；氧化还原势等）不合适；应用意义：应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充补充营养物质（补料）、调营养物质（补料）、调pHpH、调整温度；、调整温度；稳定期细胞数目及与菌体生长相平行产物的积累达稳定期细胞数目及与菌体生长相平行产物的积累达到最高，到最高，是最佳的收获时期是最佳的收获时期。4.4.衰亡期（衰亡期（decline phasedecline phase）特点：生长速率常数特点：生长速率常数R为负值为负值细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降；群体中的活菌数目急剧下降；细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放；因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等。亡、自溶等。产生原因：产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡超过合成代谢，继而导致菌体的死亡丝状微生物的群体生长丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢子或菌丝片断接种，在液丝状微生物的纯培养采用孢子或菌丝片断接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，以时间体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。可分为三个阶段：可分为三个阶段：生长停滞期生长停滞期快速生长期快速生长期衰退期衰退期分批培养分批培养（batch culturebatch culture） ：将微生物置于一：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养连续培养（continuous culturecontinuous culture） ：在微生物培：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。二、连续培养二、连续培养 连续培养连续培养理论基础：理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。发展出现在的连续培养技术。原理：原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。状态和稳定的生长速率。按控制方式分按控制方式分按培养器的级数分按培养器的级数分按细胞状态分按细胞状态分按用途分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器生长速率）：恒化器单级连续培养器单级连续培养器多级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐发酵生产用：连续发酵罐连续培养器连续培养器A.A.恒化连续培养恒化连续培养概念：概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。长速率恒定的方法。 原理：原理：通过控制某一种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生（如碳、氮源、生长因子等）长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，从而使，使其始终成为生长限制因子，从而使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。殖。特点：特点：维持营养成分的维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生物生长速率。，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一，产量低于最高菌体产菌体生长速率恒定，菌体均一，产量低于最高菌体产量。量。应用范围：应用范围：实验室科学研究实验室科学研究概念：概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。的连续培养方法。原理：原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来的速度来维持菌浓度不变维持菌浓度不变, ,即浊度不变即浊度不变。主要采用恒。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。降低，则减慢培养基的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度并可在允许范围内控制不同的菌体密度；使用范围：使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。B.B.恒浊培养连续培养恒浊培养连续培养装置装置控制对象控制对象培养培养基基培养基培养基流速流速生长速生长速率率产物产物应用应用范围范围恒浊器恒浊器 菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限无限制生制生长因长因子子不恒定不恒定最高最高大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体形成相平形成相平行的产物行的产物生产生产为主为主恒化器恒化器 培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限有限制生制生长因长因子子恒定恒定低于最低于最高高不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验实验室为室为主主恒浊器与恒化器的比较恒浊器与恒化器的比较连续发酵与单批发酵相比连续发酵与单批发酵相比优点：优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；产品质量较稳定；缺点：缺点：杂菌污染和菌种退化杂菌污染和菌种退化三、同步培养三、同步培养 1.概念概念同步培养同步培养(synchronous culture)：是一种能使群体是一种能使群体中所有个体细胞转变成能同时进行生长和分裂的中所有个体细胞转变成能同时进行生长和分裂的培养方法。培养方法。 同步生长同步生长(synchronous growth)： 通过通过同步培养的同步培养的手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态状态2.同步培养方法同步培养方法 机械方法机械方法环境条件诱导法环境条件诱导法离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法温度温度培养基成份控制培养基成份控制光照和黑暗交替培养光照和黑暗交替培养硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜法法离离心心法法第四节第四节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素一、温度对微生物生长的影响一、温度对微生物生长的影响影响酶活性影响酶活性影响细胞膜的流动性影响细胞膜的流动性影响物质的溶解度。影响物质的溶解度。从微生物整体来看从微生物整体来看:生长的温度范围一般在生长的温度范围一般在-10 100 但对于特定的某一种微生物：但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的自己的生长温度三基点生长温度三基点，即，即最低、最适、最高生长温度最低、最适、最高生长温度根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型三个类型：v低温型微生物低温型微生物v中温型微生物中温型微生物v高温型微生物高温型微生物粘质赛氏杆菌的生长最适温度为粘质赛氏杆菌的生长最适温度为37，而合成灵杆菌，而合成灵杆菌素的最适温度为素的最适温度为2025；黑曲霉生长最适温度为黑曲霉生长最适温度为37，而产糖化酶的最适温度，而产糖化酶的最适温度则是则是3234；以青霉素的生产为例：培养以青霉素的生产为例：培养165小时采用小时采用分段控制温分段控制温度度的方法，其青霉素产量比始终在的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了培养提高了14.7%。 30 25 20 250h 5h 40h 125h 165h微生物不同生理活动要求不同温度，所以最适生长温微生物不同生理活动要求不同温度，所以最适生长温度度 发酵速度快、积累代谢产物多。发酵速度快、积累代谢产物多。微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系中变化很大，根据微生物与氧的关系, ,可可把它们分为几种类群把它们分为几种类群: : 专性好氧菌专性好氧菌 好氧菌好氧菌 微好氧菌微好氧菌 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌耐氧厌氧菌 厌氧菌厌氧菌 ( (专性专性) )厌氧菌厌氧菌二、氧气对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响专性好氧菌（专性好氧菌（strict aerobestrict aerobe）必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SODSOD，superoxide dismutasesuperoxide dismutase）和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有细胞含有SODSOD和和过氧化氢酶。过氧化氢酶。微好氧菌（微好氧菌（microaerophilicmicroaerophilic bacteria bacteria）只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，为最终氢受体而产能，兼性好氧菌（兼性好氧菌（facultative aerobefacultative aerobe）耐氧菌（耐氧菌（aerotolerantaerotolerant anaerobe anaerobe）不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SODSOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。厌氧菌（厌氧菌（anaerobeanaerobe）分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；细胞内缺乏甚至致死；细胞内缺乏SODSOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。乏过氧化氢酶。三、三、pHpH微生物的生长微生物的生长pH值范围极广，从值范围极广，从pH10都有微都有微生物能生长。绝大多数种类都生活在生物能生长。绝大多数种类都生活在pH5.09.0之之间。各种微生物都有其生长的间。各种微生物都有其生长的最低、最适和最高最低、最适和最高pH值。值。最低最低最适最适最高最高细细 菌菌放线菌放线菌5.07.08.010.0酵母菌酵母菌2.54.05.88.0霉霉 菌菌1.53.86.07.011.0同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对化过程中，对pH值的要求也不同。值的要求也不同。在发酵工业中，控制在发酵工业中，控制pH值尤其重要，值尤其重要，举例：举例：Aspergillus niger在在pH22.5范围时有利于合成柠檬范围时有利于合成柠檬酸，当在酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而范围内时以菌体生长为主，而在在pH7.0时，则以合成草酸为主。时，则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为范围时，以菌体生长为主，而在主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。范围内才进行丙酮丁醇发酵。 生长的最适生长的最适pHpH值与发酵的最适值与发酵的最适pHpH值值第五节第五节 有害微生物的控制有害微生物的控制 一、基本概念一、基本概念 灭菌（灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使物体内外部的一切微生物永采用强烈的理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。如远丧失其生长繁殖能力的措施。如高温高温。消毒（消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，杀死物体表面或内部的一采用较温和的理化因素，杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施。如害的措施。如75%酒精。酒精。防腐（防腐（antisepsis）利用理化因素抑制霉腐微生物的生长繁殖，从利用理化因素抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施。包括而达到防止物品发生霉腐的措施。包括低温、低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂。缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂。化疗（化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。包括到治疗该传染病的一种措施。包括抗代谢药物、抗代谢药物、抗生素、生物药物素抗生素、生物药物素。1、高温灭菌（）、高温灭菌（）法法是最常用的是最常用的物理方法。物理方法。 高温可引起蛋高温可引起蛋白质、核酸等活性白质、核酸等活性大分子氧化或变性大分子氧化或变性失活而导致微生物失活而导致微生物死亡。死亡。 二、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法二、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法（一）温度（一）温度干热灭菌法（干热灭菌法（dry heat sterilization）灼烧法（灼烧法（incineration）：）：是将灭菌物体在火焰是将灭菌物体在火焰中燃烧，因其破坏力较强，故仅限于中燃烧，因其破坏力较强，故仅限于接种环、接种环、接种针、镊子的灭菌或带病原菌的材料、动物接种针、镊子的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。尸体的烧毁等。干燥热空气灭菌法干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入将物品放入烘箱内，然后升温至烘箱内，然后升温至150170 ，维持，维持12小时。小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。特点：特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。态下不易杀死，所以温度高、时间长。 湿热法湿热法(moist heat sterilization) (moist heat sterilization) ：特点：温度低、时间短、灭菌效果高特点：温度低、时间短、灭菌效果高原因：原因： 饱和水蒸汽穿透力强；饱和水蒸汽穿透力强； 蒸汽冷凝会放出潜热；蒸汽冷凝会放出潜热； 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。性，主要破坏氢键结构。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法方法：方法：121121（1kg/cm1kg/cm2 2或或1515磅磅/ /英寸英寸2 2）维持）维持1515-30min-30min。112112（0 0.5.5kg/cmkg/cm2 2或或8 8磅磅/ /英寸英寸2 2）2020- -3 30min0min。11115 5（0.750.75kg/cmkg/cm2 2或或1111磅磅/ /英寸英寸2 2）2020- -3 30min0min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度。适用：适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。 高高 压压 蒸蒸 汽汽 灭灭 菌菌 锅锅注意事项：注意事项：排净冷空气；排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压；灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。灭菌结束，趁热取出物品。煮沸消毒法煮沸消毒法将水加热至将水加热至100，煮沸，煮沸15min30min，可杀死所有可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物品目的。营养细胞和部分芽孢，达到消毒物品目的。巴斯德消毒法（巴斯德消毒法（Pasteurization）：）：低温长时法低温长时法(LTH)；62.930min处理牛奶处理牛奶高温瞬时法（高温瞬时法（HTS):71.615s处理牛奶处理牛奶超高温巴斯德灭菌法超高温巴斯德灭菌法(UHS):让液体食品停留在让液体食品停留在140左右左右3-4s，急剧冷却至急剧冷却至75，经匀质化后冷却至，经匀质化后冷却至20。间歇灭菌法：间歇灭菌法： 将待灭菌物品在将待灭菌物品在80-100蒸煮蒸煮15-60min，冷却冷却后搁置室温（后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过）下过夜，并重复以上过程三遍以上。程三遍以上。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、缺点是麻烦、费时。费时。高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的不利影响：高温对培养基的不利影响：会产生混浊或形成不溶性沉淀会产生混浊或形成不溶性沉淀营养成分被破坏（营养成分被破坏（ POPO4 4-3-3存在，葡萄糖生成酮糖，存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用菌不利用）；）；色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；色泽加深（褐变如产生氨基糖等）；改变培养基的改变培养基的pH值值（通常下降（通常下降0.20.2） ；形成有害物质，抑制微生物生长；形成有害物质，抑制微生物生长；消除有害影响的措施消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法过滤除菌法 加入螯合剂加入螯合剂l低温低温-低温是通过降低酶反应速度使微生物生低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制。长受到抑制。冷藏法冷藏法：44，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保，微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜存数周至数月而不衰竭死亡；食品保鲜冷冻法冷冻法：食品工业中采用：食品工业中采用-10-10左右的冷冻温度较左右的冷冻温度较长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但长时间地保藏食品；冷冻法也可用作菌种保藏，但所需温度更低，如所需温度更低，如-80-80低温冰箱、或低温冰箱、或-78-78干冰、干冰、或液氮中冷冻保存。或液氮中冷冻保存。2.2.低温抑菌低温抑菌(二）辐射作用二）辐射作用 (radiation Sterilization)辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。物质上的微生物的一种有效力法。 微波微波:通过热产生杀死微生物的作用；通过热产生杀死微生物的作用；紫外线紫外线(UV):使使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；复制与转录等功能，杀死微生物；X射线和射线和y射线射线:使其他物质氧化或产生自由基使其他物质氧化或产生自由基(OH、H)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。生物。 （三）过滤除菌（三）过滤除菌 应用：应用：含酶、血清、含酶、血清、维生素和氨基维生素和氨基酸等热敏物质酸等热敏物质除菌除菌三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂 （一）消毒剂（一）消毒剂 可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂害作用的化学试剂. . 主要用于抑制或杀灭物体表面、主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。器械、排泄物和环境中的微生物。石炭酸系数：石炭酸系数： 指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。伤寒沙门氏菌）。例例P179 类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围 醇类70%75%乙醇脱水、蛋白质变性皮肤、器皿 醛类0.5%10%甲醛2%戊二醛（pH=8） 蛋白质变性房间、物品消毒（不适合食品厂） 酚类3%5%石炭酸 2%来苏儿3%5%来苏儿破坏细胞膜、蛋白质变性地面、器具皮肤地面、器具氧化剂 0.1%高锰酸钾3%过氧化氢0.2%0.5%过氧乙酸氧化蛋白质活性基团，酶失活皮肤、水果、蔬菜皮肤、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用常用的消毒防腐剂及其应用类型 名称及使用方法 作用原理 应用范围重金属盐类0.05%0.1%升汞2%红汞0.1%1%硝酸银0.1%0.5%硫酸铜蛋白质变性、酶失活变性、沉淀蛋白蛋白质变性、酶失活非金属器皿皮肤、粘膜、伤口皮肤、新生儿眼睛防治植物病害表面活性剂0.05%0.1% 新洁尔灭0.05%0.1% 杜灭芬蛋白变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、器械皮肤、金属、棉织品、塑料概念：概念：指那些指那些能够特异性地作用于某些微生物并能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性具有选择毒性的化学药剂。的化学药剂。种类：种类： . .抗代谢药物抗代谢药物 . .抗生素抗生素（二）、化学治疗（二）、化学治疗剂剂1 1、抗代谢类药物（生长因子类似物）、抗代谢类药物（生长因子类似物）概念：概念：有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物抗代谢物。种类：种类： 磺胺类药物磺胺类药物对氨基本甲酸对氨基本甲酸 ； 6 - 巯基嘌呤巯基嘌呤嘌呤；嘌呤； 5 - 甲基色氨酸甲基色氨酸氨基酸；氨基酸； 异烟肼异烟肼吡哆醇。吡哆醇。 二二氢蝶氢蝶啶啶 + +对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 二氢叶酸二氢叶酸 四氢叶酸四氢叶酸 辅酶辅酶F F磺胺药磺胺药 核酸合成核酸合成二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶磺胺药作用机理：磺胺药作用机理：细菌需要利用对氨基苯甲酸合成生长所需的叶酸：细菌需要利用对氨基苯甲酸合成生长所需的叶酸：2 2、抗生素：、抗生素：概念：概念：是一类由是一类由微生物或其他生物在其生命过程中合成的次微生物或其他生物在其生命过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度下就能生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度下就能抑制或杀死其它生物的生长。抑制或杀死其它生物的生长。抗菌谱：抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）；窄谱：仅对某一类微生物有作土霉素、四环素）；窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素）用（如：多粘菌素）作用机制：作用机制：1 1）抑制细胞壁的合成；（如：青霉素）抑制细胞壁的合成；（如：青霉素） 2 2）破坏细胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于）破坏细胞膜功能；（如：多粘菌素可作用于膜磷脂使膜溶解）膜磷脂使膜溶解） 3 3）抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、）抑制蛋白质合成；（如：氯霉素，四环素、链霉素等）链霉素等） 4 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、新生霉素、）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、新生霉素、丝裂霉素、灰黄霉素）丝裂霉素、灰黄霉素）微生物的抗药性（微生物的抗药性（antibiotic resistanceantibiotic resistance）原因：原因：产生一种能药物失去活性的酶；产生一种能药物失去活性的酶；把药物作用的靶位加以修饰和改变；把药物作用的靶位加以修饰和改变；形成救护途径；形成救护途径；使药物不能透过细胞膜；使药物不能透过细胞膜；通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外外复复 习习 思思 考考 题题1.什么是纯培养？纯培养养的获得方法有哪些？什么是纯培养？纯培养养的获得方法有哪些？2.微生物的生长可通过哪些方法测定？微生物的生长可通过哪些方法测定？3.什么是典型生长曲线？它可分几个时期？各时期有何特点？什么是典型生长曲线？它可分几个时期？各时期有何特点？4.什么叫生长速率常数？什么叫代时？它们如何计算？什么叫生长速率常数？什么叫代时？它们如何计算？5.什么是连续培养？有何优点？什么是连续培养？有何优点？6.试比较恒化器与恒浊器连续培养的不同。试比较恒化器与恒浊器连续培养的不同。7.根据微生物对温度的要求不同，可将微生物分为哪几类？根据微生物对温度的要求不同，可将微生物分为哪几类？8.什么是最适温度和最适什么是最适温度和最适pH？9.根据微生物对氧的需求不同可将微生物分为哪几类？根据微生物对氧的需求不同可将微生物分为哪几类？10.什么是灭菌、消毒、防腐、化疗？什么是灭菌、消毒、防腐、化疗？11.利用加压蒸气对培养基灭菌时，常易带来哪些不利影响？如利用加压蒸气对培养基灭菌时，常易带来哪些不利影响？如何避免？何避免？12.什么为抗代谢药物？磺胺类药物的作用机制是什么？什么为抗代谢药物？磺胺类药物的作用机制是什么？13.什么是抗生素？微生物抗药性的原因有哪些？什么是抗生素？微生物抗药性的原因有哪些？