菌落总数的测定菌落总数的测定 (GB(GB 47894789. .2202201010) ) 一一、目的目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。法和原理。22、了解菌落总数测定在对被样品进行、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义卫生学评价中的意义 。二、原理二、原理 细菌数量的表示方法由于所采用的细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：计数方法不同而有两种：菌落总数菌落总数和和细细菌总数菌总数。1、菌落总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得件下培养后，所得1g或或1mL检样中形成检样中形成的细菌菌落总数。以的细菌菌落总数。以CFU/g（mL）来）来表示。表示。一定条件包括培养基成分、培养温度一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、和时间、pH、是否需要氧气、是否需要氧气等。等。 按国家标准方法规定，即在按国家标准方法规定，即在需氧需氧情况情况下，下， 36 136 1培养培养482482h，能在，能在平板平板计数琼脂计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。菌落总数菌落总数并不表示实际中的所有细菌总并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为有时被称为杂菌数杂菌数，需氧菌数需氧菌数等。等。 2菌落总数测定的卫生学意义菌落总数测定的卫生学意义（1）菌落总数主要作为判别）菌落总数主要作为判别食品被食品被污染程度污染程度的标志，也可以应用这一方法的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。被检样品进行卫生学评价时提供依据。（2）食品中细菌食品中细菌菌落总数越多菌落总数越多，则，则食品食品含有致病菌含有致病菌的可能性越大，食品的可能性越大，食品质质量越差量越差；菌落总数越小，则食品含有致；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和大肠菌群和致病菌致病菌的检验，才能对食品做出较全面的检验，才能对食品做出较全面的评价。的评价。 3 3、细菌总数、细菌总数指一定数量或面积的食品样品经过指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种直接计数。其中包括各种活菌数活菌数和尚未和尚未消失的消失的死菌数死菌数。细菌总数也称细菌直接。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以显微镜数。通常以1g或或1mL样品中的细样品中的细菌总数来表示。菌总数来表示。三三、材料材料1、食品检样食品检样2、培养基培养基平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液盐缓冲液3、其它其它无菌培养皿，无菌吸管，电炉、无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培恒温培养箱养箱等。等。四、四、流程流程1 1、检样检样 2 2、做几个适当倍数的稀释液做几个适当倍数的稀释液3、选择选择23个适宜个适宜稀释度各稀释度各1 1 m mL,L,分别加入分别加入灭菌平皿内灭菌平皿内 4 4、平皿内倾注平皿内倾注15152020 m mL L琼脂培养基，混匀琼脂培养基，混匀5 5、36 136 1培养培养482482小时或（小时或（242242）小时）小时6、记录稀释倍数和相应的记录稀释倍数和相应的各平板各平板菌落菌落数量数量7 7、 计算菌落总数计算菌落总数 报告报告 五、五、步骤步骤(一一)取样、稀释和培养取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（mL），），放于放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理的速度处理12min，制成，制成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。2、用、用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1:10稀释稀释液液1mL，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9mL灭灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管振摇试管或反复吹打混合均匀，制成或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。的稀释液。3、另取、另取1mL灭菌吸管，按上项操灭菌吸管，按上项操作顺序，制作顺序，制10倍递增稀释液，如此每倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即递增稀释一次即换用换用1支支1mL吸管。吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估根据标准要求或对污染情况的估计，选择计，选择23个个适宜稀释度，分别在制适宜稀释度，分别在制作作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做每个稀释度做两个平皿两个平皿。同时分别取同时分别取1ml稀释液（不含样品）稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作加入两个灭菌平皿内作空白对照空白对照。5、稀释液移入平皿后，将稀释液移入平皿后，将冷却冷却至至46琼脂培养基注入平皿约琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，并转动平皿，混合均匀混合均匀。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养温箱内培养482h，水产品，水产品301温箱内培养温箱内培养723h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固毫升），凝固后培养。后培养。（二）（二）菌落菌落记录记录方法方法做做平平板板菌落数菌落数记录记录时，可用肉眼观察，时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度同稀释度的各的各平平板板平均菌落数平均菌落数。 到达规定培养时间，应立即计数。如到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于果不能立即计数，应将平板放置于0 044，但，但不要超过不要超过24h24h。 1 1、平皿菌落数的选择平皿菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用采用两个平皿两个平皿，大于大于300300的可记为多不可的可记为多不可计。计。2、其中一个平板有较大、其中一个平板有较大片状菌落片状菌落生生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落片状菌落不到平板的一半不到平板的一半，而，而其余一半其余一半中菌落分布又很中菌落分布又很均匀均匀，则可以计算，则可以计算半个半个平板后乘以平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。，以代表一个平板的菌落数。3、当平板上有链状菌落生长时，、当平板上有链状菌落生长时，如呈如呈链状生长链状生长的菌落之间无任何明显的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。每一个菌落分开计数。（三）菌落（三）菌落总总数的数的计计算算 1 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的的平均值平均值，再将平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数乘以相应稀释倍数，作为每作为每g g（mLmL）中菌落总数结果。）中菌落总数结果。试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌量菌量/ /( (个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4 -4 （1.561.56）2.6x102.6x105 53 3271271606012121010- -2 2 （2.22.2）2.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0x109.0x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 6 2 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，在适宜计数范围内时，应应以两者比值决定。以两者比值决定。若其比值小于若其比值小于2 2，应报告两者的平均数；，应报告两者的平均数；若大于等于若大于等于2 2，则报告稀释度较小的菌落，则报告稀释度较小的菌落数。数。试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌量菌量/ /( (个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 3271271606012121010- -2 22.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0x109.0x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 63、若所有稀释度的平板菌落数若所有稀释度的平板菌落数均均300，则取，则取最高稀释度最高稀释度的平均菌落数乘的平均菌落数乘以稀释倍数计算。以稀释倍数计算。试样试样例次例次稀释度稀释度选定计数稀释度选定计数稀释度菌量菌量/ /( (个个/g/g或或mL)mL)1010-2-21010-3-31010-4-41 1平平均均菌菌落落数数380380525218181010-3-35.2x105.2x104 42 252652620520532321010-3-3，1010-4-42.6x102.6x105 53 3271271606012121010- -2 22.7x102.7x104 44 428428415215237371010-2-2，1010-3-39.0x109.0x104 45 5262612125 51010-2-22.6x102.6x103 36 6无法计数无法计数5685683123121010-4-43.1x103.1x106 64、若所有稀释度平板菌落数、若所有稀释度平板菌落数均均30，则以则以最低稀释度最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍的平均菌落数乘稀释倍数计算。数计算。5、若所有稀释度平板均、若所有稀释度平板均无菌落生长无菌落生长，则应按则应按300，有的又，有的又30，则应以，则应以最接近最接近300或或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（四）（四）菌落计数报告方法菌落计数报告方法1、菌落数在、菌落数在1100时，按四舍五入报时，按四舍五入报告告两位有效数字。两位有效数字。2、菌落数菌落数100时，第三位数字按四舍时，第三位数字按四舍五入计算，取五入计算，取前面两位有效数字前面两位有效数字，为了缩，为了缩短数字后面的零数，也可以短数字后面的零数，也可以10的指数表示。的指数表示。3 3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告数，则报告菌落蔓延菌落蔓延。 4 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次若空白对照上有菌落生长，则此次检测检测结果无效结果无效。5 5、称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，体积为单位报告，体积取样以取样以CFU/mL为单位报告。为单位报告。注意事项注意事项1、无菌操作、无菌操作操作中必须有操作中必须有“无菌操作无菌操作”的概念，所用的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用应用75%75%乙醇乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作在包装开口处擦拭后取样。操作应当在应当在超净工作台超净工作台或经过消毒处理的或经过消毒处理的无菌室无菌室进进行。行。 2 2、采样的代表性、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。点，宜多采几个部位。固体样品固体样品必须经必须经过均质或研磨，过均质或研磨，液体样品液体样品须经过振摇，须经过振摇，以获得均匀稀释液。以获得均匀稀释液。 3 3、稀释液、稀释液 样品稀释液主要是样品稀释液主要是灭菌生理盐水灭菌生理盐水，或，或磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（或（或蛋白胨水蛋白胨水），后者对），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用行稀释，可以采用灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水。 4 4、每递增稀释一次即换用、每递增稀释一次即换用1 1支支1ml1ml灭菌灭菌吸管。吸管。 5 5、倾注用培养基应在倾注用培养基应在4646水浴内保温水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。 6 6、倾注培养基的量规定不一，从、倾注培养基的量规定不一，从121220ml20ml不等，一般以不等，一般以15ml15ml较为适宜，平较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。察。7、为使菌落能在平板上均匀分布，、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间间不宜超过不宜超过20min，以防止细菌有所死，以防止细菌有所死亡或繁殖。亡或繁殖。8、培养温度一般为、培养温度一般为37（水产品的（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用故多采用30）。培养时间一般为）。培养时间一般为48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h的培养即可计数。的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养养48h后，培养基失重不应超过后，培养基失重不应超过15。 9 9、为了避免食品中的微小颗粒或培、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于合的平板，不经培养，而于4 4环境中放环境中放置，以便计数时作对照观察。置，以便计数时作对照观察。六、六、结果结果1、将实验测出的样品数据以表格的将实验测出的样品数据以表格的方式报告。方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。生要求的结论。报告方式报告方式样品样品稀释液及稀释液及菌落数菌落数选择稀选择稀释度释度报告报告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品样品名称名称原始原始数据数据计算公式计算公式报告报告平均平均七、思考七、思考1、什么是细菌菌落总数（什么是细菌菌落总数（cfu）？）？2、细菌菌落总数测定的卫生学意义是什、细菌菌落总数测定的卫生学意义是什么？么？3、倒培养基后，为什么要倒置培养？、倒培养基后，为什么要倒置培养？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在持在461的温度？的温度？酱油（酱油（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：30MPN/100mL肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级特级一级一级二级二级细菌菌落总数：细菌菌落总数：200003000050000（CFU/ml）大肠菌群大肠菌群409090（MPN/100g）肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出不得检出不得检不得检出出巴氏杀菌乳（巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：90MPN/100mL肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群总大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出耐热大肠菌群耐热大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出瓶瓶(桶桶)装饮用纯净水卫生标准装饮用纯净水卫生标准(GB17324-2003)细菌菌落总数细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群大肠菌群MPN/100ml：3致病菌致病菌(肠道致病菌和致病性球菌肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出：不得检出霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出不得检出