动物细胞培养的方法之 细胞冷冻保存技术细胞的低温保存细胞的低温保存o细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。胞遗传性状的改变和延缓衰老。o目前，动物细胞一般保存于液氮中目前，动物细胞一般保存于液氮中 （-196）。）。 一般在原代或传代一般在原代或传代210次内即次内即大量冻存，作为原种大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。 根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温冷冻保存细胞可分为：冷冻保存细胞可分为： 1非玻璃化冷冻非玻璃化冷冻 细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。 2玻璃化冷冻玻璃化冷冻 细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃态。晶，而是形成玻璃态。非玻璃化冷冻非玻璃化冷冻原则：缓慢冷冻原则：缓慢冷冻原因原因：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会 形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细 胞器的损伤。这种损伤称为细胞内胞器的损伤。这种损伤称为细胞内冰晶损伤冰晶损伤。 细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的 电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中 时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞 膜破裂，这种损害称之为膜破裂，这种损害称之为溶质损伤溶质损伤。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。 3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。解决办法：解决办法：冷冻保护剂的应用保护剂的应用在培养液中添加的保护剂：在培养液中添加的保护剂：二甲亚砜二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSODimeethylsulfoide,DMSO），），甘油甘油, ,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压改变而导致的物理损伤。改变而导致的物理损伤。预先配制冻存预先配制冻存保护保护液：液：含含20%血清培养基，血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。成大冰晶，即冰晶的重结晶。冻存培养细胞冻存培养细胞(1)(1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4 4度度取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液液, ,用吸管吹打制成细胞悬液（用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 106细胞细胞/ /ml) )；冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。免对细胞造成伤害。 (2)(2)加入加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火细胞悬液于冻存管中，在火焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。名称和冷冻日期。 可用带有可用带有18G针头注射器进行分装，针头注射器进行分装，如剂量过大，如剂量过大，保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。 (3)(3)加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻，结加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻，结冰产生在细胞外冰产生在细胞外( (对细胞没有损伤对细胞没有损伤) )。如。如果要长期保存，可以使用液氮罐，果要长期保存，可以使用液氮罐，(4)(4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。温度达温度达-150-190 -150-190 ，细胞几乎处在停止，细胞几乎处在停止状态。状态。冷冻时带手套操作，以免冻伤。冷冻时带手套操作，以免冻伤。慢冻程序慢冻程序标准程序： 当温度在-25以上时， 12/min 当温度达-25以下时， 510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中缓慢冷冻的简化程序缓慢冷冻的简化程序配置冷冻保护液配置冷冻保护液在培养液中加入在培养液中加入在培养液中加入在培养液中加入血清（一般血清（一般20%）10%10%10%10% 甘油或甘油或甘油或甘油或 DMSODMSODMSODMSO 将冷冻液加入离心管，使将冷冻液加入离心管，使 细胞浓度为细胞浓度为 26106cell/ml将冷冻液分装到冷冻管中将冷冻液分装到冷冻管中44冰箱放置冰箱放置30-60min-30-60min-20 -20 冰箱放置冰箱放置2小时小时（冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹）（冷冻管放入泡沫盒或用棉花纱布包裹）-70-70冰箱放置冰箱放置1-21-2天天投入液氮罐投入液氮罐取旺盛生长的细胞取旺盛生长的细胞,消化后消化后用离心管离心回收细胞用离心管离心回收细胞在没有程序控制冻存器设备的条件下在没有程序控制冻存器设备的条件下, 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速 度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。-196-196液氮罐液氮罐普通冰箱普通冰箱低温冰箱低温冰箱解冻程序解冻程序原则：原则：快速解冻快速解冻原因原因：解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为 中中 心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采 用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。解冻程序解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入从液氮中取出冷冻管，快速放入37- 40水浴水浴 中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s). 玻璃化冷冻玻璃化冷冻原则：原则：快速冷冻快速冷冻原因：原因：从理论上讲，只要获得足够快的降温速度，任何从理论上讲，只要获得足够快的降温速度，任何 液体都可以进入玻璃化状态。例如：要是纯水进液体都可以进入玻璃化状态。例如：要是纯水进 入玻璃化状态，降温速度需高达入玻璃化状态，降温速度需高达 1010/s，以现，以现 在的条件没办法达到。在的条件没办法达到。解决办法：解决办法：通过添加高浓度的冷冻保护剂，通过添加高浓度的冷冻保护剂，可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速度。度。一般冷冻保护剂的浓度为一般冷冻保护剂的浓度为40%-60%。 冷冻保护剂：冷冻保护剂：DMSO、乙酰胺、丙二醇、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇等。聚乙二醇等。玻璃化冷冻的程序玻璃化冷冻的程序配置冷冻液配置冷冻液在平衡盐溶液（在平衡盐溶液（Hanks）中加）中加20.5%DMSO(w/v)15.5%乙酰胺乙酰胺(w/v ) 、10%丙二醇和丙二醇和10%聚乙二醇。（以单核细胞为例）聚乙二醇。（以单核细胞为例）取旺盛生长的细胞，消化后用离心取旺盛生长的细胞，消化后用离心管离心回收细胞，并将离心管置于管离心回收细胞，并将离心管置于冰浴中冰浴中将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中，使细将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中，使细胞浓度为胞浓度为1-1.51-1.510106 6cell/mlcell/ml。（滴加的速度先慢后快，具体过程如下:前3分钟以0.3ml/min滴加；后5分钟以0.6ml/min滴加；余下的以0.75ml/min滴加）将含有细胞的冷冻液将含有细胞的冷冻液 分装到冷冻管中分装到冷冻管中将冷冻管投入液氮将冷冻管投入液氮-196-196液氮罐液氮罐解冻程序解冻程序从液氮中取出冷冻管从液氮中取出冷冻管放入冰浴中放入冰浴中5min5min，使其融冻，使其融冻转移到离心管，并放入冰浴中转移到离心管，并放入冰浴中将已在冰浴中预冷的含将已在冰浴中预冷的含20%20%血清的血清的HanksHanks液对细胞冻存悬液稀液对细胞冻存悬液稀释。释。（稀释过程要缓慢，具体过程如下：前（稀释过程要缓慢，具体过程如下：前1010分钟分钟0.2ml/min0.2ml/min速度速度滴加；接下来滴加；接下来1010分钟以分钟以0.5ml0.5ml滴加；接下来的滴加；接下来的1515分钟以分钟以0.75ml/min0.75ml/min滴加；最后滴加；最后30min30min以以1ml/min1ml/min滴加）滴加）离心回收细胞，弃上清，加入培养液培养细胞离心回收细胞，弃上清，加入培养液培养细胞步骤步骤 从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄摄氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内容物在容物在20-60秒内完全溶化成悬液。无菌下秒内完全溶化成悬液。无菌下打开冻存管，接种于培养瓶中打开冻存管，接种于培养瓶中,加入新鲜培加入新鲜培养液，养液，37摄氏度孵箱培养摄氏度孵箱培养24小时更换培养小时更换培养液去除冻存液，继续培养。液去除冻存液，继续培养。