实验三实验三网织红细胞计数网织红细胞计数一、实验原理一、实验原理 网网织织红红细细胞胞胞胞浆浆内内残残存存有有嗜嗜碱碱性性的的RNA物物质质，经经煌煌焦焦油油蓝蓝或或新新亚亚甲甲蓝蓝活活体体染染色色后后RNA中中负负电电荷荷基基团团与与带带正正电电荷荷的的有有色色基基团团结结合合，凝凝聚聚成成颗颗粒粒呈呈浅浅蓝蓝或或蓝蓝黑黑色色的的点点状状、丝丝状状或或网网状状结结构构，可可在在显显微微镜镜下下识识别别。计计数数1000个个红红细细胞胞中中所所有有的的网网织织红红细细胞胞数数直直接接报报告告其其百百分分比比，或或红细胞计数结果报告其绝对值。红细胞计数结果报告其绝对值。 网织红细胞（网织红细胞（Ret） 是是晚晚幼幼红红细细胞胞脱脱核核后后到到成成熟熟红红细细胞胞间间的的过过渡渡细细胞胞，是是尚尚未未完完全全成成熟熟的的红红细细胞胞，其其胞胞浆浆内内残残存存有有嗜嗜碱碱性性的的RNA物物质质。嗜嗜碱碱性性物物质质与与染染料料凝凝聚聚成成蓝蓝色色颗颗粒粒，颗颗粒粒与与颗颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。粒连缀成线，线连接成网，故而得名。分分型型：丝丝球球型型、网网型型、破破网网型型、点点粒粒型型。（、型）型）网织红细胞计数方法n1、普通光学显微镜法：活体染色后推片镜检n2、网织细胞计数仪法：荧光染色后用流式细胞术计数二、试剂器材1、试剂10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液2、器材毛细血管采血用具、小试管、载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20mm（较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）三、操作步骤1. 染染色色：于于载载玻玻片片的的一一端端加加煌煌焦焦油油蓝蓝酒酒精精溶溶液液1滴滴，任任其其自自然然凉凉干干后后备备用用，取取末末梢梢血血或或抗抗凝凝血血一一滴滴，于于已已干干燥燥的的染染料料上上，用用推推片片角角混混匀匀后后，将将两两玻玻片片盖盖合合（玻玻片片法法）；试试管管法法取取染染液液2滴滴入入试试管管，加加血血2滴滴混匀，封闭好，待混匀，封闭好，待15分钟以上时间，分钟以上时间，2. 推推片片：取取混混合合液液1小小滴滴于于载载玻玻片片的的一一端端，推推制制成成薄薄而均匀的血膜，而均匀的血膜，3. 低低倍倍镜镜浏浏览览，选选取取红红细细胞胞分分布布均均匀匀网网织织红红细细胞胞染染色色较较好好的的部部分分（体体尾尾交交界界处处），滴滴香香柏柏油油转转换换至至油油镜镜，在在Miller窥窥盘盘下下计计数数小小方方格格中中的的RBC数数和和大大方方格格中中的的网网织织红红细细胞胞数数（或或数数出出整整个个视视野野中中的的RBC总总数数和和其其中中的的网网织织红红细细胞胞数数，换换一一视视野野同同法法计计数数至至几几个个视视野野RBC总数总数1000为止）。为止）。Miller窥盘 A31B将将MillerMiller窥盘放在显窥盘放在显微镜目镜中微镜目镜中, ,通过窥盘通过窥盘中大小方格间的中大小方格间的9 9比比1 1比例关系计算比例关系计算RBCRBC数和数和RetRet数。数。四、计算1.Miller窥窥盘盘法法：网网织织红红细细胞胞（Retic）百百分分率率(%)= （大大方方格格内内Retic总总数数）/（小方格内（小方格内RBC总数总数9）100% 2.直直接接计计数数法法：网网织织红红细细胞胞（Retic）百百分分率率(%)= 多多个个视视野野内内Retic总总数数/多多个个视野内视野内RBC总数总数100%五、注意事项1.用用酒酒精精染染液液时时，应应待待玻玻璃璃片片上上的的酒酒精精挥挥发发干干燥燥后后，才才能能加加血血液液，染染色色时时应应用用推推片片角角不不停停搅搅动动，使使染料和血液混合，防止凝固。染料和血液混合，防止凝固。2.染染色色时时间间一一定定要要充充足足，混混合合后后不不能能立立即即推推片片，室室温温低低时时染染色色时时间间应应适适当当延延长长，应应覆覆以以另另一一玻玻片片防止蒸发。防止蒸发。3.染液与血液比例以染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。为宜，贫血适当加血量。4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。试剂应定期重配，以免变质沉淀。6.与变性珠蛋白小体鉴别与变性珠蛋白小体鉴别六、参考值成人：成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%）（2%-6%）（0.5%-7.5%）成人绝对值成人绝对值（24-84） 109/L 七、临床意义七、临床意义（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 再障再障时，明显降低。绝对值低于时，明显降低。绝对值低于5109/L可可做为急性再障的辅助诊断指标。做为急性再障的辅助诊断指标。失血、多数失血、多数溶血性贫血溶血性贫血患者网织红细胞可患者网织红细胞可明显高于正常。明显高于正常。营养不良性贫血营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升高或降低。持正常、轻度升高或降低。（2 2）评价疗效）评价疗效网织红细胞反应：网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维生素给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗或叶酸治疗23d后，网织后，网织红细胞计数值开始上升，红细胞计数值开始上升，710d达到最高达到最高(10%左右左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血红蛋白开始升高。血红蛋白开始升高。骨髓移植、骨髓移植、EPO治疗后：治疗后：若骨髓开始恢复造若骨髓开始恢复造血功能，血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。升高，网织红细胞计数值上升。（3 3）放、化疗监测）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期早期HFR和和MFR降低，然后才检测到网织降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功能红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。骨髓抑制。RPI=RPI=病人网织红细胞（病人网织红细胞（% %）/ /2 * 2 * 病人病人HCT/HCT/正常正常人人HCTHCT（男男，女，女）临床应用：临床应用：3 3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；提示溶血性贫血或急性失血性贫血；网织红生成指数网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）八、思考题x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，如何报告网织红细胞检测结果？n外周血网织红细胞计数（百分数和绝对值）是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法，如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazoleorange等。目前最普遍应用的是thiazoieorange染色法，这种特异性RNA的激发波（488nm）测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数（RMI）。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标，它与网织红细胞内RNA含量成正比，RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。n目前，FCM检测网织红细胞主要用于1）预测骨髓移植的效果；2）解释各种红系增长低下性贫血的发病原因;3）评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。