葛顺峰,许海港,季萌萌,姜远茂等植物生态学报 2013, 37 (10): 942949生命科学学院 雷思聪 201100140031土壤碳氮比对平邑甜茶幼苗生长和碳氮分配的影响摘要摘要为探讨土壤碳氮比(C:N)对苹果(Malus pumila)植株生长和碳氮分配特性的影响, 采用碳氮双标记示踪技术, 以二年生平邑甜茶(Malus hupehensis)幼苗为试验材料, 研究了6个不同土壤C:N处理(T1T6分别为4.70、9.78、14.70、19.96、25.60和28.83)下平邑甜茶的生长状况和氮素吸收、利用分配以及碳水化合物的运转特性。结果表明, 随着土壤C:N的逐渐增大, 平邑甜茶幼苗根系干重逐渐增加, 而株高、茎粗、地上部干重和植株总干重呈先增加后降低的趋势, 以T4处理最大。土壤C:N显著影响了平邑甜茶幼苗的15N利用率, 从T1到T4处理, 植株的15N利用率逐渐升高, T4处理(18.46%)是T1处理(10.65%)的1.73倍; 随着土壤C:N的进一步增加, 植株的15N利用率逐渐降低, T5和T6处理分别比T4处理降低了1.59%和2.58%。土壤C:N较低的T1和T2处理, 平邑甜茶幼苗各器官从肥料中吸收分配到的15N量对该器官全氮量的贡献率(Ndff)大小顺序为根叶茎, 随着土壤C:N的进一步增大, 叶片的Ndff均为最大, 其次是根, 茎最少。随着土壤C:N的增大, 叶片15N分配率逐渐升高, 13C分配率逐渐降低; 而根系15N分配率逐渐降低, 13C分配率逐渐升高。综合考虑植株生长和氮素利用状况, 本试验条件下适宜平邑甜茶生长的土壤C:N为2123。引言引言我国是世界苹果(Malus pumila)第一生产大国,2011年全国苹果种植面积约199万hm2、总产量35 106吨, 分别占全世界的1/3和1/4, 果业逐渐成为苹果产区农民增收的重要支柱产业。由于片面地追求高产, 大量的无机化肥被应用到苹果生产中, 而肥料的过量施用在提高产量的同时, 也带来了土壤质量下降、生态环境恶化等不良后果。土壤中的有机碳和氮素是地表植被生长的主要营养源, 常被作为土壤质量评价和土地可持续利用管理的重要参考指标, 也是陆地土壤碳库和氮库的重要组成部分, 它们不仅反映土壤肥力水平, 也印证区域生态系统演变规律, 它们之间的关系可以用土壤C:N来表示, 即土壤有机碳含量与全氮含量的比值, 它是土壤质量的敏感指标,它的演变趋势对土壤碳、氮循环和植株的生长发育进程有重要影响。研究表明, 低的C:N可以加快微生物分解和氮的矿化速率, 高的C:N对土壤微生物的活动能力有一定的限制作用, 使有机质和有机氮的分解矿化速度减慢, 土壤固定有机碳的能力提高。引言引言当前,我国苹果园土壤全氮含量达0.81.3gkg-1, 而有机碳含量不足1%, 再加上缺乏有效的管理措施, 造成了土壤C:N失调, 这是导致果园土壤质量退化、土壤微生物多样性下降、土传病害严重、果品产量品质下降的重要原因(。氮素和光合产物在苹果生长发育、花芽分化及产量形成方面具有决定性作用, 而目前关于土壤C:N的研究主要集中在如何通过添加有机物质来提高土壤C:N和作物品质的研究上, 关于土壤C:N对苹果植株生长及碳氮代谢特性的研究尚未见报道。为此, 本研究以生产上常用的苹果砧木平邑甜茶(Malus hupehensis)为试验材料, 研究了土壤C:N对平邑甜茶幼苗生长和氮素吸收、利用分配以及碳水化合物的运转特性, 以期为苹果生产上调节合理的土壤C:N提供理论依据。砧木砧木砧木(rootstock)是指嫁接繁殖时承受接穗的植株。砧木可以是整株果树，也可以是树体的根段或枝段，有着固着、支撑接穗，并与接穗愈合后形成植株生长、结果。砧木是果树嫁接苗的基础，它嫁接亲合性好，苗木寿命长，也容易繁殖。接穗砧木平邑甜茶平邑甜茶用平邑甜茶作砧木所嫁接的苹果品质好、寿命长，并有一定矮化作用，其性状远远胜过其他砧木，专家们认为它是世界上最优良的苹果砧木。1.1.材料和方法材料和方法1.1 试验设计 试验于2012年410月在山东农业大学园艺试验站进行。供试土壤来自山东省烟台市栖霞市苏家店镇小徐家村苹果园, 通过大量采样分析, 我们选取了6份具有不同土壤C:N、其他养分含量相近的土壤, 土壤类型为黏质壤土, 各处理土壤基本理化性质见表1。 试验采用普通陶盆, 每盆装风干土12 kg。于2012年3月26日, 选取长势基本一致、无病虫害的二年生平邑甜茶实生苗移栽入盆中, 待幼苗长势平稳后, 每个处理选取长势基本一致的幼苗12盆进行试验, 每盆1株。各处理中的12株植株分为2组, 每组6株。第1组: 于4月15日进行15N标记处理, 每株施入15N-尿素0.50 g (15N丰度为10.25%, 上海化工研究院生产), 同时每株另施入硫酸钾0.43 g、过磷酸钙0.38 g。于9月18日对这6株植株进行13C脉冲标记。第2组: 每株施入普通尿素0.50 g、硫酸钾0.43 g、过磷酸钙0.38 g, 作为对照。各处理生长条件和栽培管理均保持一致。 13C脉冲标记在一个由透明农用地膜做成的标记室内进行(Lu et al., 2002), 标记前先检查标记室的密封性(何敏毅等, 2008)。然后将风扇、平邑甜茶植株、还原铁粉和13C丰度(13C在全部碳元素中所占比例)为98%的Ba13CO3 0.6 g放入标记室内, 将整个标记室密封。上午9:00开始标记, 先用注射器向装有Ba13CO3的烧杯中注入一定量1 molL1的HCl溶液, 开动风扇, 标记开始。此后每隔0.5 h, 向烧杯中注入1次HCl, 以维持CO2浓度。标记时间持续4 h。标记结束后, 把植株放置于远离其他未标记植株处, 以防呼吸产生的13CO2对其他植株造成污染。1.1.材料和方法材料和方法1.1.材料和方法材料和方法1.2 测定项目和方法 13C脉冲标记完后的第3天(9月21日), 对所有处理进行破坏性采样。植株解析为根、茎和叶3部分,样品按清水洗涤剂清水1%盐酸3次去离子水顺序冲洗后, 105 下杀青30 min, 随后在80 下烘干至恒重, 粉碎后过0.25 mm筛, 混匀后装袋备用。13C丰度用DELTAplusXP型质谱仪(Thermo Electron GmbH, Bremen, Germany)测定, 15N丰度用ZHT-03 (北京分析仪器厂)质谱仪测定, 全氮用凯氏定氮法测定, 各器官干样质量用1/1000电子天平称量。1.1.材料和方法材料和方法1.3 数据统计(1) 13C丰度: Fi(%) = (13C + 1000) RPBD/ (13C + 1000) RPBD + 1000) 100, RPBD(碳同位素的标准比值) = 0.011 237 2;(2)进入各组分的13C量: 13Ci(mg) = Ci (FiFnl) / 100 1000, 式中Ci为各组分所含的碳量(g); nl表示未标记;(3) 13C在各器官的分配率: 13Ci(%) = 13Ci / 13C净吸收 100;(4)植株器官从肥料中吸收分配到的15N量对该器官全氮量的贡献率(Ndff%) = 植物样品中15N原子百分超% / 肥料中15N原子百分超% 100;(5)氮肥利用率(%) = (Ndff 器官全氮量(g)/施氮量(g) 100, 式中Ndff(%) = 植物样品中15N原子百分超% / 肥料中15N原子百分超%100; 原子百分超%样品中15N丰度%自然丰度%;(6)氮肥分配率(%) =各器官从氮肥中吸收的氮量(g) / 总吸收氮量(g) 100。用Excel 2003和SAS 9.0进行数据处理及统计分析, 用one-way ANOVA进行差异显著性分析。2.2.结果和分析结果和分析2.1 不同土壤C:N对平邑甜茶幼苗生长量和根冠比的影响由表2可见, 不同土壤C:N处理下平邑甜茶幼苗的生物量存在显著差异。随着土壤C:N的增大, 根系干重逐渐增加; 并且当土壤C:N处于低水平时(T1T3), 根系干重增加的幅度较大, T2比T1增加了5.89 g, T3比T2增加了6.19 g; 当土壤C:N增加到一定数值(T4)后, 根系干重小幅增加但差异不显著,T5比T4增加了2.08 g, T6比T5增加了0.37 g。从T1到T4处理, 株高、茎粗、地上部干重和植株总干重逐渐升高, 然后随着土壤C:N的进一步增加而逐渐降低。各处理的植株根冠比随土壤C:N的增加呈现无规律变化, T1、T5和T6处理的根冠比均大于1, 三者间无显著差异; T3和T4两个处理的根冠比较低, 分别为0.85和0.87。可见, 随着土壤C:N的增加, 平邑甜茶幼苗根系生物量逐渐增大, 但当土壤C:N增加到一定值后, 将会对植株地上部的生长产生抑制作用。2.2.结果和分析结果和分析2.2 不同土壤C:N对平邑甜茶幼苗15N利用率、各器官Ndff和15N分配率的影响由表3可见, 土壤C:N显著影响了平邑甜茶幼苗的15N利用率.随着土壤C:N的增加, 植株的15N利用率呈先升高后降低的变化趋势。从T1到T4处理平邑甜茶幼苗的15N利用率逐渐升高, 由T1 处理的10.65%增加到T4处理的18.46%, T4处理是T1处理的1.73倍, 且各处理间差异显著。随着土壤C:N的进一步增加, 平邑甜茶幼苗的15N利用率逐渐降低, T5和T6处理分别比T4处理降低了1.59和2.58个百分点, T4与T5间差异不显著, 但显著高于T6处理。可见, 土壤C:N太低或太高均不利于植株对外施氮肥的吸收。器官的Ndff指植株器官从肥料中吸收分配到的15N量对该器官全氮量的贡献率, 反映了植株器官对肥料15N的吸收征调能力。不同土壤C:N处理, 树体吸收的15N在各器官间的分配规律不同(表3)。土壤C:N较低的两个处理(T1和T2), 平邑甜茶幼苗各器官的Ndff大小顺序为根叶茎, 而T3T6处理, 随着土壤C:N的进一步增大, 叶片的Ndff均为最大, 其次是根, 茎最少, 表明当土壤C:N较低时, 根系对肥料氮的征调能力最强, 即树体新吸收的氮主要用于根系的生长发育; 而当土壤C:N较高时, 叶片对肥料氮的征调能力最强, 这时树体新吸收的氮主要用于地上部的生长发育。并且, T1处理植株各器官的Ndff均高于其他土壤C:N较高的处理, 表明当土壤C:N很低时, 植株主要利用肥料中的氮, 而土壤C:N较高时, 土壤和肥料中的氮均可被植株吸收利用。各器官中15N占全株15N总量的百分率反映了肥料氮在树体内的分布及在各器官迁移的规律。由表3可见, 随着土壤C:N的增大, 叶片15N分配率逐渐增加, 而根系逐渐降低, 茎中无明显变化。除了T1处理根中的15N分配率高于叶片外,其他处理均表现为叶根茎, 表明土壤C:N较低时,植株吸收的氮素主要分配至根系, 促进根系的生长发育; 当土壤C:N较高时, 则主要分配至地上部,用于地上部器官的构建。2.2.结果和分析结果和分析2.3 不同土壤C:N对平邑甜茶幼苗各器官13C分配率的影响13C分配率反映了叶片制造的光合产物在树体各器官间的迁移规律。由表4可见, 不同土壤C:N处理平邑甜茶幼苗各器官间的13C分配规律一致: 叶最高(32.29%44.72%), 其次是茎(35.53%37.58%),根最低(19.75%31.67%)。同一器官不同土壤C:N处理间13C的 分配率存在差异, 以叶和根最为显著。 其中, 13C在叶中的分配率表现为随土壤 C:N的升高而逐渐降低, T1处理(44.72%) 是T6处理(32.29%)的1.38倍; 而根中的 13C分配率与叶片表现出相反的变化规 律, 随着土壤C:N的升高而逐渐升高, T6 处理最高(31.67%), T1处理最低(19.75%), T6处理是T1处理的1.60倍; 茎中的13C分配 率在不同土壤C:N处理间差异不大。2.2.结果和分析结果和分析2.4 适宜土壤C:N的确定植株生物量和氮素利用效率是评价植株生 长和氮素利用特性的重要指标。为确定本 试验条件下的适宜土壤C:N, 我们将这两个 指标与土壤C:N进行了拟合分析。由图1可 见, 植株生物量和氮素利用效率与土壤 C:N的关系均呈抛物线状, 即随着土壤C:N 的升高, 这两个指标均呈先升高后降低的 变化趋势。通过对函数计算分析, 植株生 物量和氮素利用效率出现最大值时的土壤 C:N分别为21.29和23.11。因此, 综合考虑 这两个指标得出本试验条件下平邑甜茶生长发育适宜的土壤C:N为2123。3.3.讨论讨论土壤C:N是土壤质量的敏感指标, 其值高低对土壤氮素转化具有重要影响, 从而影响植株的生长发育进程。李雪利等(2011)在烟草上的研究表明, 土壤C:N在2428之间最有利于烟株生长过程中碳氮代谢和提高烟叶内在化学成分的协调性, 改善烟叶品质, 但当土壤C:N过高时则相反。刘世亮等(2007)的研究也表明, 适宜的土壤C:N有利于提高叶片叶绿素的含量和含氮量以及硝酸还原酶活性,而随着C:N的进一步增大, 这些指标呈降低趋势。本试验中, 随着土壤C:N的增大, 植株根系生物量逐渐增加, 而地上部生物量和植株总生物量则呈先升高后降低的变化趋势, 以T4处理(土壤C:N = 19.96)树体生物量最大, 但是当C:N大于T4处理后, 植株地上部生物量和植株总生物量有所降低,这与上述研究所得出的结论一致。肥料氮素吸收利用效率也验证了植株生物量的变化趋势, 当土壤C:N为19.96 (T4)时植株对15N的利用率最高, 而随着C:N的进一步增大, 肥料氮素利用率逐渐降低。这可能是因为C:N较高时, 土壤中的微生物大量繁殖, 而微生物的大量繁殖需要消耗一部分氮素, 就会出现微生物与植株共同竞争土壤中的氮素, 因此影响植株的生长和根系对养分的吸收; 而当土壤C:N较低时, 可供微生物利用的碳源较少, 微生物活性降低, 从而影响养分的有效性, 使得养分不利于被植株根系吸收, 进而抑制植株生长发育; 适宜的土壤C:N能够限制土壤微生物的活动能力, 减慢有机碳和有机氮的分解矿化速度,有利于土壤有机碳的固存, 同时也不至于使土壤微生物对施入氮素的“固持”强度太高, 有利于充分发挥肥料氮的有效性, 促进植株对肥料氮的吸收利用。各器官的15N分配率反映了树体新吸收的肥料氮在树体各器官间的迁移规律不同, 本研究中随着土壤C:N的增大, 叶片15N分配率逐渐增加, 而根系逐渐降低。表明土壤C:N较低时根系对氮的征调能力最强, 有利于根系的快速发育, 从而吸收更多的氮素来供应地上部分的生长, 这也是氮高效利用机制下根系的生理学反应之一; 而当土壤C:N较高时, 植株根系的生长状良好, 现有的根系即可满足植株对氮素养分的需求,不需要根系的过多生长, 而是将新吸收的肥料氮更多地转运至地上部分, 用于地上部分器官的构建。3.3.讨论讨论根系吸收营养物质及营养物质向地上部运输的能力, 以及叶片光合产物向根系运输的速率与数量, 是导致树体生长发育发生变化的主要原因。光合产物在树体内的运输、分配情况是影响果树优质、丰产、稳产的重要因素。本研究采用13C同位素技术研究了光合产物的分配状况, 结果表明同一器官在不同土壤C:N处理间13C的分配率不同, 其中尤以根和叶最为显著。随着土壤C:N的增大, 叶片制造的碳水化合物自留量减少, 增加了光合产物向根系的分配, 地上和地下营养交换较强, 使根系获得了较多的能量, 从而提高了根系对矿质养分的吸收, 这也正是较高的土壤C:N条件下植株根系生物量和氮素利用率较高的原因所在。除土壤C:N外, 土壤中其他养分的状况也会影响植株的生长发育和碳氮代谢。为了保证试验条件的唯一差异, 本试验通过大量采样分析(共测定了95个样本), 选取了6份具有不同土壤C:N、其他养分含量相近的土样作为试验材料, 但所选土样中的碱解氮、速效磷和速效钾含量还是略有差别。虽然碱解氮、速效磷和速效钾含量略有差别, 但我们认为造成本试验中各处理间结果差异的主要因素是土壤C:N, 而并非碱解氮、速效磷和速效钾, 原因主要有3点: 1)碱解氮、速效磷和速效钾含量并不是随着土壤C:N比的升高而逐渐增加的; 2)根据姜远茂等(2007)和卢树昌(2009)制定的果园养分分级标准,这6份土样的碱解氮、速效磷和速效钾含量均处于同一水平, 碱解氮含量均处于适宜水平, 速效磷含量均处于高水平, 速效钾含量均处于适宜水平; 3)将试验结果与各处理土壤的所有参数进行多元线性分析后表明造成结果差异的主要因素是土壤C:N比, 而碱解氮、速效磷和速效钾与各个指标的相关性很小。3.3.讨论讨论综合土壤C:N对苹果植株生长及碳氮代谢状况来看, 土壤C:N太高或太低时均不利于植株生长和氮素吸收, 也影响了叶片制造的碳水化合物在地上部分和地下部分之间的交换, 进而影响了根系功能。通过对植株生物量和氮素利用效率与土壤C:N进行拟合分析, 两者出现最大值时的C:N分别为21.29和23.11。植株生物量由地上部分和根系两部分组成, 随着土壤C:N的增加, 植株生物量和根系生物量均逐渐增加, 而当根系生物量较高, 即根冠比较大时, 会影响地上部分的生长, 从而造成植株总生物量的降低; 而当根系生物量较大时, 有利于根系对土壤中氮素的吸收, 因此植株生物量和氮素利用效率出现最大值时的土壤C:N有所差异。因此, 综合考虑植株生物量和氮素利用效率, 得出本试验条件下适宜的土壤C:N为2123, 在此范围内, 既能促进植株的生长发育, 又可以提高氮素利用率和光合产物在地上部分和地下部分的交换能力。本试验是在盆栽条件下进行的,由于空间的局限会影响根系的生长, 因此大田条件下苹果植株对土壤C:N的反应仍需进一步研究。同时, 本试验所采用的土壤类型为壤土, 而不同类型的土壤由于其自身通气性及持水保肥能力的不同也会影响植株对土壤C:N的反应, 比如沙土的通气性较好, 但保水保肥能力较弱, 因此可能需要较高的土壤C:N来为根系创造最优的生长空间。所以, 其他土壤类型下适宜于苹果植株生长发育的土壤C:N的确定仍需深入研究。因此, 在土壤类型为壤土的苹果园生产上应用生物秸秆或者其他外源碳来提高果园土壤C:N时, 要根据土壤氮素水平状况, 调整外源碳的添加量, 控制土壤C:N处于2123, 从而达到高产、优质、高效的目的。BLACK SPOT: A PLATFORM FOR AUTOMATED AND RAPID ESTIMATION OF LEAF AREA FROM SCANNED IMAGES黑点：通过扫描图像对叶面积自动快速估计的平台Varun Varma Anand M. OsuriPlant Ecology (2013) 214:15291534摘要-Abstract叶面积及其衍生物（如特定叶面积）被广泛应用于生态评估，尤其是在动植物相互作用、植物群落组成、生态系统功能和全球变化研究等领域。因为规模检测和叶面数字化都需要手动输入，即使使用专门的软件处理扫描的叶片图像，叶面积的估算依然非常耗时。我们引进了黑点面积计算器（Black Spot Leaf Area Calculator）（以下简称黑点），这是一种对标准平板式扫描仪拍摄的叶片图像进行自动快速评估的独立软件。黑点对颜色波段比值作综合的划分，从而对叶片表面和图像背景进行基于像素的分类。值得注意的是，该软件从图像数据中提取信息来检测图像尺寸，从而省去了耗时的手动校准。黑点给用户提供了叶面积的估算值及将图像分类以便进行错误检验。我们收集了51种不同的植物的100组叶片，来测试这种方法的实际应用。用黑点估算叶面积与用图像编辑软件手动处理图像得到了统计学上的相同结果。用黑点估算叶面积相对手动处理的平均误差率为-0.4%（标准差=0.76）。黑点的主要优点是能够以最少的人力和较低的成本快速批量处理多物种的数据集，从而成为生态学领域的一个有价值的工具。引言-Introduction单个叶片的表面积在植物科学研究中是个重要属性。叶面积与植物适应生长环境和资源的生理过程密切相关，并普遍应用于生态学、全球变化生物学和农业学。叶面积进一步用于导出生态系统和生态功能中广泛使用的度量标准。例如，植物的功能性状特定叶面积 (SLA = 叶面积/叶干重)与植物的生长策略密切相关，并定义了植物在基本资源采集-资源存储轴中的位置。SLA可以看做变量，因此需要大的样本规模使估计更可靠。虽然我们都知道估计叶面积在各种生态评估中是重要的，但数据收集需要较长的时间和较多的精力。叶轮廓在没有计算机的时代是手绘于坐标纸上的，更加现代的方法是利用专门的设备 （例如LI-C或LI-3000 C 便携式叶面积仪），或数字图像处理软件加上低预算的硬件，例如桌面扫描仪来估计叶面积。大多数现有软件的基本操作程序包括 (1) 处理叶片图像使其与背景分离，(2) 使用已知尺寸的物体（例如尺）的图像创建一个校准刻度， (3) 用叶象素计数和校准刻度推断叶面积。在执行这些步骤时，使用的软件有不同的作用，叶片数字化和校准步骤需用户操作。从图像背景中区分出叶像素要么需要完整的手动处理，要么需要手动指定像素强度阈值，要么使用半自动化的标准的图像处理软件。一些更复杂和专业的应用程序使用基于叶片光谱特性的算法自动提取叶前景，例如低值的蓝光带反射，并用分割法来检测多边形的叶边界。然而，这些软件仍然需要手动步骤分配图像比例，应用光谱规则校准对小规模物种工作的准确性。因此，批量处理大型，多种类的数据集是不可能的。引言- Introduction我们介绍的黑点，是一个独立免费的软件平台，能快速自动地进行叶片图像处理并对叶片扫描图像进行叶面积估算。黑点这个名字让我们想起了早期版本的软件，这种软件需要用户从包含用于校准比例的已知黑色区域的背景中将叶片分辨出来（在当前版本中不需要这种黑色区域）。开发黑点的目的是 (1)给野外工作的生态学家提供高效又符合成本效益的批量处理工具，来迅速地处理叶图像的大量多物种数据集，(2) 尽量减少估算时用户的输入量来减少工作时间，(3) 输出易于统计分析的数据，(4) 输出用户错误检查时所需的足够信息。黑点的开发- Development of Black Spot黑点要求用户在扫描叶片图像时使用普通白纸作为背景。该软件使用基于图像波段比值（ image band ratios ）（而不是像素强度）的光谱规则集进行基于像素的分类，将每个图像分为叶 （前景） 和非叶 （背景） 两部分。规则集的基本原则如下：（a）白色背景与红、绿、蓝光波段有相同的反射率，从而使背景的波段比值趋近于1；(b) 新鲜叶子吸收部分入射光 （例如绿色叶片有高的红光吸光度），从而导致在一个反射波段比值中产生很强偏差。重要的是，使用波段比值可使软件减少因图像中阴影的存在导致的误差（这里我们假设阴影会导致像素强度的降低，使波段相对强度之间没有太大差别）。因此，落在白色背景上的叶片阴影，即使强度降低了，但仍与白色背景有相同的波段比值，而叶片上的叶片阴影可以被分离出来（这在扫描褶皱的叶片时是一个常见问题）。基于波段比值的光谱分类规则集已经被开发并使用包含800个图像的多物种图像数据库进行校准。在撰写本文时，黑点已经为佳能和惠普扫描仪内置了光谱规则集（以下测试机型：HP SCANJET G3110，HP Deskjet F4488，Canon LiDE 110和Canon LiD E25）。在这些规则的开发中，我们观察到不同品牌扫描仪在叶片图像的光谱特性上具有一致性，这可能是相似的图像获取和处理技术导致的。因此，我们相信这些光谱规则集可以在各种品牌机型中广泛应用。运行黑点- Running Black Spot步骤1：获取叶片图像在此过程中，使用平板扫描仪扫描新鲜叶子并以.jpg格式（图 1a、 b）保存。在此扫描步骤中，建议用户在扫描仪内盖粘贴白纸片，以防止对扫描仪内盖永久染色。这张白纸片还作为一个容易识别的背景，因此应无任何注释或标记。根据所需数据的分辨率，叶片样品可包括单片叶子或一种植物的一组叶子。所有扫描的图像必须存储在单个文件夹便于用黑点处理。黑点用户手动为多个物种情况下（如大型叶片，具有特别厚的叶柄和叶轴的叶片，以及复合叶片）的叶片扫描提供详细的指引。运行黑点-Running Black Spot运行黑点- Running Black Spot步骤2：运行黑点，用户输入扫描完成后，黑点开始估算获取叶片的叶面积。处理图像之前，用户需要输入以下信息：（1）保存叶片图像的文件夹的路径；（2）保存输出结果的文件夹的名字；（3）所需平滑筛选器（ smoothening filter）的大小（3 x 3，5 x 5，7 x 7，9 x 9像素）；（4）分析时需要去除的图像边缘宽度。平滑筛选器（step 3）的作用是纠正可能引起噪点产生的人为因素。对于一个300 dpi（鼠标的DPI是每英寸点数，也就是鼠标每移动一英寸指针在屏幕上移动的点数）图像，窗口大小选择可从0.25mm的3 x 3窗口到0.8mm的9 x 9窗口。给用户提供的窗口选择只有奇数，是为了焦点像素的对称性，大小不超过9 x 9是为了防止叶面积估算的准确性降低。去除图像边缘（step 4）是为了校正图像获取时易产生的误差（由光泄露到扫描区域产生，一般表现为在图像边缘周围变暗）。最后，在输入较大图像时，用户可调整其大小。做完这些步骤，黑点开始处理图像。运行黑点- Running Black Spot步骤3：图像处理图2是黑点工作的流程示意图。输入文件夹中的每个图像是按顺序处理的。首先，根据用户的输入 （阶段 2），调整图像的大小、去除图像边缘。然后，每个图像的可交换图像文件格式 (exchangeable image file format， exif) 信息被提取出来。Exif 信息包含获取叶片图像的扫描仪品牌以及图像获取时的像素分辨率。后者被记录为dpi，并在平板扫描仪中直接转换成图像比例。根据使用的扫描仪品牌，软件应用适当的光谱规则集将叶片从背景识别出来。第一次进行基于像素分类后，用降噪筛选器（ de-speckling filter ）（其大小已有用户指定）处理分类图像。分类和筛选过程产生一个二值图像（叶和非叶），从而确定叶片像素数目。之后利用从图像的EXIF数据中提取像素分辨率值计算叶面积（cm2）。运行黑点- Running Black Spot步骤4：输出和错误检查每个图像的处理完成后，输出的csv文件包含图像名、反映图像的exif数据是否被找到的标志、扫描仪品牌、 像素分辨率、被检测的叶片像素的数目、估算的叶面积以及处理过程中指明的任何差异的错误标志。此 csv 文件存储在步骤2创建的输出文件夹中。如果exif信息没有被找到，黑点将只报告叶像素的计数，而不估算叶面积，并将在错误标志字段中标记该样品。为了进行错误检查，黑点将每个叶图像和其分类图像保存在输出文件夹中。用户可以访问这些图像检查叶分类中的错误。凡被用户认为有较大错误的图像会在图像处理软件中进行编辑并在黑点中重新处理。对常见错误和校正方法的详细描述可在黑点用户手册中查询。性能-Performance为了检查黑点叶面积估算的准确性，我们对黑点处理得到的结果和手动处理从野外收集100组叶片并使用图像编辑软件（GNU）处理得到的结果进行了比较。测试图像由51个物种组成，这些物种包括从印度南部的雨林树种，到印度喜马拉雅山的木本植物和禾本植物，再到非洲南部大草原的树种。手动处理包括使用图像编辑软件的前景色和颜色选择工具通过从原始图像的像素提取叶像素来手动选择叶片颜色范围。其次是通过交替添加、减去选区，手动更正选区中的叶片边界。对手动处理估算的叶面积与使用黑点得到的进行了对比。配对t检验表明两种方法得到的叶像素数没有显著差异(t = 0.0336, df = 198, p = 0.97)。黑点估计方法相对手动估计平均偏离-0.4%（SD = 0.76）。值得注意的是，手动处理100组测试叶图像花了共 220 min 18 s，而黑点只用了 20 min 12 s （图像大小没有被调整 ；黑点是在Windows XP SP3、 英特尔核心 2 双核处理器 2.93 g h z 和 3 GB RAM的电脑上运行的）。结语-Conclusions在生态学和植被科学中，对多物种数据集，特别是植物功能性状研究领域的需求越来越多。从叶面积测量（如 SLA）派生的性状值在理解生态系统对环境扰动（如全球变化）的应答中发挥了重要作用。然而，叶类型、大小、形状和颜色的高变异性对数据收集构成了相当大的挑战。这些与校准图像比例伴生的要求使图像获取和叶面积估算相当费时费力。黑点的主要功能包括自动检测图像比例并通过内置的光谱规则集将叶片从图像背景分离出来。这些功能允许批处理包含多物种叶片图像数据集，产生高准确性的叶面积估算值，大大减少了用户输入。另外，当数据是由大团队收集或对各个地区的数据进行比较时，黑点可规范数据质量。而且，黑点是可免费下载的，不依赖昂贵的硬件或快速的处理器，只要有基本电脑知识就能使用。目前黑点在佳能和惠普扫描仪上使用效果最好，我们希望用户们能反馈在不同品牌扫描仪上的使用情况来进一步扩大软件使用范围。