肝糖原的提取、鉴定与定量肝糖原的提取、鉴定与定量实验目的实验目的1. 1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2. 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3. 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4. 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。适的混匀方法）。适的混匀方法）。适的混匀方法）。5. 5. 正确掌握溶液转移的操作。正确掌握溶液转移的操作。正确掌握溶液转移的操作。正确掌握溶液转移的操作。6. 6. 正确操作使用分光光度计。正确操作使用分光光度计。正确操作使用分光光度计。正确操作使用分光光度计。实验原理实验原理（一）肝糖原的提取、鉴定（一）肝糖原的提取、鉴定（一）肝糖原的提取、鉴定（一）肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用于乙醇而溶于热水，故先用于乙醇而溶于热水，故先用于乙醇而溶于热水，故先用9595乙醇将滤液中糖原沉淀，乙醇将滤液中糖原沉淀，乙醇将滤液中糖原沉淀，乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。再溶于热水中。再溶于热水中。再溶于热水中。实验原理实验原理（二）肝糖原的鉴定（二）肝糖原的鉴定（二）肝糖原的鉴定（二）肝糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO CuSO4 4+2NaOH Na+2NaOH Na2 2 SO SO4 4+Cu(OH)+Cu(OH)2 2 2Cu(OH) 2Cu(OH)2 2+ C+ C6 6H H1212OO6 6 2CuOH+ 2CuOH+氧化型葡萄糖氧化型葡萄糖氧化型葡萄糖氧化型葡萄糖+H+H2 2OO 2CuOH Cu 2CuOH Cu2 2O(O(红色红色红色红色)+H)+H2 2OO Cu(OH) Cu(OH)2 2 CuO( CuO(黑色黑色黑色黑色)+H)+H2 2OO（三）肝糖原的定量（三）肝糖原的定量（三）肝糖原的定量（三）肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物进一步脱水生成糠醛衍生物进一步脱水生成糠醛衍生物进一步脱水生成糠醛衍生物5-5-羟甲基呋喃甲醛，此化合羟甲基呋喃甲醛，此化合羟甲基呋喃甲醛，此化合羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm620nm处有最大吸收。糖含量在处有最大吸收。糖含量在处有最大吸收。糖含量在处有最大吸收。糖含量在(10100)mg(10100)mg范围内，溶液颜色的范围内，溶液颜色的范围内，溶液颜色的范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。坏其它成分，而保留肝糖原。坏其它成分，而保留肝糖原。坏其它成分，而保留肝糖原。实验原理实验原理 实验材料实验材料（一）仪器（一）仪器（一）仪器（一）仪器1. 1. 普通离心机，室温普通离心机，室温普通离心机，室温普通离心机，室温100100恒温水浴箱（恒温水浴箱（恒温水浴箱（恒温水浴箱（22），），），），722722型分光光度计，精型分光光度计，精型分光光度计，精型分光光度计，精度为度为度为度为10mg10mg级电子天平（级电子天平（级电子天平（级电子天平（11）2. 2. 剪刀（剪刀（剪刀（剪刀（11），镊子（），镊子（），镊子（），镊子（11），研钵（），研钵（），研钵（），研钵（11）3. 3. 试管架（试管架（试管架（试管架（11），），），），10mL10mL离心管（离心管（离心管（离心管（22），（），（），（），（1001510015）mmmm试管（试管（试管（试管（66）4. 4. 刻度吸量管（刻度吸量管（刻度吸量管（刻度吸量管（2mL12mL1，5 mL25 mL2），），），），1000L1000L微量可调取液器（微量可调取液器（微量可调取液器（微量可调取液器（11）5. 100mL5. 100mL容量瓶（容量瓶（容量瓶（容量瓶（11）6. 6. 白瓷反应板（白瓷反应板（白瓷反应板（白瓷反应板（11） 实验材料实验材料（二）试剂（二）试剂（二）试剂（二）试剂1. 1. 鸡肝。鸡肝。鸡肝。鸡肝。2. 952. 95乙醇。乙醇。乙醇。乙醇。3. 0.31mol/L(53. 0.31mol/L(5) )三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2C2HCl3O2，），），），）5g5g，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至100 mL100 mL。NaClNaCl溶液：称取溶液：称取溶液：称取溶液：称取8.8g NaCl8.8g NaCl加蒸馏水溶解至加蒸馏水溶解至加蒸馏水溶解至加蒸馏水溶解至1000 mL1000 mL。5. 12mol/L HCl5. 12mol/L HCl：浓：浓：浓：浓HClHCl原液（原液（原液（原液（36%38%36%38%）。）。）。）。6. 12.5mol/L(506. 12.5mol/L(50)NaOH)NaOH：称取：称取：称取：称取NaOH 50gNaOH 50g，用蒸馏水溶解至，用蒸馏水溶解至，用蒸馏水溶解至，用蒸馏水溶解至100mL100mL。7. 7. 碘试剂：碘碘试剂：碘碘试剂：碘碘试剂：碘l00mgl00mg和和和和K1 200mgK1 200mg溶于溶于溶于溶于50mL50mL蒸馏水中。蒸馏水中。蒸馏水中。蒸馏水中。 实验材料实验材料8. 8. 班氏试剂：称取柠檬酸钠（班氏试剂：称取柠檬酸钠（班氏试剂：称取柠檬酸钠（班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O75H2OC5H5Na3O75H2O，）和无水碳酸钠，）和无水碳酸钠，）和无水碳酸钠，）和无水碳酸钠（Na2C03Na2C03，），），），）100g100g溶于蒸馏水溶于蒸馏水溶于蒸馏水溶于蒸馏水700mL700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾中，加热促溶。冷却，慢慢倾中，加热促溶。冷却，慢慢倾中，加热促溶。冷却，慢慢倾人硫酸铜（人硫酸铜（人硫酸铜（人硫酸铜（CuSO45H2OCuSO45H2O，），），），） l00mL l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至，边加边摇。再加蒸馏水至，边加边摇。再加蒸馏水至，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。9. 5.35mol/L(309. 5.35mol/L(30)KOH)KOH溶液：称取溶液：称取溶液：称取溶液：称取KOH 30gKOH 30g，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至，加蒸馏水溶解至100 mL100 mL。11. 11. 标准葡萄糖液标准葡萄糖液标准葡萄糖液标准葡萄糖液(50mg/L)(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖：称取已干燥恒重的无水葡萄糖：称取已干燥恒重的无水葡萄糖：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg25mg，加蒸，加蒸，加蒸，加蒸馏水溶解至馏水溶解至馏水溶解至馏水溶解至500 mL500 mL。12. 17mol/L(9012. 17mol/L(90)H2SO4)H2SO4：量取蒸馏水：量取蒸馏水：量取蒸馏水：量取蒸馏水30mL30mL，加浓，加浓，加浓，加浓H2SO4500 mLH2SO4500 mL。13. 13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮，用蒽酮显色剂：称取蒽酮，用蒽酮显色剂：称取蒽酮，用蒽酮显色剂：称取蒽酮，用17mol/L H2SO417mol/L H2SO4溶解至溶解至溶解至溶解至100 mL100 mL。此试剂。此试剂。此试剂。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用4545天。天。天。天。操作步骤操作步骤（一）肝糖原的提取（一）肝糖原的提取（一）肝糖原的提取（一）肝糖原的提取 操作步骤操作步骤注意事项注意事项注意事项注意事项1 1 肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的9595乙醇后，务必注意乙醇后，务必注意乙醇后，务必注意乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于混匀。由于上清液为水溶液，比重大于混匀。由于上清液为水溶液，比重大于混匀。由于上清液为水溶液，比重大于9595乙醇，溶液分成两层。加乙醇，溶液分成两层。加乙醇，溶液分成两层。加乙醇，溶液分成两层。加之上清液已之上清液已之上清液已之上清液已4mL4mL多，加上等量乙醇，总量接近多，加上等量乙醇，总量接近多，加上等量乙醇，总量接近多，加上等量乙醇，总量接近9mL9mL，混匀操作比较困，混匀操作比较困，混匀操作比较困，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2 2 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在关。葡萄糖残基在关。葡萄糖残基在关。葡萄糖残基在2020个以下的会使碘呈现红色，个以下的会使碘呈现红色，个以下的会使碘呈现红色，个以下的会使碘呈现红色，2020 3030个之间使碘呈个之间使碘呈个之间使碘呈个之间使碘呈现紫色，现紫色，现紫色，现紫色，6060个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在2020个以下（通常个以下（通常个以下（通常个以下（通常8 8 1212个葡萄糖残基）个葡萄糖残基）个葡萄糖残基）个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。，吸附碘后呈现红棕色。，吸附碘后呈现红棕色。，吸附碘后呈现红棕色。3 3 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。操作步骤操作步骤（二）肝糖原定量测定（二）肝糖原定量测定（二）肝糖原定量测定（二）肝糖原定量测定 操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤