第九章第九章免疫检测技术免疫检测技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术免疫检测是目前生物学检测方法中免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法。用途最广泛的一种方法。具有高度精确、灵敏、特异的特点。具有高度精确、灵敏、特异的特点。可用于免疫学的基础理论和应用研可用于免疫学的基础理论和应用研究，也可应用于生物学研究的各个究，也可应用于生物学研究的各个领域。领域。最新免疫检测技术最新免疫检测技术 1 、免疫疾病诊断、免疫疾病诊断 2 、动物植物生理活动研究（激素、维生素）、动物植物生理活动研究（激素、维生素） 3 、物种及微生物鉴定、物种及微生物鉴定 4 、动物、植物性状的免疫标记、动物、植物性状的免疫标记 5 、免疫增强药物和疫苗的研究、免疫增强药物和疫苗的研究 6 、发病机理研究、发病机理研究 7 、分子生物学研究、分子生物学研究 免疫检测技术在生物科学领域中的应用免疫检测技术在生物科学领域中的应用：最新免疫检测技术最新免疫检测技术第一节第一节 抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。用已知抗原检测标本中有无相应抗体。用已知抗原检测标本中有无相应抗体。用已知抗原检测标本中有无相应抗体。这种特性就是许多免疫检测方法的基础这种特性就是许多免疫检测方法的基础这种特性就是许多免疫检测方法的基础这种特性就是许多免疫检测方法的基础!最新免疫检测技术最新免疫检测技术一、体外抗原抗体反应的特点一、体外抗原抗体反应的特点特异性：特异性：特异性：特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。可逆性：可逆性：可逆性：可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，抗原抗体反应所形成的复合物较稳定， 但在一定条件下可解离。但在一定条件下可解离。但在一定条件下可解离。但在一定条件下可解离。（低酸、高盐）（低酸、高盐）（低酸、高盐）（低酸、高盐）比例性：比例性：比例性：比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的抗原抗体的比例合适，才可出现可见的抗原抗体的比例合适，才可出现可见的抗原抗体的比例合适，才可出现可见的 反应现象。（网格理论）反应现象。（网格理论）反应现象。（网格理论）反应现象。（网格理论）阶段性：阶段性：阶段性：阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。特异性结合阶段和可见反应阶段。特异性结合阶段和可见反应阶段。特异性结合阶段和可见反应阶段。最新免疫检测技术最新免疫检测技术网格理论网格理论网格理论网格理论解释抗原抗体形成沉淀的机制解释抗原抗体形成沉淀的机制解释抗原抗体形成沉淀的机制解释抗原抗体形成沉淀的机制最新免疫检测技术最新免疫检测技术网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗体过剩抗原过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗体抗体比例合适抗原抗原抗体抗体最新免疫检测技术最新免疫检测技术二、影响抗原抗体反应的因素二、影响抗原抗体反应的因素温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应 速度，缩短反应时间，常用反应温度为速度，缩短反应时间，常用反应温度为速度，缩短反应时间，常用反应温度为速度，缩短反应时间，常用反应温度为37-4537-45。溶液的溶液的溶液的溶液的pHpH：pHpH过高或过低可改变抗原和抗体理化过高或过低可改变抗原和抗体理化过高或过低可改变抗原和抗体理化过高或过低可改变抗原和抗体理化 性质，影响反应结果，因此溶液的性质，影响反应结果，因此溶液的性质，影响反应结果，因此溶液的性质，影响反应结果，因此溶液的pHpH应适宜应适宜应适宜应适宜 （pH 6-8pH 6-8）。）。）。）。电解质：反应中必须有适宜的电解质电解质：反应中必须有适宜的电解质电解质：反应中必须有适宜的电解质电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl0.85%NaCl） 参与，否则不出现可见反应。参与，否则不出现可见反应。参与，否则不出现可见反应。参与，否则不出现可见反应。最新免疫检测技术最新免疫检测技术三、抗原抗体反应类型三、抗原抗体反应类型1.沉淀反应沉淀反应2.凝集反应凝集反应3.补体参与的反应补体参与的反应4.中和反应中和反应5.免疫标记技术免疫标记技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术第二节第二节 常见免疫检测方法常见免疫检测方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。一、免疫沉淀反应一、免疫沉淀反应最新免疫检测技术最新免疫检测技术一、免疫沉淀反应一、免疫沉淀反应 1. 1. 液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应液相沉淀反应2. 2. 凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀3. 3. 凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳凝胶免疫电泳絮状沉淀絮状沉淀环状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳血清免疫电泳血清免疫电泳血清免疫电泳火箭电泳火箭电泳火箭电泳火箭电泳对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳免疫印迹等免疫印迹等免疫印迹等免疫印迹等最新免疫检测技术最新免疫检测技术絮状沉淀试验絮状沉淀试验操作步骤：操作步骤：操作步骤：操作步骤：（1 1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。将可溶性抗原作一系列倍比稀释。将可溶性抗原作一系列倍比稀释。将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2 2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。各管加入一定浓度的适量抗血清。各管加入一定浓度的适量抗血清。各管加入一定浓度的适量抗血清。（3 3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置振摇使抗原、抗体充分混匀，置振摇使抗原、抗体充分混匀，置振摇使抗原、抗体充分混匀，置3737孵育。孵育。孵育。孵育。（4 4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。为最适比例管。为最适比例管。为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前目前目前目前多用以测定抗原抗体反应的最适比多用以测定抗原抗体反应的最适比多用以测定抗原抗体反应的最适比多用以测定抗原抗体反应的最适比。 最新免疫检测技术最新免疫检测技术环状沉淀试验环状沉淀试验操作步骤：操作步骤：（1 1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5 550mm50mm）底部，避）底部，避）底部，避）底部，避免产生气泡。（已知！）免产生气泡。（已知！）免产生气泡。（已知！）免产生气泡。（已知！）（2 2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待测！交界面。（待测！交界面。（待测！交界面。（待测！ ）（3 3） 置沉淀管于室温下使其反应，置沉淀管于室温下使其反应，置沉淀管于室温下使其反应，置沉淀管于室温下使其反应，15min15min内在两界面间呈现内在两界面间呈现内在两界面间呈现内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。乳白色沉淀环为阳性。乳白色沉淀环为阳性。乳白色沉淀环为阳性。30min30min仍无沉淀环出现则为阴性。仍无沉淀环出现则为阴性。仍无沉淀环出现则为阴性。仍无沉淀环出现则为阴性。应用：应用：应用：应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的（诊断炭疽的（诊断炭疽的（诊断炭疽的AscoliAscoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。实验、细菌分型、血迹鉴定）。实验、细菌分型、血迹鉴定）。实验、细菌分型、血迹鉴定）。 最新免疫检测技术最新免疫检测技术2. 凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。位相遇形成沉淀线的反应。位相遇形成沉淀线的反应。位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有常用的凝胶有常用的凝胶有常用的凝胶有琼脂琼脂琼脂琼脂、琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖、葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖或或或或聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶凝胶凝胶凝胶等。等。等。等。最常用的方法为：最常用的方法为：最常用的方法为：最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验最新免疫检测技术最新免疫检测技术单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 原原 理：理： 将适当浓度的将适当浓度的抗体抗体混入琼脂凝胶中，琼脂混入琼脂凝胶中，琼脂凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质，凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质，使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。最新免疫检测技术最新免疫检测技术 单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图单向免疫扩散试验示意图最新免疫检测技术最新免疫检测技术双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。两种抗原材料的抗原相关性分析。最新免疫检测技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术3.免疫电泳技术免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括免疫电泳包括免疫电泳包括免疫电泳包括: :血清免疫电泳、对流免疫电泳、血清免疫电泳、对流免疫电泳、血清免疫电泳、对流免疫电泳、血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等火箭电泳、免疫印迹等火箭电泳、免疫印迹等火箭电泳、免疫印迹等 最新免疫检测技术最新免疫检测技术血清免疫电泳血清免疫电泳将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。蛋白组分的缺少或增加。最新免疫检测技术最新免疫检测技术免疫电泳原理图解免疫电泳原理图解最新免疫检测技术最新免疫检测技术火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。单向扩散。最新免疫检测技术最新免疫检测技术 沉淀线的高度与抗原量成正比沉淀线的高度与抗原量成正比沉淀线的高度与抗原量成正比沉淀线的高度与抗原量成正比火箭电泳图火箭电泳图最新免疫检测技术最新免疫检测技术二、凝集反应二、凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。称为凝集反应。称为凝集反应。称为凝集反应。 1 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。最新免疫检测技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术妊娠免疫诊断试验妊娠免疫诊断试验 n n孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）含量）含量明显增高。（明显增高。（HCGHCG是可溶性抗原是可溶性抗原 ）n n反之，非孕妇尿中反之，非孕妇尿中HCGHCG含量甚微，不足以消含量甚微，不足以消耗掉抗耗掉抗HCGHCG抗体。抗体。 最新免疫检测技术最新免疫检测技术三、补体结合实验三、补体结合实验（2 2个系统，个系统，个系统，个系统，5 5种成分）种成分）种成分）种成分）最新免疫检测技术最新免疫检测技术已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）加入标准量补体加入标准量补体加入包被抗体的红细胞加入包被抗体的红细胞检测红细胞溶解情况检测红细胞溶解情况AgPatientsserum AbNo AbAg三、补体结合实验三、补体结合实验（2 2个系统，个系统，个系统，个系统，5 5种成分）种成分）种成分）种成分）最新免疫检测技术最新免疫检测技术免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。的抗原抗体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。免疫学检测技术。四、免疫标记技术四、免疫标记技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术常见标记免疫技术常见标记免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术 四、免疫标记技术四、免疫标记技术最新免疫检测技术 该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度度的灵敏度度的灵敏度度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实和自动化检测等特点，因此在实和自动化检测等特点，因此在实和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。验研究和临床检测中仍被广泛应用。验研究和临床检测中仍被广泛应用。验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。小分子化合物的定量分析。小分子化合物的定量分析。小分子化合物的定量分析。1. 放射免疫技术（放射免疫技术（125I）最新免疫检测技术最新免疫检测技术放射免疫分析基本原理放射免疫分析基本原理竞争性结合反应的经竞争性结合反应的经典标记抗原（典标记抗原（Ag*Ag*）和）和非标记抗原（非标记抗原（AgAg）与限）与限量抗体量抗体( (AbAb) )竞争性结合竞争性结合Ag*Ag*和和AgAg具有等同的具有等同的与与AbAb结合能力结合能力最新免疫检测技术 Ag* Ab Ag 标记抗原标记抗原 特异性抗体特异性抗体 待测抗原待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物分离分离Ag*-Ab 和游离和游离Ag*从标准曲线上读知含量从标准曲线上读知含量 测定测定Ag*-Ab和游离和游离Ag*放射性放射性 放放射射免免疫疫测测定定法法(RIA)示示意意图图最新免疫检测技术最新免疫检测技术RIA法原理及标准曲线法原理及标准曲线 7550 30 100110100 1000未标记抗原浓度（未标记抗原浓度（ng/mL)结结合合/未未结结合合的的放放射射活活性性（ % ）Ag*-AbAg*最新免疫检测技术最新免疫检测技术将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。制成荧光抗体诊断试剂。制成荧光抗体诊断试剂。制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。抗原的存在、定位和分布情况。抗原的存在、定位和分布情况。抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。免疫荧光技术有直接法和间接法等。免疫荧光技术有直接法和间接法等。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2. 2. 免疫荧光技术免疫荧光技术最新免疫检测技术最新免疫检测技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术直接法直接法直接法直接法Ag荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体特异性抗体组织切片组织切片最新免疫检测技术最新免疫检测技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术间接法间接法间接法间接法Ag荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体组织切片组织切片待测抗体待测抗体最新免疫检测技术最新免疫检测技术免免 疫疫 荧荧 光光 染染 色色 显显 示示 细细 胞胞 骨骨 架架 免免疫疫荧荧光光染染色色是是利利用用抗抗原原抗抗体体特特异异性性结结合合的的原原理理，用用经经荧荧光光染染料料标标记记的的抗抗体体对对细细胞胞或或组组织织内内的的蛋蛋白白质质进进行行定定性性或或定定量量研研究究的的方方法法。该该技技术术与与荧荧光光显显微微镜镜观观察察相相结结合合，可可对对特特定定的的蛋蛋白白质质进进行行细细胞胞或或组组织织内内的的精精确确定定位位。常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa350 用Alexa488标记的抗人-tubulin抗体染色显示微管 (绿色); 细 胞 核: 红色, D A P I染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)PtK1细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色最新免疫检测技术最新免疫检测技术本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分析、判断结果。析、判断结果。析、判断结果。析、判断结果。常用方法有常用方法有常用方法有常用方法有酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验和和和和酶免疫组化法酶免疫组化法酶免疫组化法酶免疫组化法，前，前，前，前者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组织中或细胞表面的抗原。织中或细胞表面的抗原。织中或细胞表面的抗原。织中或细胞表面的抗原。3. 免疫酶测定法免疫酶测定法最新免疫检测技术最新免疫检测技术是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行的抗原抗体反应。的抗原抗体反应。的抗原抗体反应。的抗原抗体反应。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRPHRP），底物），底物），底物），底物为二苯基联苯胺。为二苯基联苯胺。为二苯基联苯胺。为二苯基联苯胺。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）：最新免疫检测技术最新免疫检测技术ELISA试验三个必要的试剂试验三个必要的试剂n n(1)(1)固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）n n(2)(2)酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）n n(3)(3)酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）最新免疫检测技术最新免疫检测技术底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234基本步骤基本步骤最新免疫检测技术最新免疫检测技术五种常见的检测方法五种常见的检测方法1 1 双抗夹心法（测定抗原）双抗夹心法（测定抗原）2 2 测定抗体的间接法测定抗体的间接法3 3 竞争法（测定抗原）竞争法（测定抗原）4 4 捕获包被法测捕获包被法测IgMIgM抗体抗体 5 ABS-ELISA5 ABS-ELISA法法 最新免疫检测技术最新免疫检测技术适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心 1 双抗夹心法测抗原双抗夹心法测抗原最新免疫检测技术最新免疫检测技术2 间接法测抗体间接法测抗体最新免疫检测技术最新免疫检测技术几种标记几种标记/检测技术灵敏度的比较检测技术灵敏度的比较酶标酶标酶标酶标荧光荧光荧光荧光放免放免放免放免发光发光发光发光灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度(mol/L)(mol/L)1010-18-181010-15-151010-12-121010-9-9最新免疫检测技术几种标记几种标记/检测试剂的有效期比较检测试剂的有效期比较酶标酶标酶标酶标荧光荧光荧光荧光放免放免放免放免发光发光发光发光有效期（月）有效期（月）有效期（月）有效期（月）1818181815151515121212129 9 9 96 6 6 63 3 3 30 0 0 0最新免疫检测技术020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒试剂盒仪器仪器特殊防护特殊防护治理污染治理污染人民币人民币人民币人民币三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用三种免疫测定技术的成本及费用放免放免放免放免酶标酶标酶标酶标发光发光发光发光最新免疫检测技术A.将将Ab吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面; B. 加入酶标加入酶标Ag和待测和待测Ag，竞争结合，竞争结合Ab； 对照只加入酶标对照只加入酶标Ag； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知Ag量。量。3 竞争法测定抗原竞争法测定抗原最新免疫检测技术最新免疫检测技术n n血清标本中的血清标本中的IgMIgM包括针对抗原的特异性包括针对抗原的特异性IgMIgM抗抗体和非特异性的体和非特异性的IgMIgM n n加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgMIgM结合结合 n n抗人抗人IgMIgM抗体包被抗体包被 加入血清标本加入血清标本 加入特异加入特异性抗原试剂性抗原试剂 加入针对特异性抗原的酶标抗体加入针对特异性抗原的酶标抗体 加底物显色加底物显色4 捕获包被法测捕获包被法测IgM抗体抗体最新免疫检测技术最新免疫检测技术捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 最新免疫检测技术最新免疫检测技术ABSABSABSABS为亲和素为亲和素为亲和素为亲和素( ( ( (avidinavidinavidinavidin) ) ) )生物素生物素生物素生物素(biotin)(biotin)(biotin)(biotin)系统系统系统系统(system)(system)(system)(system)的略语。的略语。的略语。的略语。亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。 1 1 1 1个亲和素分子可与个亲和素分子可与个亲和素分子可与个亲和素分子可与4 4 4 4个生物素分子结合。个生物素分子结合。个生物素分子结合。个生物素分子结合。因此把亲和素和生物素与因此把亲和素和生物素与因此把亲和素和生物素与因此把亲和素和生物素与ELISAELISAELISAELISA偶联起来，就可提偶联起来，就可提偶联起来，就可提偶联起来，就可提高高高高ELISAELISAELISAELISA的敏感度。的敏感度。的敏感度。的敏感度。 5 ABS-ELISA法法最新免疫检测技术最新免疫检测技术ABS-ELISA法法 ：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；最新免疫检测技术最新免疫检测技术