第七章第七章 发酵过程的代谢控制发酵过程的代谢控制发酵过程控制是发酵发酵过程控制是发酵的重要部分的重要部分控制难点：控制难点：过程的不确定性和参数的非过程的不确定性和参数的非线性线性同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果不同批次会得到不同的结果可见发酵过程的影响因可见发酵过程的影响因素是复杂的素是复杂的比如比如设备的差别、水的差别、培养基设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程了解和掌握分析发酵过程的一的一般方法对于控制代谢是十分必要的般方法对于控制代谢是十分必要的第一节第一节 发酵过程工艺控制的发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次目的、研究的方法和层次一一 发酵过程的种类发酵过程的种类分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养半连续培养半连续培养连续培养连续培养二二 发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率最大的生产率发挥菌种的最大生产潜力考虑之点发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性菌代谢与环境的相关性 温度、温度、pH、渗渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等比如比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能产物，而这些前体有可能流向不同的反应流向不同的反应方向方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。向进行。微生物代谢是一个复杂的系统，它的微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式代谢呈网络形式微生物的生长与产物合成有密切相关性，微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少在菌体量的大小影响产物量的多少，而，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从裂的去认识，而要从分子水平、细胞代分子水平、细胞代谢水平和反应工程水平谢水平和反应工程水平全面的认识全面的认识发酵过程受到多因素又相互交叉的发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如影响如菌本身的遗传特性、物质运菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因输、能量平衡、工程因素、环境因素素等等。因此发酵过程的控制具有等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程，本章为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些基本方面，在此基础上再举一些例子，说明例子，说明如何综合分析发酵过如何综合分析发酵过程及进行优化放大程及进行优化放大。三三 发酵过程研究的方法和层次发酵过程研究的方法和层次1、研究方法、研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。快时间内得到的结果。缺点缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性性数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、正交设计、均匀设计、响应面设计均匀设计、响应面设计。优点优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。较大的误差就会得出错误的结果。初级层次的研究初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适度、最适pH等要求。等要求。摇瓶研究的优点摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。优化有较高的效率。2、研究的层次、研究的层次代谢及工程参数层次研究代谢及工程参数层次研究：一般在一般在小型反应器规模进行试验小型反应器规模进行试验。在在摇瓶试验摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信所以得到的代谢情况比较可信。除了装备有除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统集分析系统，更重要的是，有一套独特的，更重要的是，有一套独特的数数据处理软件据处理软件，可以得到，可以得到14个发酵过程参数，个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用程的分析起到了重要的作用全参数发酵罐全参数发酵罐生产规模放大生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实的优化条件在大型反应器上得以实现现,达到产业化的实现。达到产业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同程度不同所致。所致。第二节第二节 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为这些代谢参数又称为状态参数状态参数，因，因为它们反映发酵过程中菌的生理代为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如谢状况，如pHpH，溶氧，尾气氧，尾，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等气二氧化碳，粘度，菌浓度等物理参数：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产产物浓度、核酸量等物浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等代谢参数按性质分可分三类：代谢参数按性质分可分三类：发酵过程参数直接参数直接参数: : 通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。 物理参数、化学参数、生物量参数 就地测量（in line）、在线测量（on line） 间接参数间接参数: : 由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。 反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。手工参数手工参数: : 取样后实验室手工测量参数，离线输入。 直接参数直接参数 物理参数物理参数 化学参数化学参数成熟不成熟 间接参数直接参数直接参数又可分为又可分为在线检测参数和离线检在线检测参数和离线检测参数测参数在线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；搅拌转速；离线检测参数离线检测参数指取出样后测定得到的参数，指取出样后测定得到的参数，如残糖、如残糖、NH2-N、菌体浓度。菌体浓度。一一 发酵过程主要分析的项目发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下目前发酵过程主要分析项目如下1、pH pH与微生物的生命活动密切相关与微生物的生命活动密切相关 酶催化活酶催化活性性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况氧状况2、排气氧、排气、排气氧、排气CO2和呼吸熵和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得通过计算可以求得摄氧率（摄氧率（OUR）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。于消耗的氧。RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料补料CERCER表示单位体积发酵液单位时表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量间内释放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵呼吸熵反映了氧的利用状况呼吸熵反映了氧的利用状况对于这种工艺，对于这种工艺，后期的补料控制后期的补料控制是关键。过程中是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但发现，在补糖开始时，不但CERCER、OUROUR大幅度提高，连大幅度提高，连RQRQ也提高约也提高约1010，表明，表明通过补糖不但提供了更多通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。一般在发酵中后期为保证产生次级代一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于谢产物，有意使菌体处于半饥饿状半饥饿状态态，在营养限制的条件下，维持产生，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。次级代谢产物的速率在较高水平。3、糖含量、糖含量菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。不正常。微生物生长和产物合成与微生物生长和产物合成与糖代谢糖代谢有密切关系。有密切关系。反映产生菌的生长繁殖情况反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力反映产物合成的活力糖的消耗：糖的消耗：糖含量测定包括总糖和还原糖糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。的是葡萄糖。4、氨基氮和氨氮、氨基氮和氨氮氨基氮氨基氮指有机氮中的氮（指有机氮中的氮（NH2-N），），单位是单位是 mg/100ml。如如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮氨氮指无机氨中的氮（指无机氨中的氮（NH3-N）。）。氮利用快慢氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。况。但是但是氮源太多会促使菌体大量生长氮源太多会促使菌体大量生长。有。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程否则影响提取过程5、磷含量、磷含量微生物体内微生物体内磷含量较高磷含量较高，培养基中以磷酸盐为，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是磷是核酸的组成部分核酸的组成部分，是高能化合物，是高能化合物ATP的组的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。措施。菌形态和菌浓度菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。直接反映菌生长的情况。菌形态菌形态 显微镜观察显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。与否的一个参数。6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态菌浓测定方法菌浓测定方法测粘度测粘度压缩体积法（离心）压缩体积法（离心）静置沉降体积法静置沉降体积法光密度测定法光密度测定法 ODOD600660600660 适合于细菌、酵母适合于细菌、酵母7、产物浓度、产物浓度 在培养过程中，产生菌的在培养过程中，产生菌的合成能力和产物合成能力和产物积累积累情况都要通过情况都要通过产物量的测定产物量的测定来了解来了解产物浓度产物浓度直接反映了生产的状况直接反映了生产的状况,是发酵控制的重是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成对产物形成的影响。的影响。二二 产物量的测定产物量的测定（一）（一） 产物量的特殊表示法产物量的特殊表示法1 1、抗生素效价的表示、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（多少，效价大小用单位（U）来表示来表示效价表示方法：重量折算法效价表示方法：重量折算法 重量单位重量单位 类似重量单位类似重量单位 特殊单位特殊单位重量折算单位：以最低抑菌浓度为重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素一个单位，如青霉素0.6微克微克1U重量单位：规定某些抗重量单位：规定某些抗生素活性部分生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分红霉素等定义活性部分1g1u类似重量单位：规定抗生素的某类似重量单位：规定抗生素的某种盐种盐1mg=1000u如金霉素、四环如金霉素、四环素的盐酸盐定一为素的盐酸盐定一为1g1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素制霉菌素 1mg=3700u多粘菌素多粘菌素B 1mg=10000u2 2、酶活力的表示法酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在统一规定，规定在250C下，下，以最适的底以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。克分子底物的酶定量为一个活性单位。（二）（二） 产物量的测定产物量的测定1 1、化学法、化学法（1）滴定法）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生反应生成青霉噻唑酸碘，用成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位可计算出青霉素的单位柠檬酸可以用柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量滴定来计算柠檬酸产量（2）比色法）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。产物浓度成正比，可以用比色法测定。淀粉酶活力测定：在淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。活力成正比。（3）测压法）测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。物量。2、物理法、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。素的含量。谷氨酸谷氨酸氨基丁酸氨基丁酸CO2化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。抗生素成品的测定用生物法测定。 适用于抗生素效价的测定适用于抗生素效价的测定 生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过能比的。但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。定。3 3、生物法、生物法常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为径为6mm，高，高10mm的圆筒形管子，管子的重的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。已凝固的培养基上待凝固（上层）。 在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在检样品，加满后在370C培养培养1618小时。在小时。在培养中培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫叫“抑菌圈抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，大， r: 抑菌圈的半径抑菌圈的半径(毫毫米）米）M：抗生素在管中的抗生素在管中的量（单位）量（单位）C：最低抑菌浓度最低抑菌浓度（单位（单位/毫升）毫升）H：培养基的厚度培养基的厚度（毫米）（毫米）L：管子的高度（毫管子的高度（毫米）米）D：抗生素的扩散系抗生素的扩散系数（毫米数（毫米/小时）小时）T：细菌生长到肉眼细菌生长到肉眼所用的时间所用的时间 （小时）（小时）抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4DTH)抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受平方呈正比。此外还受C、H、D、T的的影响影响但是但是C、H、D、T是无法是无法测量的，在实际计算中要测量的，在实际计算中要设法消去设法消去一般的消去方法有一般的消去方法有l二剂量法二剂量法l标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法优点：在一个碟优点：在一个碟子上可以同时做子上可以同时做两个样品的效价，两个样品的效价，当要做的样品量当要做的样品量大时，采取标准大时，采取标准曲线法可以提高曲线法可以提高效率。效率。假设选用的浓度为：假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是中心点是5U1122每个浓度做三个碟每个浓度做三个碟子。子。5U为中心点，每个为中心点，每个碟子中有碟子中有3个杯中加个杯中加中心点浓度，其余中心点浓度，其余3个加其它浓度。测个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直度和抑菌圈平均直径做标准曲线。径做标准曲线。logMr管碟法影响因素的讨论：管碟法影响因素的讨论：斜率小斜率小 D、T大大,误差小误差小截距小截距小 C、D、T、H小，误差小，误差小小logMrlogM1r1r1r1l培养基厚度培养基厚度H越小，其它条件相同时越小，其它条件相同时r越大。越大。影响影响H的因素：培养基的厚度的因素：培养基的厚度l细菌生长到肉眼所需的时间细菌生长到肉眼所需的时间T越大在其越大在其它条件相同时，它条件相同时，r越大越大影响影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及营长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液的温度、钢圈的放置、滴液1 1、 分批发酵分批发酵简单的过程，培养基中接入简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。等参数都随时间变化。分批培养中微生物的生长分批培养中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡期死亡期微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期称为对数生长期随着细胞生长，培养液中的营养物随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。合成。分批培养的优缺点分批培养的优缺点优点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握生产过程和产品质量容易掌握缺点缺点 产率低，不适于测定动力学数据产率低，不适于测定动力学数据2 2、补料分批培养、补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。际生产中采用这种方法很多。补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的基在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会加入增加了染菌机会3 3、半连续培养、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵品种采取这种方式，如四环素发酵优点优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。高了总产量。缺点缺点 代谢产生的前体物被稀释，代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大提取的总体积增大4 4、连续培养、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学研究菌生长的动力学缺点缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。菌机会大大增加。第四节第四节 发酵过程的发酵过程的pHpH控制控制 pHpH是微生物代谢的综合反映，是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pHpH是不断变化的，通过观察是不断变化的，通过观察pHpH变化规律可以变化规律可以了解发酵的正常与否了解发酵的正常与否一、发酵过程一、发酵过程pHpH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢 （1 1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一（2 2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会会下降；尿素被分解成下降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下下降，当碳源不足时氮源当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。（3 3）生理酸碱性物质利用）生理酸碱性物质利用后后pH会上升或下会上升或下降降2 2、产物形成、产物形成 某些产物本身呈某些产物本身呈酸性或碱性酸性或碱性，使发酵液，使发酵液pH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。 3 3、菌体自溶，、菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。 二、二、pHpH对发酵的影响对发酵的影响 例例 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林林可可霉霉素素发发酵酵开开始始，葡葡萄萄糖糖转转化化为为有有机机酸酸类类中中间间产产物物，发发酵酵液液pH下下降降，待待有有机机酸酸被被生生产产菌菌利利用用，pH上上升升。若若不不及及时时补补糖糖、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4或或酸酸，发发酵酵液液pH可可迅迅速速升升到到8.0以以上上，阻阻碍碍或或抑抑制制某某些些酶酶系系，使使林林可可霉霉素素增增长长缓缓慢慢，甚甚至至停停止止。对对照照罐罐发发酵酵66小小时时pH达达7.93，以以后后维维持持在在8.0以以上上至至115小时，菌丝浓度降低，小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。发发酵酵15小小时时左左右右，pH值值可可以以从从消消后后的的6.5左左右右下下降降到到5.3，调调节节这一段的这一段的pH值至值至7.0左右，以后自控左右，以后自控pH，可提高发酵单位。，可提高发酵单位。1 1、实例、实例pH7.0t不调不调pH调调pH效价效价pH例：培养基初始例：培养基初始pHpH值对漆酶分泌的影响值对漆酶分泌的影响pH在在47范围内产酶最高范围内产酶最高2 2、pHpH对发酵的影响对发酵的影响 （1）pH影影响响酶酶的的活活性性。当当pH值值抑抑制制菌菌体体某某些些酶酶的活性时使菌的新陈代谢受阻的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行行 （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用解离，从而影响微生物对这些物质的利用 （4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pH不不同同，往往往往引引起起菌菌体体代代谢谢过过程程不不同同，使使代代谢谢产产物物的的质质量量和和比比例例发发生生改改变变。例例如如黑黑曲曲霉霉在在pH23时时发发酵酵产产生生柠柠檬檬酸酸，在在pH近近中中性性时时，则则产产生生草酸。草酸。谷谷氨氨酸酸发发酵酵，在在中中性性和和微微碱碱性性条条件件下下积积累累谷谷氨氨酸酸，在在酸酸性性条条件件下下则则容容易易形形成成谷谷氨氨酰酰胺胺和和N-乙乙酰酰谷谷氨氨酰酰胺胺3 3、pHpH在微生物培养的不同阶段在微生物培养的不同阶段有不同的影响有不同的影响 生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例 青霉素：菌体生长最适青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适产物合成最适pH7.27.4 四四 环环 素素 ： 菌菌 体体 生生 长长 最最 适适 pH6.06.8， 产产 物物 合合 成成 最最 适适pH5.86.0XpH四四环环素素4 4、最佳、最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pHpH的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pHpH对海藻糖水解酶产生的影响对海藻糖水解酶产生的影响pH菌浓菌浓 pH酶活酶活pHpH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响对谷氨酰胺转氨酶活力的影响三、三、pHpH的控制的控制 1 1、调调节节好好基基础础料料的的pHpH。基基础础料料中中若若含含有有玉玉米米浆浆，pH呈呈酸酸性性，必必须须调调节节pH。若若要要控控制消后制消后pH在在6.0，消前，消前pH往往要调到往往要调到6.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质的物质，如，如具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3 3、通过补料调节、通过补料调节pH pH 在在发发酵酵过过程程中中根根据据糖糖氮氮消消耗耗需需要要进进行行补补料料。在在补补料料与调与调pH没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调pH如（如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水；当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO44 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱调发生矛盾时，加酸碱调pH pH PHPH调节的方法主要有下列几种：调节的方法主要有下列几种：添加碳酸钙法添加碳酸钙法氨水流加法氨水流加法尿素流加法尿素流加法5 5、不同调、不同调pHpH方法方法(1)(1)添加碳酸钙法添加碳酸钙法 采用采用生理酸性铵盐作为氮源生理酸性铵盐作为氮源时，由时，由于于NHNH4 4+ +被菌体利用后，剩下的酸根引起发酵液被菌体利用后，剩下的酸根引起发酵液PHPH值下降，在培养基中加入碳酸钙，就能起到值下降，在培养基中加入碳酸钙，就能起到调节调节PHPH值的作用。但是，值的作用。但是，碳酸钙的用量甚碳酸钙的用量甚大，在操作上易引起染菌的危险大，在操作上易引起染菌的危险，此，此法一般不采用。法一般不采用。(2)(2)氨水流加法氨水流加法 在发酵过程中根据在发酵过程中根据PHPH值的变化流加氨水调节值的变化流加氨水调节PHPH值，且值，且作为氮源作为氮源，供给，供给NHNH4 4+ +。氨水价格便氨水价格便宜，来源容易宜，来源容易。但是，但是，氨水作用快，对发酵液的氨水作用快，对发酵液的PHPH值波值波动影响大动影响大，应采用，应采用少量多次流加少量多次流加，以免造，以免造成成PHPH值过高，抑制菌体生长，或值过高，抑制菌体生长，或PHPH值过低，值过低，NHNH4 4+ +不足等现象。具体流加方法应根据菌种特性、不足等现象。具体流加方法应根据菌种特性、长菌情况、耗糖情况等决定，一般控制长菌情况、耗糖情况等决定，一般控制PHPH值值7.07.08.08.0，最好能够采用自动控制连续流加方法。，最好能够采用自动控制连续流加方法。(3)(3)尿素流加法尿素流加法 是目前国内味精厂普遍采用的方法。以是目前国内味精厂普遍采用的方法。以尿素尿素作为氮源进行流加调节作为氮源进行流加调节PHPH值值，由于，由于PHPH值值变化具有一定的规律性，易于操作控制。变化具有一定的规律性，易于操作控制。首先，由于通风、搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解首先，由于通风、搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解放氨，使放氨，使PHPH值上升；值上升；氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代谢产物，使谢产物，使PHPH值降低，这时就需要及时流加尿值降低，这时就需要及时流加尿素，以调节素，以调节PHPH值和补充氮源。值和补充氮源。当流加尿素后，尿素被菌体尿酶分解放出氨使当流加尿素后，尿素被菌体尿酶分解放出氨使PHPH值上升，氨被菌体利用和形成代谢产物使值上升，氨被菌体利用和形成代谢产物使PHPH值值下降，再次进行流加反复进行维持一定的下降，再次进行流加反复进行维持一定的PHPH值。值。流加时除主要根据流加时除主要根据PHPH值得变化外，值得变化外，还应考虑到还应考虑到菌体生长、耗糖、发酵菌体生长、耗糖、发酵的不同阶段来采取少量多次流加的不同阶段来采取少量多次流加，维持维持PHPH值稍低些，以利长菌。值稍低些，以利长菌。当当长菌快，耗糖快，流加量可适当多长菌快，耗糖快，流加量可适当多些，些，PHPH值可略高些，发酵后期以有利于促进值可略高些，发酵后期以有利于促进产谷氨酸，维持产谷氨酸，维持PHPH值值7.27.2左右为好。左右为好。当当残糖已很少，接近放罐残糖已很少，接近放罐，以不加或少加，以不加或少加为好，以免造成浪费和增加后工序提取的困难。为好，以免造成浪费和增加后工序提取的困难。不同不同pHpH值对菌体的形态影响很大，值对菌体的形态影响很大，当当pHpH值高于值高于7 75 5时，菌体易于老化，呈现球状；当时，菌体易于老化，呈现球状；当pHpH值低于值低于6 65 5时菌体同时菌体同样受抑制，易于老化。而在样受抑制，易于老化。而在7 72 2左右时，菌体是处于产酸期，左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在呈现长的椭圆形；在6 69 9左右时，菌体处于生长期，呈左右时，菌体处于生长期，呈“八八”字形状并占有绝对的优势。字形状并占有绝对的优势。pH6pH69 9时，菌体生长旺盛，时，菌体生长旺盛，pH7pH71515时，对菌体的时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段阶段pHpH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9pH6.9，到，到48h48h后后pHpH值为值为7 71515，到，到80h80h后后pHpH值为值为7 72525。产率。产率222227g27g/L/L，产酸率提高，产酸率提高12122323。例：例：克拉维酸发酵中克拉维酸发酵中pH变换控制变换控制问题的提出问题的提出：在在pH低时菌体生长受抑制，在低时菌体生长受抑制，在高高pH时克拉维酸要分解时克拉维酸要分解用用2.52.5升罐进行的不控制升罐进行的不控制pHpH的发酵发现，前的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使使pHpH降至降至6.56.5。在达到最高细胞浓度后，。在达到最高细胞浓度后，pHpH开始从开始从6.56.5升至升至8.38.3。CACA产量达最高水平时，产量达最高水平时，pHpH不再升高。在发酵终止时，不再升高。在发酵终止时，pHpH再次升至再次升至8.58.5。随着。随着pHpH升高，升高，CACA迅速分解。迅速分解。研究不同研究不同pH对发酵的影响对发酵的影响分别配置分别配置pH为为6.0，7.0，8.0的培养基测的培养基测定菌的生长和产物合成定菌的生长和产物合成pH6.0时，生长受时，生长受抑制，产物降解抑制，产物降解少少pH8.0时生长良好时生长良好产量低，产物降解产量低，产物降解pH7.0时的状况时的状况控制控制pH7.0pH7.0和和8.08.0时，最高细胞浓度接近相同时，最高细胞浓度接近相同( (约约1616PMV)PMV)，但控制，但控制pH6pH60 0时细胞生长受抑制。时细胞生长受抑制。在在2 25 5升生物反应器内，升生物反应器内，不控制不控制pHpH时时2 247g47g(m1(m1h )h )控制控制pH7.0pH7.0时的产率时的产率3 337g37g(m1(m1h) h) 最高最高控制控制pH8.0pH8.0时，产率时，产率2 202g02g(m1(m1h) h) 在控制在控制pH6pH60 0时，时，CACA产生被抑制产生被抑制, ,但降解少但降解少因此对细胞生长和因此对细胞生长和CACA产生最好将产生最好将pHpH控制于控制于7.07.0，但在控制但在控制pH7.0pH7.0时，仍出现时，仍出现CACA的迅速分解。的迅速分解。由于由于CACA生产的最适生产的最适pHpH和减少和减少CACA分解的分解的pHpH各不相同，各不相同，因此在因此在分批发酵中应用了分批发酵中应用了pHpH变换策变换策略略，使发酵，使发酵pHpH由中性由中性pH7pH70 0变换为酸性变换为酸性pH6.0pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生在发酵前期，在细胞生长和产生CACA期间控制期间控制pH7.0pH7.0，4d4d后，当后，当CACA产量达最高值时，变换产量达最高值时，变换pHpH为为6.06.0，以减少，以减少CACA分解。最高分解。最高CACA浓度可保持浓度可保持24h24h。由。由于改变于改变pHpH，使，使CACA分解速率明显降低。分解速率明显降低。pHpH控制是一项非常细致的工作，控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳不仅考虑最佳pHpH值，而且值，而且要根据要根据生长阶段考察对生长阶段考察对pHpH的要求的要求。在。在pHpH控制中还要采用合适的调节方法。控制中还要采用合适的调节方法。总结总结小小 结结发酵过程发酵过程pH会发生变化会发生变化变变化化原原因因基质代谢基质代谢产物形成产物形成菌体自溶菌体自溶对对发发酵酵的的影影响响pHpH影响酶的活性影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改值影响微生物细胞膜所带电荷的改变变pH值影响培养基某些成分和中间代谢值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离物的解离pH影响代谢方向影响代谢方向 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 pHpH的的控控制制方方式式基础培养基调节基础培养基调节pH在基础料中加入维持在基础料中加入维持pH的的物质物质通过补料调节通过补料调节pH 当补料与调当补料与调pH发生矛盾时，发生矛盾时，加酸碱调加酸碱调pH 发酵的不同阶段采取不同的发酵的不同阶段采取不同的pH值值选择合适的选择合适的pH调节剂调节剂从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前个阶段：前10 h是菌体生长期，之后热凝胶是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。在菌体生长期，在菌体生长期，DO 直线下降，培养液中的直线下降，培养液中的pH也迅速下降。也迅速下降。10 h左右，菌体质量浓度达左右，菌体质量浓度达到最大值，到最大值，DO 和和pH降至最低点（降至最低点（5.45.6），），菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。试验两阶段的最适试验两阶段的最适pH，见表，见表稳定期随着稳定期随着pH降低，糖耗速降低，糖耗速率增加，生物量增加，但产率增加，生物量增加，但产物合成速率在物合成速率在pH5.6时达到最时达到最高。说明当高。说明当pH小于小于5.6以后微以后微生物消耗的糖并非用于合成生物消耗的糖并非用于合成热凝胶，而是合成菌体。热凝胶，而是合成菌体。一、温度对生长的影响一、温度对生长的影响不同微生物的生长对不同微生物的生长对温度的要求不同温度的要求不同根据它们对温度的要求大致可分为根据它们对温度的要求大致可分为四类四类：嗜冷菌适应于嗜冷菌适应于0 02626度生长，嗜温菌适应度生长，嗜温菌适应于于15154343度生长，嗜热菌适应于度生长，嗜热菌适应于37376565度度生长，嗜高温菌适应于生长，嗜高温菌适应于6565度以上生长度以上生长 在在最适温度最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；微生物即受到抑制或死亡；在在最低温度范围最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。度非常缓慢，世代时间无限延长。在在最低和最高温度之间最低和最高温度之间，微生物的生长速率，微生物的生长速率随温度升高而增加，随温度升高而增加，超过最适温度超过最适温度后，随温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。 每种微生物对温度的要求可用每种微生物对温度的要求可用最适温最适温度、最高温度、最低温度度、最高温度、最低温度来表征来表征微生物受微生物受高温的伤害比低温的伤害高温的伤害比低温的伤害大大，即超过最高温度，微生物很快，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。就是菌种保藏的原理。1 1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持膜中的脂质成分应保持液晶状态液晶状态，只有当细胞膜处于只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态最佳生长状态微生物的微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致相一致。二、微生物与温度相关性的原理二、微生物与温度相关性的原理液晶状态液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。的过渡状态称为液晶态。由由固态转变为液晶态固态转变为液晶态的温度称为熔点，以的温度称为熔点，以T1表示；表示；由由液晶态转变为液态液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以的温度称为清亮点，以T2表示。表示。T1与与T2之间的温度称为之间的温度称为液晶温度范围液晶温度范围。什么是液晶状态？什么是液晶状态？那么为什么不同微生物对温度的要那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？求不同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。成有很大区别。嗜热菌只含嗜热菌只含饱和脂肪酸饱和脂肪酸，而嗜冷菌含，而嗜冷菌含有较高的有较高的不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸。2 2、蛋白质结构、蛋白质结构人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：完整性和催化功能：(1)(1)通过通过自然或诱导突变自然或诱导突变，将特定残基发，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行对比；生改变的蛋白与其天然结构进行对比；(2)(2)对比同属嗜热、嗜温及嗜冷对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白结构菌的蛋白结构通过对嗜冷酶的蛋白质模型和通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x x一射线一射线衍射分析表明：衍射分析表明：嗜冷酶分子间的作用力减弱嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用在低温下容易被底物诱导产生催化作用由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在许多中温菌不能在O O0 0C C合成蛋白质，一方面是由于其合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。3 3、蛋白质合成、蛋白质合成嗜冷菌具有在嗜冷菌具有在00合成蛋白质的能力合成蛋白质的能力将大肠杆菌从将大肠杆菌从37370 0C C突然转移到突然转移到10100 0C C条件时细胞中会诱导合成条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的是密切相关的。4 4、合成冷休克蛋白、合成冷休克蛋白低温微生物适应低温的另一机制低温微生物适应低温的另一机制是是合成冷休克蛋白合成冷休克蛋白三、温度的影响与控制三、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响（一）温度对发酵的影响1 1、温度影响反应速率、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得积分得 E=E活化能活化能Kr速率常数速率常数2 2、温度影响发酵方向、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四产生金霉素和四环素环素，当温度低于，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。环素。温度还影响基质溶解度温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。过程中的温度要严格控制。（二）最适温度的选择（二）最适温度的选择1 1、根据菌种及生长阶段选择、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所所要求的温度范围也不同要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为青霉菌生长温度为300C。在在发酵前期发酵前期由于菌量少，发酵目的由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，是要尽快达到大量的菌体，取稍高取稍高的温度的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；生长迅速；l根据生长阶段选择根据生长阶段选择发酵中期发酵中期菌量已达到合成产物的最适量，菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要发酵需要延长中期，从而提高产量延长中期，从而提高产量，因，因此中期此中期温度要稍低温度要稍低一些，可以推迟衰一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。合成。发酵后期发酵后期产物合成能力降低产物合成能力降低，延长发酵周期没有必，延长发酵周期没有必要，就要，就又提高温度又提高温度，刺激产物合成到放罐。，刺激产物合成到放罐。如如四环素生长阶段四环素生长阶段28，合成期，合成期26后期再升温；后期再升温；黑曲霉生长黑曲霉生长37，产糖化酶，产糖化酶3234。但也有的。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长3032，产酸，产酸3437。最适温度选择要根据。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。菌种与发酵阶段做试验。例：例：林可霉素发酵的变温培养林可霉素发酵的变温培养问题的提出问题的提出接种后接种后10h10h左右已进入对数生长期，随后是左右已进入对数生长期，随后是10h10h左右的加速生长左右的加速生长期，在期，在40h40h左右对数生长期基本完成，在左右对数生长期基本完成，在50h50h左右转入生产期左右转入生产期主要问题：主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在量的有强生产能力的菌丝体存在l根据生长阶段选择温度根据生长阶段选择温度变温培养的正交设计变温培养的正交设计前前60h60h按按3131控制，缩短了适应期使发酵提前转入生控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础生素提供了物质基础6060小时后小时后将罐温降至将罐温降至3O3O使与抗生素合成有关的使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期发酵进入后期罐温再回升至罐温再回升至31 31 使生产菌在生使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。结论：结论：2 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。营养利用快，会使菌过早自溶。菌生长快菌生长快，维持在较高温度时间要短些；，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。综合考虑。要通过反复实践要通过反复实践来定出最适温度。来定出最适温度。3 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况四、发酵过程引起温度变化的因素四、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热（一）发酵热Q Q发酵发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。原因。所谓所谓发酵热发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。热小，温度上升慢。1 1、生物热、生物热Q Q生物生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫这散发出来的热就叫生物热生物热。微生物进行微生物进行有氧呼吸产生的热比厌有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。氧发酵产生的热多。l生物热与发酵类型有关生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水和水好氧：好氧：产生产生287.2千焦耳热量，千焦耳热量， 183千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放千焦以热的形式释放厌氧：厌氧：产生产生22.6千焦耳热量，千焦耳热量， 9.6千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和和42.6在在培养初期培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。产生热量较少。菌体在菌体在对数生长期对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。度。培养后期培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。l 培养过程中生物热的产生培养过程中生物热的产生具有强烈的具有强烈的时间性时间性。生物的大小与呼吸作用强弱有关生物的大小与呼吸作用强弱有关如果培养前期温度上如果培养前期温度上升缓慢升缓慢说明说明菌体代谢缓慢，发酵不正常菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。此外培养基营养越丰富，生物热也越大。2 2、搅拌热、搅拌热Q Q搅拌搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦摩擦，产生产生可观的热量可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：下式计算： Q搅拌搅拌P8604186.8（焦耳焦耳/小时）小时） P搅拌轴功率搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量机械能转变为热能的热功当量电机功率电机功率P= E额定电压额定电压I额定电流额定电流cos功率因素，功率因素，1千瓦时千瓦时8604186.8焦耳焦耳3 3、蒸发热、蒸发热Q Q蒸发蒸发 通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热显热，显热很小，一般可以忽略不计。显热很小，一般可以忽略不计。4 4、辐射热、辐射热Q Q辐射辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。体向外辐射。辐射热辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q辐射辐射（二）发酵热的测定（二）发酵热的测定有二种发酵热测定的方法。一种是用有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口冷却水进出口温度差计算发酵热温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。发酵热。Q发酵发酵GCm(T出出T进进)Cm水的比热水的比热G冷却水流量冷却水流量另一种是根据另一种是根据罐温上升速率来计算罐温上升速率来计算。先自控，。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。因为热效应决定于因为热效应决定于系统的初态和终态系统的初态和终态，而与，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。和。H（H）反应物反应物（H）产物产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖葡萄糖 159555.9KJ/Kg谷氨酸谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米浆玉米浆 12309.2KJ/Kg菌体菌体 20934KJ/Kg尿素尿素 10634.5KJ/Kg根据化合物的根据化合物的燃烧值燃烧值估算发估算发酵过程生物热的近似值。酵过程生物热的近似值。五、利用温度控制提高产量五、利用温度控制提高产量例例1 利用利用热冲击热冲击处理技术提高发酵甘油的产量处理技术提高发酵甘油的产量背景：背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱磷酸甘油脱氢酶的活力提高氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高，并导致甘油产量提高实验：实验：甘油发酵是在甘油发酵是在髙渗透压环境中髙渗透压环境中进行进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件正交条件A 冲击温度（冲击温度（0C） 40，45，50 B 开始时机（开始时机（h） 8，16，30 C 冲击时间（分）冲击时间（分） 15，30，60结果发酵结果发酵16小时，小时，450C冲击冲击30分钟最佳分钟最佳，发酵发酵96小时后甘油浓度提高小时后甘油浓度提高32.6，发酵罐实验见图，发酵罐实验见图（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30min例例2 重组大肠杆菌人重组大肠杆菌人Cu/Zn-SODCu/Zn-SOD的高表达的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂启动子，用乳糖作诱导剂 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活比活 810 1471 679 526蛋白蛋白 6.129 9.70 9.79 11.88OD600 7.41 10.72 11.78 24.77原因：原因：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。2、高温下高温下可能可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加降解速率增加，杂蛋白增加3、低温下低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少由于比生长速率低，质粒脱落减少4、低温下低温下菌的衰老减缓，死亡率低菌的衰老减缓，死亡率低小小 结结微生物最适生长温度微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的生长温度与细胞膜的微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度液晶温度范围相范围相一致一致微生物对温度的要求与微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用域氨基酸的取代，离子束缚作用(ion binding)减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等温度对发酵的影响：温度对发酵的影响：温度影响反应速率温度影响反应速率温度影响发酵方向温度影响发酵方向最最适适温温度度的的选选择择根据菌种根据菌种生长阶段选择生长阶段选择根据培养条件选择根据培养条件选择菌种的生长情况菌种的生长情况发酵过程引起温度变化的因素发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q辐射辐射生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关关搅拌热与搅拌功率有关搅拌热与搅拌功率有关发酵热测定发酵热测定: 冷却容量冷却容量 燃烧热燃烧热思考题思考题7.16 根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？微生物？7.17 微生物对温度要求不同的原理是什么？微生物对温度要求不同的原理是什么？7.18 发酵过程的温度会不会变化？为什么发酵过程的温度会不会变化？为什么7.19 发酵热的定义发酵热的定义7.20 生物热的大小与哪些因素有关？生物热的大小与哪些因素有关？7.21 温度对发酵有哪些影响？温度对发酵有哪些影响？7.22 发酵过程温度的选择有什么依据？发酵过程温度的选择有什么依据？ 第六节第六节 染菌的防治染菌的防治发酵过程中除了生产菌以外，还有其发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖它菌生长繁殖什么是染菌？什么是染菌？一、染菌的影响一、染菌的影响发酵过程污染杂菌，发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产会严重的影响生产，是，是发酵工业的发酵工业的致命伤致命伤。l造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失损失l扰乱生产秩序，破坏生产计划。扰乱生产秩序，破坏生产计划。l遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。会影响人们的情绪和生产积极性。l影响产品外观及内在质量影响产品外观及内在质量（一）染菌对发酵的（一）染菌对发酵的影响影响生产不同的品种，可污染不同种生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果养条件又可产生不同后果 1、发酵染菌对不同品、发酵染菌对不同品种的影响种的影响放线菌由于生长的最适放线菌由于生长的最适pH为为7左右，因此染左右，因此染细菌为多，而霉菌生长细菌为多，而霉菌生长pH为为5左右，因此染左右，因此染酵母菌为多。酵母菌为多。青霉素发酵染菌青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。使青霉素迅速破坏。不同菌不同产品链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。不同产品疫苗生产疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。也越大。不同产品2、污染不同种类和性质的微、污染不同种类和性质的微生物的影响生物的影响（1 1）污染噬菌体）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被幅度下降，严重的造成断种，被迫停产迫停产。（2 2）污染其它杂菌）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌有些杂菌会使生产菌自溶自溶产生大量泡沫，即产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降下降，使不耐酸的产品破坏。使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。菌。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。染菌。 3、不同时间染菌对发、不同时间染菌对发酵的影响酵的影响污染时间污染时间是指用无菌检测方法确准的污染是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。有关。污染的污染的菌量多菌量多，显现染菌所，显现染菌所需的时间就需的时间就短短，污染，污染菌量少菌量少，显现染菌的时间就显现染菌的时间就长长。（1 1）种子培养期染菌）种子培养期染菌由于由于接种量较小接种量较小，生产菌生长一开始不占，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它或只有很少抗生素（产物）。因而它防御防御杂菌能力低杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液染菌，应将培养液全部废弃全部废弃。（2 2）发酵前期染菌）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。发酵前期最易染菌，且危害最大。原因原因 发酵前期菌量不很多，发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优与杂菌没有竞争优势；势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵抵御杂菌能力弱。御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3 3）发酵中期染菌）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢谢。杂菌大量产酸，培养液杂菌大量产酸，培养液pHpH下降；糖、氮消耗快，发酵液下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。泡沫。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。制杂菌。（4 4）发酵后期染菌）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，严重，又破坏性较大，可以提前放罐可以提前放罐。4、染菌程度对发酵的影响、染菌程度对发酵的影响 染菌程度愈大，即进入发酵罐的染菌程度愈大，即进入发酵罐的杂菌数量多，对发酵的危害愈大。杂菌数量多，对发酵的危害愈大。当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污当生产菌已迅速繁殖，在发酵液中占有优势，污染极少数杂菌，如每染极少数杂菌，如每1L1L中有中有1 12 2个杂菌，对发个杂菌，对发酵不会带来影响，因为这些杂菌需要时间繁殖酵不会带来影响，因为这些杂菌需要时间繁殖才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的才能达到危害发酵的程度，而且环境对杂菌的繁殖已不利。当繁殖已不利。当75m75m3 3发酵液污染发酵液污染1 1个杂菌，要个杂菌，要达到大幅度达到大幅度(10(106 6个个/ /mLmL) )污染时需要的时间污染时需要的时间(h)(h)为：为：条件条件 污染污染10106 6个个/ /mLmL 污染污染108108个个/ /mLmL增代时间增代时间t tg g=30min 23 26=30min 23 26延迟延迟6ht6htg g=30min 29 32=30min 29 32增代时间增代时间t tg g=2h 92 106=2h 92 106延迟延迟6ht6htg g=2h 98 112=2h 98 112 但是污染幅度较大时，特别是发酵前期但是污染幅度较大时，特别是发酵前期和中期污染，将造成严重的危害。和中期污染，将造成严重的危害。（二）发酵染菌对提炼和产（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响品质量的影响1 1、发酵染菌对过滤的影响、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致导致过滤困难过滤困难。即使采取加热、冷却、。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。效果并不理想。污染杂菌的种类对过滤的影响程污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而困难而大幅度降低过滤收率，大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总直接影响提炼总收率。收率。2 2、发酵染菌对提炼的影响、发酵染菌对提炼的影响染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树降低离子交换树脂的交换容量，脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。二、染菌的原因二、染菌的原因（一）发酵染菌率计算基准（一）发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。统一计算方法。总染菌率总染菌率%=可以说产生这种现象大多数是由于工作可以说产生这种现象大多数是由于工作中中“明知故犯明知故犯”“”“不负责任不负责任”和和“侥幸侥幸心理心理”所造成的。所造成的。（二）染菌原因（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚比较清楚的的但在实际生产中发酵染但在实际生产中发酵染菌率仍比较高菌率仍比较高例如，例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将收集到的国内外几家抗生素工菌而告终。现将收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：厂发酵染菌原因列于下：日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%种子带菌或怀疑种子带菌种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶泡沫冒顶 0.48夹套穿孔夹套穿孔 12.36盘管穿孔盘管穿孔 5.89接种管穿孔接种管穿孔 0.39阀门渗漏阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏罐盖漏 1.54其它设备渗漏其它设备渗漏 10.13操作原因操作原因 10.15 原因不明原因不明 24.94上海第三制药厂染菌原因分析上海第三制药厂染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%种子带菌种子带菌 14.15盘管穿孔盘管穿孔 14.20阀门渗漏阀门渗漏 23.30空气系统有菌空气系统有菌 10.0管理不善管理不善 25.80其它其它 7.49原因不明原因不明 5.78 管理不善而染菌的有管理不善而染菌的有31个罐批，占个罐批，占25.08经经分析有下表所列原因：分析有下表所列原因： 项目项目 百分率百分率%进罐前未做设备严密度检查进罐前未做设备严密度检查 25.8接种违反操作规程接种违反操作规程 25.8检修质量缺乏验收制度检修质量缺乏验收制度 19.35操作不熟练操作不熟练 19.35配料违反工艺规程配料违反工艺规程 6.45调度不当调度不当 3.25第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%外界带入杂菌（取样、补料）外界带入杂菌（取样、补料） 8.20设备穿孔设备穿孔 7.60空气系统有菌空气系统有菌 26.00停电罐压跌零停电罐压跌零 1.60接种接种 11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60管理问题管理问题 7.80 操作违反规程操作违反规程 1.60种子带菌种子带菌 0.60原因不明原因不明 35.00造成染菌的主要原因总结造成染菌的主要原因总结1、设备渗漏、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。和其它设备漏等。所以说加强设备本身及附属零部件的所以说加强设备本身及附属零部件的严密严密度检查度检查，对制服染菌是极其主要的，也是，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。重要的。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占因分析发现，这类染菌占33.8533.85，上，上海三厂的分析这类染菌为海三厂的分析这类染菌为37.537.5。2、空气带菌、空气带菌从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为菌而造成的染菌分别为19.96和和 26%。国内外。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使但仍然没有使染菌率降低到理想的程度染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。菌失败。3、种子带菌、种子带菌种子带菌又分为种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养种子本身带菌和种子培养过程中染菌过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。一样有许多因素造成。4、灭菌不彻底、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系l蒸汽通入培养基，蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间升温快慢、保温时间产产生过多泡沫生过多泡沫l蒸汽总压是否达到要求标准蒸汽总压是否达到要求标准l环境中的环境中的杂菌数量因季节而有很大差别杂菌数量因季节而有很大差别。如如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。率因季节不同而发生明显变化。l原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料液糖等有机原料杂菌的数量杂菌的数量l发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有无灭菌的死角有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分对减少或避免染菌仍然是十分必要的。必要的。 5、技术管理不善、技术管理不善技术管理就是要对发酵每个技术管理就是要对发酵每个环节严格控制环节严格控制发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理有侥幸心理而放松管理三、无菌状况的检测三、无菌状况的检测1、环境无菌的检查、环境无菌的检查尘埃粒子检测尘埃粒子检测无菌平板检测无菌平板检测2、种子及发酵液无菌状况检测、种子及发酵液无菌状况检测酚红肉汤培养基检测酚红肉汤培养基检测平板划线平板划线显微镜观察显微镜观察四、染菌情况分析四、染菌情况分析染菌的原因有多种，对于实际情况染菌的原因有多种，对于实际情况如何如何分析分析呢？呢？1、单罐染菌、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效过滤器失效2、多罐染菌、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底3、前期染菌、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底种子带菌、培养基灭菌不彻底4、中后期染菌、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题漏，一般不会是种子问题五、染菌的防止五、染菌的防止1、防止种子带菌、防止种子带菌l制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。l沙土制备时要多次间歇灭菌沙土制备时要多次间歇灭菌l注意接种时的无菌操作注意接种时的无菌操作l子瓶、母瓶的移种和培养子瓶、母瓶的移种和培养l无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。灭菌，或用化学药品灭菌。无菌室要求无菌室要求在无菌室中装有在无菌室中装有紫外灯紫外灯，打开紫外灯，照半小，打开紫外灯，照半小时，关灯后时，关灯后15分钟再接种。分钟再接种。用用消毒药水消毒药水如新洁而灭配成如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在接种时必须在超净台上操作超净台上操作，超净台装有一台，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净用酒精棉球擦干净。2、防止设备渗漏、防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会不良等原因会导致设备及附件渗漏导致设备及附件渗漏导致设备及附件渗漏导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现法才能发现 。水压试漏法水压试漏法试漏方法试漏方法集气桶试漏法集气桶试漏法水压试漏法水压试漏法。方法是方法是方法是方法是被测设备的出口处装上压被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用阀门渗漏可以用集气桶集气桶来试漏。来试漏。方法是方法是先在先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。3、防止培养基灭菌不彻底、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌分批灭菌分批灭菌 1210C，30分钟分钟连续灭菌连续灭菌 罐温罐温1251300C，3045分钟分钟蒸汽下进上出连续灭菌设备流程连续灭菌设备流程连连 消消 塔塔培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽蒸汽压力压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量大量泡沫泡沫或发酵罐中有或发酵罐中有污垢堆积污垢堆积，就会窝藏大，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。量杂菌，造成灭菌不彻底。为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？沫呢？培养基和水的培养基和水的传热系数传热系数比空气的传热系数大，比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。蒸汽直接接触，未被杀死。防止方法：防止方法： 缓慢开启蒸汽阀门，缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“ “死角死角死角死角” ”。这些死角蒸汽不能有效达到，常。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌会窝藏耐热芽孢杆菌.所以设备安装要注意不所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。垢。所以设备安装要注意不能造成所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。铲除污垢。4、防止空气引起的染菌、防止空气引起的染菌空气过滤除菌设备流程空气过滤除菌设备流程空压机空压机储罐储罐二级冷却二级冷却加热器加热器空气过滤空气过滤粗过滤粗过滤空气冷却器的列管空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。到空气中，造成染菌。棉花棉花- -活性炭过滤器活性炭过滤器长期使用后，棉花和活长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。效。过滤器用蒸汽灭菌时，若过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质，灭菌时超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要接，要装上止逆阀装上止逆阀防止其它物料窜入空气管防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。道污染过滤器，导致过滤介质失效。5、发酵染菌后的措施、发酵染菌后的措施l染菌后的培养基必须灭菌后才可放下染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。染而导致其它罐批染菌。l凡染菌的罐要找染菌的原因凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。l染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。须用甲醛蒸汽消毒。六、染噬菌体的防治六、染噬菌体的防治（一）染噬菌体对发酵的影响（一）染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果发酵过程中如果受噬菌体的侵染受噬菌体的侵染，一，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。失。1 1、镜检可发现、镜检可发现菌体数量明显减少菌体数量明显减少，菌体，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。短时间内菌体自溶。2 2、发酵、发酵pHpH值逐渐上升值逐渐上升，4-84-8小时之内可达小时之内可达8.08.0以上，不再下降。以上，不再下降。3 3、发酵液、发酵液残糖高残糖高，有，有刺激臭味刺激臭味，粘度大，粘度大，泡沫多泡沫多。4 4、生产量、生产量甚少或增长缓慢或停止甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验染噬菌体表现为：染噬菌体表现为：（二）产生噬菌体的原因（二）产生噬菌体的原因经过经过1-21-2年以后，主要是由于生产和年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。自然界中噬菌体增殖的好机会。通常在工厂投产初期并不感到通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害噬菌体的危害这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也以及人们的走动、车辆的往来也携带着携带着噬菌体到处传播噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐统进入种子室、种子罐、发酵罐在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入脂）作下层。同样的培养基中加入20203030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上培养皿上是否出现噬菌斑是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，表面，培养过夜，观察有无透明圈观察有无透明圈出现出现。（三）染噬菌体的检测（三）染噬菌体的检测（四）噬菌体的防治（四）噬菌体的防治 1 1、必须建立、必须建立工厂环境清洁卫生工厂环境清洁卫生制度制度，定期检查、定期清扫，车间四周有，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。粉。 2 2、车间地面和通往车间的道路尽量采取、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面水泥地面 3 3、种子和发酵工段的操作人员要严格种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间培养物不得带入菌种室、摇瓶间 4 4、认真、认真进行发酵罐、补料系统的灭进行发酵罐、补料系统的灭菌菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。放。 5 5、选育、选育抗噬菌体的菌种抗噬菌体的菌种，或轮换使用，或轮换使用菌种。菌种。 6 6、发现噬菌体、发现噬菌体停搅拌停搅拌、小通风小通风，将发将发酵液加热到酵液加热到70-800C70-800C杀死噬菌体杀死噬菌体，才，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。小小 结结染菌对发酵的危害：染菌对发酵的危害：干扰生产菌的正常代谢，降低产量干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变改变pH，降解某些产物，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害污染不同的微生物，不同阶段染菌危害染菌对提炼的危害：染菌对提炼的危害：过滤困难而大幅度降低过滤收率过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化有机溶剂萃取时发生乳化染染菌菌原原因因设备渗漏设备渗漏空气带菌空气带菌种子带菌种子带菌灭菌不彻底灭菌不彻底技术管理不善技术管理不善染染菌菌后后的的措措施施染染菌菌防防治治发酵液必须灭菌后才可放下水道发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒产生噬菌体的原因产生噬菌体的原因活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源噬噬菌菌体体的的防防治治危害：造成断种，无法生产危害：造成断种，无法生产建立工厂环境清洁卫生制度建立工厂环境清洁卫生制度感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间瓶间发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到热到70800C杀死噬菌体，才可排放。杀死噬菌体，才可排放。环境用漂白粉消毒环境用漂白粉消毒选育抗噬菌体的菌种选育抗噬菌体的菌种第六节第六节 泡沫的控制泡沫的控制一、泡沫的性质一、泡沫的性质在微生物发酵过程中为了适应微生物在微生物发酵过程中为了适应微生物的生理特性，并取得较好的生产效果，的生理特性，并取得较好的生产效果，要通入大量的无菌空气。要通入大量的无菌空气。同时，又为了加速氧在水中溶解度，就必须加剧同时，又为了加速氧在水中溶解度，就必须加剧烈的搅拌，使气泡分割成无数小气泡，以增加气烈的搅拌，使气泡分割成无数小气泡，以增加气液界面。液界面。气液界面的增加气液界面的增加为了达到充分交换的目的，气泡还必须在培养液为了达到充分交换的目的，气泡还必须在培养液中有一定的滞留时间。中有一定的滞留时间。有利于有利于微生物呼吸过程中所产生的二氧化碳微生物呼吸过程中所产生的二氧化碳的逸出的逸出因此，在通气发酵过程中，产生一因此，在通气发酵过程中，产生一定数量的泡沫，是必然的正常现象定数量的泡沫，是必然的正常现象但是过多的持久性泡沫会给发但是过多的持久性泡沫会给发酵带来很多不利因素酵带来很多不利因素如如发酵罐的装料系数发酵罐的装料系数( (装量与容量之比装量与容量之比) )的减少，的减少，若不加以控制，还会造成若不加以控制，还会造成排气管大量逃排气管大量逃液液的损失的损失泡沫升到罐顶有可能从轴封渗出，泡沫升到罐顶有可能从轴封渗出，增加污染增加污染杂菌的机会杂菌的机会，并使部分菌丝粘附在罐盖或，并使部分菌丝粘附在罐盖或罐壁上，而失去作用。罐壁上，而失去作用。泡沫严重时泡沫严重时还会影响通气搅拌的正常进行，因而还会影响通气搅拌的正常进行，因而妨碍妨碍菌体的呼吸，造成代谢异常菌体的呼吸，造成代谢异常，导，导致终产物产量下降或菌体的致终产物产量下降或菌体的提早自溶提早自溶后一过程任其发展会促使更多的泡沫生成后一过程任其发展会促使更多的泡沫生成因此，如何控制发酵过程中产因此，如何控制发酵过程中产生的泡沫，是能否取得高产的生的泡沫，是能否取得高产的因素之一。因素之一。泡沫是气体被分散在少量液体泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。发酵过程中所遇到的泡沫，发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相其分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液是发酵液。按发酵液的性质不同，存在着两按发酵液的性质不同，存在着两种类型的泡沫种类型的泡沫：一类存在于发酵液的液面上一类存在于发酵液的液面上，这类泡沫气，这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线，如在某些稀薄的前期发之间有能分辨的界线，如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见到的；酵液或种子培养液中所见到的；另一种泡沫是出现在粘稠的菌丝发酵液另一种泡沫是出现在粘稠的菌丝发酵液当中当中，这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较，这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定，泡沫与液体间没有明显的液面界线，在稳定，泡沫与液体间没有明显的液面界线，在鼓泡的发酵液中气体分散相占比例由下而上地鼓泡的发酵液中气体分散相占比例由下而上地逐渐增加。逐渐增加。 泡沫生成不外两种原因泡沫生成不外两种原因一种是由外界引进的气流被机械地分散形式一种是由外界引进的气流被机械地分散形式另一种是由发酵过程中产生的气体聚结生成。后另一种是由发酵过程中产生的气体聚结生成。后一种方式生成的泡沫被称为一种方式生成的泡沫被称为发酵泡沫发酵泡沫，它只，它只有在代谢旺盛时才比较明显。有在代谢旺盛时才比较明显。二、发酵过程泡沫变化二、发酵过程泡沫变化泡沫的多少一方面与泡沫的多少一方面与通风、搅拌通风、搅拌的剧烈程度有的剧烈程度有关，搅拌所引起的泡沫比通气来得大；关，搅拌所引起的泡沫比通气来得大；另一方面与另一方面与培养基所用原材料培养基所用原材料的性质有关。蛋的性质有关。蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的起泡因素，起泡能力随品种、产粉等是主要的起泡因素，起泡能力随品种、产地、加工条件而不同，还与配比及培养基浓度地、加工条件而不同，还与配比及培养基浓度和粘度有关。和粘度有关。 好气性发酵过程中泡沫的形好气性发酵过程中泡沫的形成是有一定规律的。成是有一定规律的。葡萄糖等糖类葡萄糖等糖类本身起泡能力很差，但在本身起泡能力很差，但在丰富培养基中浓度较高的糖类丰富培养基中浓度较高的糖类增加了培养基增加了培养基的粘度的粘度，从而，从而有利于泡沫的稳定有利于泡沫的稳定。通常培养。通常培养基的配方含蛋白质多，浓度高，粘度大，越基的配方含蛋白质多，浓度高，粘度大，越容易起泡，泡沫多而持久稳定。容易起泡，泡沫多而持久稳定。胶体物质多，粘度大胶体物质多，粘度大的培养基更容易的培养基更容易产生泡沫，如糖蜜原料与石油烃类原料，发产生泡沫，如糖蜜原料与石油烃类原料，发泡能力特别强，泡沫多而持久稳定。泡能力特别强，泡沫多而持久稳定。水解糖的水解不完全，糊精含量水解糖的水解不完全，糊精含量多多，也容易引起泡沫产生。，也容易引起泡沫产生。培养基的灭菌方法和操作条件培养基的灭菌方法和操作条件均均会影响培养基成分的变化而影响发酵时泡沫的会影响培养基成分的变化而影响发酵时泡沫的产生。产生。 因此可见，发酵过程中泡沫形成的稳定因此可见，发酵过程中泡沫形成的稳定性与培养基的性质有着密切的关系性与培养基的性质有着密切的关系。在发酵过程中培养液的性质，在发酵过程中培养液的性质，因微生物的因微生物的代谢活动处在运动代谢活动处在运动变化变化中，也影响到泡沫的形成中，也影响到泡沫的形成和消长。和消长。例如例如霉菌在发酵过程中的代谢活动所引起培养霉菌在发酵过程中的代谢活动所引起培养液的液体表面性质变化也直接影响泡沫的消长。液的液体表面性质变化也直接影响泡沫的消长。发酵初期发酵初期表面粘度下降和表面张力上升，泡沫寿命逐渐缩表面粘度下降和表面张力上升，泡沫寿命逐渐缩短，这说明霉菌在代谢过程中在短，这说明霉菌在代谢过程中在各种细胞外各种细胞外酶如蛋白酶、淀粉酶等作用酶如蛋白酶、淀粉酶等作用下，把造成泡下，把造成泡沫稳定的物质如沫稳定的物质如蛋白质等逐步降解蛋白质等逐步降解利用，结利用，结果发酵粘度降低，泡沫减少。果发酵粘度降低，泡沫减少。由于培养基浓度大，粘度高，营养料丰富，因而由于培养基浓度大，粘度高，营养料丰富，因而泡泡沫的稳定性与高的表面粘度和低的表面张力沫的稳定性与高的表面粘度和低的表面张力有关有关。随着发酵进行随着发酵进行菌的繁殖，尤其是细菌本身菌的繁殖，尤其是细菌本身具有稳定泡沫的作用具有稳定泡沫的作用发酵最旺盛时泡沫形成比较多，在发酵后期菌体发酵最旺盛时泡沫形成比较多，在发酵后期菌体自溶导致发酵液中可溶性蛋白质增加，又有利自溶导致发酵液中可溶性蛋白质增加，又有利于泡沫的产生。于泡沫的产生。此外，发酵过程中此外，发酵过程中污染杂菌而使发酵液污染杂菌而使发酵液粘度增加粘度增加，也会产生大量泡沫。，也会产生大量泡沫。好气性发酵过程好气性发酵过程强烈的通气强烈的通气和搅拌和搅拌微生物的呼吸和发酵微生物的呼吸和发酵产生大量二氧化碳产生大量二氧化碳必然引起大量泡沫的产生必然引起大量泡沫的产生泡沫的泡沫的大量存在大量存在，不仅会干扰通气与搅，不仅会干扰通气与搅拌的进行，有碍微生物的代谢，拌的进行，有碍微生物的代谢，严重严重的导致大量跑料，造成浪费，的导致大量跑料，造成浪费，甚至引起杂菌感染甚至引起杂菌感染，直接引起发酵，直接引起发酵的正常进行。所以当泡沫大量产生时，的正常进行。所以当泡沫大量产生时，必须予以消除。必须予以消除。微生物工业上消除泡沫常用微生物工业上消除泡沫常用的方法有两种的方法有两种化学消泡化学消泡机械消泡机械消泡三、化学消泡三、化学消泡 化学消泡化学消泡是一种使用化学消泡剂的消泡是一种使用化学消泡剂的消泡法，也是目前应用最广的一种消泡方法。法，也是目前应用最广的一种消泡方法。其优点其优点是化学消泡剂来源广泛，消泡效果是化学消泡剂来源广泛，消泡效果好，作用迅速可靠，尤其是合成消泡剂效率高，好，作用迅速可靠，尤其是合成消泡剂效率高，用量少，不需改造现有设备，不仅适用于大规用量少，不需改造现有设备，不仅适用于大规模发酵生产用，同时也适用于小规模发酵试验，模发酵生产用，同时也适用于小规模发酵试验，添加某种测试装置后容易实现自动控制等。添加某种测试装置后容易实现自动控制等。1.1.化学消泡机理化学消泡机理当化学消泡剂加入于起泡体系中，由于当化学消泡剂加入于起泡体系中，由于消泡剂消泡剂本身的表面张力比较低本身的表面张力比较低( (相对于发泡相对于发泡体系而言体系而言) )，当消泡剂接触到气泡膜表面时，当消泡剂接触到气泡膜表面时，使使气泡膜局部的表面张力降低气泡膜局部的表面张力降低，力，力的平衡受到破坏，此处为周围表面张力较大的的平衡受到破坏，此处为周围表面张力较大的膜所牵引，因而膜所牵引，因而气泡破裂气泡破裂，产生气泡合并，产生气泡合并，最后导致泡沫破裂。最后导致泡沫破裂。泡沫形成的因素很多泡沫形成的因素很多可以加一种可以加一种具有相反电荷的表面活性剂具有相反电荷的表面活性剂，以降低液膜的弹性以降低液膜的弹性( (机械强度机械强度) )，或加入某些具，或加入某些具有有强极性的物质强极性的物质与起泡剂争夺液膜上的空与起泡剂争夺液膜上的空间，并使液膜的机械强度降低，进而促使泡沫间，并使液膜的机械强度降低，进而促使泡沫破裂。破裂。当泡沫的表面层存在着极性的当泡沫的表面层存在着极性的表面活性物质而形成双电层表面活性物质而形成双电层泡沫的液膜具有较大的表面粘度泡沫的液膜具有较大的表面粘度通常一种好的化学消泡剂同时能具有通常一种好的化学消泡剂同时能具有降低液膜降低液膜的机械强度和表面粘度的双重性能的机械强度和表面粘度的双重性能。一般。一般情况下，尽量采用情况下，尽量采用水溶性较小、表面张力较水溶性较小、表面张力较小小的消泡剂，这样可以大大减少消泡剂的用量，的消泡剂，这样可以大大减少消泡剂的用量，消泡剂效果好。消泡剂效果好。可加入某些分子可加入某些分子内聚力较弱的物质内聚力较弱的物质，以降低液膜的表面粘度，从而促使液膜的液以降低液膜的表面粘度，从而促使液膜的液体流失而使泡沫破裂。体流失而使泡沫破裂。2.2.消泡剂选择的依据及常用的消泡剂选择的依据及常用的 消泡剂种类消泡剂种类根据消泡原理和发酵液的性质、要求，消泡剂必根据消泡原理和发酵液的性质、要求，消泡剂必须具有须具有以下特点以下特点。(1)(1)消泡剂必须是消泡剂必须是表面活性剂表面活性剂，且具较低的表，且具较低的表面张力，消泡作用迅速，效率高；面张力，消泡作用迅速，效率高；(2)(2)消泡剂对气消泡剂对气液界面的液界面的散布系数散布系数必须足够必须足够大，才能迅速发挥它的消泡活性，这就要求消大，才能迅速发挥它的消泡活性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性；泡剂具有一定的亲水性；(3)(3)消泡剂在水中的消泡剂在水中的溶解度较小溶解度较小，以保持其持，以保持其持久的消泡或抑泡性能；久的消泡或抑泡性能；(4)(4)对发酵过程对发酵过程无毒，对人、畜无害无毒，对人、畜无害，不，不被微生物同化，对菌体生长和代谢无影响，不被微生物同化，对菌体生长和代谢无影响，不影响产物的提取和产品质量；影响产物的提取和产品质量；(5)(5)不干扰溶解氧、不干扰溶解氧、PHPH值等测定仪值等测定仪表使用表使用，最好不影响氧的传递；，最好不影响氧的传递；(6)(6)消泡剂消泡剂来源方便，价格便宜来源方便，价格便宜。 许多物质都具有消泡作用，但许多物质都具有消泡作用，但是消泡程度不同，有些只是瞬是消泡程度不同，有些只是瞬时消泡作用，有些则可以在较时消泡作用，有些则可以在较长时间内起抑泡作用。长时间内起抑泡作用。微生物工业上常用的消泡剂主要有四类：微生物工业上常用的消泡剂主要有四类：天然天然油脂类；油脂类；高碳醇、脂肪酸和酯类；高碳醇、脂肪酸和酯类；聚醚类；聚醚类；硅酮类硅酮类( (聚硅油类聚硅油类) )。3.3.消泡剂的应用和增效作用消泡剂的应用和增效作用消泡剂加入发酵罐内能否及时起作用主要决定于该消泡剂加入发酵罐内能否及时起作用主要决定于该消泡剂的性能和扩散能力。消泡剂的性能和扩散能力。增加消泡剂的散增加消泡剂的散布可通过机械散布布可通过机械散布，也可借助某种称为载体，也可借助某种称为载体或分散剂的物质，使消泡剂更易于分布。或分散剂的物质，使消泡剂更易于分布。 消泡剂消泡剂特别是合成消泡剂特别是合成消泡剂消泡效果与使用方式有密消泡效果与使用方式有密切的关系切的关系(1)(1)消泡剂加载体增效消泡剂加载体增效：载体一般为惰性液体，：载体一般为惰性液体，消泡剂应能溶于载体或分散于载体中，如聚氧消泡剂应能溶于载体或分散于载体中，如聚氧丙烯甘油用豆油为载体丙烯甘油用豆油为载体( (消泡剂：油消泡剂：油=1=1：1.5)1.5)的的增效作用相当明显；增效作用相当明显；(2)(2)消泡剂并用增效消泡剂并用增效：如：如0.5%0.5%3%3%硅酮，硅酮，20%20%30%30%植物油或矿物油，植物油或矿物油，5%5%10%10%聚乙二醇二聚乙二醇二油酸酯，油酸酯，1%1%4%4%多元醇脂肪酸酯与水组成的多元醇脂肪酸酯与水组成的消泡剂，可增强消泡作用；消泡剂，可增强消泡作用；(3)(3)消泡剂乳化增效消泡剂乳化增效：如聚氧丙烯甘油用吐温：如聚氧丙烯甘油用吐温-80-80为乳化剂的增效作用，在庆大霉素和谷氨酸为乳化剂的增效作用，在庆大霉素和谷氨酸发酵方面消泡能力提高发酵方面消泡能力提高1 12 2倍。倍。四、机械消泡四、机械消泡 某些容易产生泡沫的发酵液，当泡沫大量涌某些容易产生泡沫的发酵液，当泡沫大量涌现时，如不及时消除就会影响正常操作。同时，现时，如不及时消除就会影响正常操作。同时，大量泡沫随气流逸出，会造成大量泡沫随气流逸出，会造成发酵液的损失发酵液的损失，也容易引起染菌。也容易引起染菌。采用添加消泡剂的办法要采用添加消泡剂的办法要耗用多种油类或化耗用多种油类或化工原料工原料，同时会使发酵液中，同时会使发酵液中氧的吸收减少氧的吸收减少1/31/31/51/5，对供应微生物的需氧量极为不利。，对供应微生物的需氧量极为不利。机械消泡是一种物理作用机械消泡是一种物理作用机械消泡的优点机械消泡的优点是不用在发酵液中加入其他物质，是不用在发酵液中加入其他物质，节省原料节省原料( (消泡剂消泡剂) )，减少由于加入消泡剂所引减少由于加入消泡剂所引起的污染起的污染机会。但其效果往往不如化学消泡机会。但其效果往往不如化学消泡迅速可靠，需要一定的设备和迅速可靠，需要一定的设备和消耗一定的消耗一定的动力动力。靠机械强烈振动，压力的变化，促使气泡靠机械强烈振动，压力的变化，促使气泡破裂，或借机械力将排出气体中的液体加破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收，所以没有上述缺点。以分离回收，所以没有上述缺点。最大的缺点在于它不能从根本最大的缺点在于它不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素上消除引起稳定泡沫的因素。1.1.机械消泡装置的选择依据机械消泡装置的选择依据理想的机械消泡装置理想的机械消泡装置必须满必须满足以下几个条件：足以下几个条件：(1)(1)动力小；动力小；(2)(2)结构简单；结构简单；(3)(3)坚固耐用；坚固耐用；(4)(4)清扫、杀菌容易；清扫、杀菌容易；(5)(5)维修、保养费用少。维修、保养费用少。机械消泡的方法有多种机械消泡的方法有多种一种是在一种是在发酵罐内发酵罐内将泡沫消除将泡沫消除另一种是将泡沫引出另一种是将泡沫引出发酵罐外发酵罐外，泡沫消除后，泡沫消除后，液体再返发酵罐内。液体再返发酵罐内。罐内消泡罐内消泡可以分耙式消泡桨、旋转圆板式、可以分耙式消泡桨、旋转圆板式、气流吸入式、流体吹入式、冲击反射板式、碟气流吸入式、流体吹入式、冲击反射板式、碟式及超声波的机械消泡等类型；式及超声波的机械消泡等类型；罐外消泡罐外消泡又可分旋转叶片式、喷雾式、离心又可分旋转叶片式、喷雾式、离心力式及转向板式的机械消泡等类型。力式及转向板式的机械消泡等类型。2.2.罐内消泡罐内消泡常用的耙式消泡桨如常用的耙式消泡桨如图图12-112-1所示。所示。(1)(1)耙式消泡桨的机械消泡耙式消泡桨的机械消泡罐内的消泡装置较简单罐内的消泡装置较简单的型式是的型式是耙式消泡桨耙式消泡桨但当产生大量泡沫、上升很快时，耙桨但当产生大量泡沫、上升很快时，耙桨来不及将泡沫打碎，而当泡沫超过耙桨，来不及将泡沫打碎，而当泡沫超过耙桨，就将就将失去消泡作用，此时仍需添加失去消泡作用，此时仍需添加失去消泡作用，此时仍需添加失去消泡作用，此时仍需添加消泡剂。消泡剂。消泡剂。消泡剂。它是装于发酵罐内搅拌它是装于发酵罐内搅拌它是装于发酵罐内搅拌它是装于发酵罐内搅拌轴上，齿面略高于液面轴上，齿面略高于液面轴上，齿面略高于液面轴上，齿面略高于液面当产生当产生少量泡沫少量泡沫少量泡沫少量泡沫时耙齿随时将泡沫打碎时耙齿随时将泡沫打碎所以这种装置的消泡作用并所以这种装置的消泡作用并不完全，只是一种简单的措不完全，只是一种简单的措施而已。消泡桨的直径一般施而已。消泡桨的直径一般取取0.80.9倍罐径，以不妨倍罐径，以不妨碍旋转为原则。碍旋转为原则。(2)(2)旋转圆板式的机械消泡旋转圆板式的机械消泡 这种旋转圆板设置在发酵槽内气这种旋转圆板设置在发酵槽内气相部分与发酵醪的液面平行，相部分与发酵醪的液面平行，见图见图12-212-2。1- 1-马达；马达；2- 2-旋转圆板；旋转圆板；3- 3-槽内液；槽内液；4- 4-发酵槽；发酵槽；5- 5-供液泵供液泵圆板旋转圆板旋转圆板旋转圆板旋转同时将槽内发同时将槽内发酵液注入圆板中央部分，酵液注入圆板中央部分，通过通过离心力离心力离心力离心力将破碎成微将破碎成微小泡沫的微粒散向槽壁，小泡沫的微粒散向槽壁，以达到消泡的目的。以达到消泡的目的。通常通常提高圆盘转速及发提高圆盘转速及发酵液供给率酵液供给率，可以增大，可以增大消泡效果。消泡效果。(3)(3)流体吹入式消泡流体吹入式消泡 这是一种把空气及空气与培养液吹入培养这是一种把空气及空气与培养液吹入培养罐中形式的泡沫层来进行消泡的方法。气体或罐中形式的泡沫层来进行消泡的方法。气体或气液吹入管是以切线方向与槽内侧相接的，气液吹入管是以切线方向与槽内侧相接的，如如图图12-312-3所示。所示。1 1，8-8-供液管；供液管；2 2，9-9-供气管；供气管；3-3-排气管；排气管；4-4-泡沫；泡沫；5-5-排液管；排液管；6 6，10-10-培养槽；培养槽；7-7-空气吸入管空气吸入管这是一种把空气及空气与培养液吹入培养罐中形式的泡沫层来进行消泡的方法。这是一种把空气及空气与培养液吹入培养罐中形式的泡沫层来进行消泡的方法。气体或气液吹入管是以切线方向与气体或气液吹入管是以切线方向与气体或气液吹入管是以切线方向与气体或气液吹入管是以切线方向与槽内侧相接的槽内侧相接的槽内侧相接的槽内侧相接的(4)(4)气体吹入管内吸引消泡气体吹入管内吸引消泡 将发酵槽内形成的气泡群吸引到气体吹入将发酵槽内形成的气泡群吸引到气体吹入管，利用吹入气体流速消泡，如管，利用吹入气体流速消泡，如图图12-412-4所示，所示，在靠近吸入口附近处的气体吸入管内形成增速在靠近吸入口附近处的气体吸入管内形成增速用的喷头，吸入管用来连接液面上部与增速喷用的喷头，吸入管用来连接液面上部与增速喷头的负压部位。头的负压部位。图图12-4 12-4 吸引消泡吸引消泡1- 1-培养槽；培养槽；2- 2-无菌空无菌空气；气；3- 3-空气吹入管；空气吹入管；4- 4-增速喷头；增速喷头；5- 5-吸入吸入管管将发酵槽内形成的气泡群将发酵槽内形成的气泡群吸引到气体吹入管，吸引到气体吹入管，利用利用利用利用吹入气体流速消泡吹入气体流速消泡吹入气体流速消泡吹入气体流速消泡在靠近吸入口附近处的气在靠近吸入口附近处的气体吸入管内体吸入管内形成增速用的形成增速用的形成增速用的形成增速用的喷头喷头喷头喷头，吸入管用来连接液，吸入管用来连接液面上部与增速喷头的负压面上部与增速喷头的负压部位。部位。(5)(5)冲击反射板消泡冲击反射板消泡 这是一种把气体吹入液面上部，然后通过这是一种把气体吹入液面上部，然后通过在液面上部设置的冲击板冲击反射，吹回到液在液面上部设置的冲击板冲击反射，吹回到液面，将液面上产生的泡沫击碎的方法。冲击板面，将液面上产生的泡沫击碎的方法。冲击板为圆锥状，如为圆锥状，如图图12-512-5所示，与槽内之间间隙很所示，与槽内之间间隙很小。小。图图12-5 12-5 冲击反射板式消泡冲击反射板式消泡1- 1-喷嘴；喷嘴；2- 2-气体；气体；3- 3-小孔；小孔；4- 4-冲击板；冲击板；5- 5-气泡；气泡；6- 6-培培养槽；养槽；7- 7-空气空气这是一种把气体吹入液面上部，这是一种把气体吹入液面上部，然后通过在然后通过在液面上部设置的液面上部设置的液面上部设置的液面上部设置的冲击板冲击反射冲击板冲击反射冲击板冲击反射冲击板冲击反射，吹回到液，吹回到液面，将液面上产生的泡沫击面，将液面上产生的泡沫击碎的方法。冲击板为圆锥状，碎的方法。冲击板为圆锥状，如如图图12-512-5所示，与槽内之间所示，与槽内之间间隙很小。间隙很小。(6)(6)超声波消泡超声波消泡 将空气在将空气在1.51.53.0MPa3.0MPa下下1 12L/s2L/s的速度由喷嘴喷入共振室而达到破的速度由喷嘴喷入共振室而达到破泡的目的，这就是超声波消泡的原泡的目的，这就是超声波消泡的原理。理。如图如图12-612-6所示所示图图12-6 12-6 超声波消泡器超声波消泡器 将空气在将空气在1.51.53.0MPa3.0MPa下下1 12L/s2L/s的的速度由喷嘴喷入共速度由喷嘴喷入共速度由喷嘴喷入共速度由喷嘴喷入共振室而达到破泡的目的振室而达到破泡的目的振室而达到破泡的目的振室而达到破泡的目的，这，这就是超声波消泡的原理。就是超声波消泡的原理。喷嘴与共振室之间的间隙可以根据振动喷嘴与共振室之间的间隙可以根据振动次数需要进行调整。次数需要进行调整。这种消泡法只这种消泡法只这种消泡法只这种消泡法只适用于实验室小型发酵试验适用于实验室小型发酵试验适用于实验室小型发酵试验适用于实验室小型发酵试验的消泡的消泡的消泡的消泡，当发酵罐直径大于，当发酵罐直径大于0.3m时，时，消泡效率明显降低，且消泡效率明显降低，且设备费用高设备费用高设备费用高设备费用高，因此不适宜用于大规模工业发酵的消泡。因此不适宜用于大规模工业发酵的消泡。(7)(7)碟片式消泡器的机械消泡碟片式消泡器的机械消泡 碟片式消泡器是一种较碟片式消泡器是一种较为新型的消泡装置，它的为新型的消泡装置，它的结构如结构如图图12-712-7所示，所示，图图12-7 12-7 碟片式消泡器碟片式消泡器1-1-夹套；夹套；2-2-皮带轮传动；皮带轮传动；3-3-马达；马达；4-4-冷却水；冷却水；5-5-轴封；轴封；6-6-空心轴；空心轴；7-7-滚动轴承；滚动轴承；8-8-固定法兰；固定法兰；9-9-碟碟片片将圆锥形的碟片象碟片式离心机一将圆锥形的碟片象碟片式离心机一样迭合在一起，样迭合在一起，装于空心轴上装于空心轴上装于空心轴上装于空心轴上，碟，碟片上具有径向筋条，两碟片之间的片上具有径向筋条，两碟片之间的间隙为空气通道，与空心轴相连通，间隙为空气通道，与空心轴相连通，传动皮带轮位于两滚珠轴承中间，传动皮带轮位于两滚珠轴承中间，空心轴的两端装有端面轴封，以防空心轴的两端装有端面轴封，以防泄漏。泄漏。将将消泡器装于发酵罐罐顶消泡器装于发酵罐罐顶，碟片，碟片位于罐顶的空间内，用固定法兰与排气位于罐顶的空间内，用固定法兰与排气口相连接，当其口相连接，当其高速旋转时，进入高速旋转时，进入高速旋转时，进入高速旋转时，进入碟片间的空气中的气泡被打碎碟片间的空气中的气泡被打碎碟片间的空气中的气泡被打碎碟片间的空气中的气泡被打碎同时将液滴甩出，返回发酵液同时将液滴甩出，返回发酵液同时将液滴甩出，返回发酵液同时将液滴甩出，返回发酵液中中中中，被分离后的气体由空心轴径排气口，被分离后的气体由空心轴径排气口排出。排出。 与上述各种消泡器比较，与上述各种消泡器比较，这种型式的消泡器效果较好，这种型式的消泡器效果较好，缺点是结构复杂、加工麻烦、缺点是结构复杂、加工麻烦、消耗功率大。消耗功率大。3.3.罐外消泡罐外消泡旋转叶片罐外消泡旋转叶片罐外消泡喷雾消泡喷雾消泡离心力消泡离心力消泡旋风分离器消泡旋风分离器消泡转向板消泡转向板消泡(1)(1)旋转叶片罐外消泡旋转叶片罐外消泡这是一种最简单的罐外机械消泡装置，这是一种最简单的罐外机械消泡装置，如图如图12-812-8所示。所示。将泡沫引出罐外，罐外消泡装置的旋转叶片是由将泡沫引出罐外，罐外消泡装置的旋转叶片是由马达带动，利用马达带动，利用施转叶片所产生的冲施转叶片所产生的冲击力和剪切力进行消泡，消泡后，击力和剪切力进行消泡，消泡后，液体再回流至液体再回流至发酵罐内。发酵罐内。图图12-8 12-8 旋转叶片罐外消泡旋转叶片罐外消泡施转叶片所产生的冲击力和剪切力施转叶片所产生的冲击力和剪切力进行消泡，消泡后，液体再回流至进行消泡，消泡后，液体再回流至发酵罐内发酵罐内(2)(2)喷雾消泡喷雾消泡这是一种这是一种利用冲击力、压缩力及剪切力利用冲击力、压缩力及剪切力的消泡方法。这种消泡方法广泛应用于废水处的消泡方法。这种消泡方法广泛应用于废水处理曝气槽的消泡中。理曝气槽的消泡中。将水及培养液等液体通过将水及培养液等液体通过适当适当喷雾器喷出喷雾器喷出来达到消来达到消泡的目的泡的目的(3)(3)离心力消泡离心力消泡这是一种将泡沫注入用网眼及筛目较这是一种将泡沫注入用网眼及筛目较大的筛子做成的筐中，通过大的筛子做成的筐中，通过旋转产旋转产生的离心力将泡沫分散生的离心力将泡沫分散，从而达到，从而达到消泡的方法消泡的方法( (见图见图12-9)12-9)。图图12-9 12-9 旋转筐消泡旋转筐消泡旋转筐直径为旋转筐直径为10cm，高，高10cm，转速，转速3800r/min，消泡能力为，消泡能力为24L/min，据报，据报道，道，经这种方法消泡后还可能有泡经这种方法消泡后还可能有泡沫存在。沫存在。图图12-10 12-10 旋转圆板消泡旋转圆板消泡如果将泡沫灌注在转速为如果将泡沫灌注在转速为2500r/min以上的以上的旋转圆盘旋转圆盘上上，那么不管泡沫的供给速度或，那么不管泡沫的供给速度或其性质怎么样都可达到充分消泡其性质怎么样都可达到充分消泡的目的。的目的。(见图见图12-10)。(4)(4)旋风分离器消泡旋风分离器消泡 这是一种利用带这是一种利用带舌盘舌盘( (见见图图12-1112-11) )的旋风分离器的脱的旋风分离器的脱泡器进行消泡的方法。泡器进行消泡的方法。1-培养槽；培养槽；2-培养液；培养液；3-泡沫；泡沫；4-排气管；排气管；5-旋风分离器破泡液；旋风分离器破泡液；6-排气管；排气管；7-旋风分离器；旋风分离器；8-排气管；排气管；9-脱泡器；脱泡器；10-舌盘；舌盘；11-供气管；供气管；12-环流液管；环流液管；13-供气管供气管图图12-11 12-11 旋风分离器消泡旋风分离器消泡发酵槽内产生的泡沫由旋风分离器上部通入脱泡器，发酵槽内产生的泡沫由旋风分离器上部通入脱泡器，并与脱泡器下方引入气体逆向接触使其破碎。并与脱泡器下方引入气体逆向接触使其破碎。特点特点:泡沫通过旋风分离器等破碎以后，再将泡沫通过旋风分离器等破碎以后，再将带微小泡沫的液体导入装有充填物的脱泡器中，带微小泡沫的液体导入装有充填物的脱泡器中，以增大液体表面积，然后，从脱泡器下方吹入以增大液体表面积，然后，从脱泡器下方吹入气体，使其与流下的液体逆向接触进行彻底的气体，使其与流下的液体逆向接触进行彻底的脱泡。脱泡。(5)(5)转向板消泡转向板消泡图图12-1212-12是一种转向板式消泡装置。是一种转向板式消泡装置。1- 1-泵；泵；2- 2-缓冲液；缓冲液；3- 3-排气；排气；4- 4-喷头喷头在这种装置中泡沫以在这种装置中泡沫以3090m/s的速度由的速度由喷头喷向转向板使泡沫破碎，分离液用泵喷头喷向转向板使泡沫破碎，分离液用泵送回槽内，而气体则排出消泡器外。送回槽内，而气体则排出消泡器外。由于转向板是作为电动测泡装置起作用的，所以由于转向板是作为电动测泡装置起作用的，所以只有在只有在发泡旺盛时才能使泵启动发泡旺盛时才能使泵启动，泵启，泵启动后，此时转向板并非必需，动后，此时转向板并非必需，仅用喷头就仅用喷头就可起破泡作用可起破泡作用。转向板在分离泡液时是需。转向板在分离泡液时是需要的，如用特氟隆作转向板，可防止用其他材要的，如用特氟隆作转向板，可防止用其他材料制作时因冲击产生泡沫的现象。根据发酵槽料制作时因冲击产生泡沫的现象。根据发酵槽容积和通风量不同，喷头大小也随时转换。容积和通风量不同，喷头大小也随时转换。这种消泡装置的优点是设这种消泡装置的优点是设备简单，没有转动部件，备简单，没有转动部件，可利用一部分通风能量，可利用一部分通风能量，因此运转费用较低因此运转费用较低。第七节第七节 补料的控制补料的控制近年来发酵产量有了很大近年来发酵产量有了很大提高提高一方面是由于一方面是由于高产菌株高产菌株的不断更新的不断更新另一方面则是另一方面则是发酵工艺和设备条件发酵工艺和设备条件的相继的相继改进。改进。其中其中补料通氨工艺补料通氨工艺的采用，对发酵单位的提的采用，对发酵单位的提高起了重要作用。高起了重要作用。这种中间控制的明显效果是产生菌的这种中间控制的明显效果是产生菌的自溶期被推迟自溶期被推迟，生物合成期得生物合成期得到延长到延长，可维持较高的产物增长幅，可维持较高的产物增长幅度和增加发酵的总体积，从而使产量度和增加发酵的总体积，从而使产量大幅度上升。大幅度上升。例如：例如：在实验罐内四环素发酵在实验罐内四环素发酵不补糖不补糖的批号，培的批号，培养养727296h96h，发酵单位在，发酵单位在5500550070007000单位单位/ /mLmL之之间间补糖补糖的批号，发酵周期延长到的批号，发酵周期延长到120120130h130h，单位提高到单位提高到10000100001200012000单位单位/ /mLmL。又如又如: :有些品种采用有些品种采用通氨工艺通氨工艺后，在其他后，在其他条件配合下，发酵单位能提高条件配合下，发酵单位能提高50%50%左右。左右。目前大部分发酵品种如目前大部分发酵品种如谷氨酸、赖氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酶制剂、有机酸、抗生素酶制剂、有机酸、抗生素等均采用补等均采用补料措施。在工业生产上，补料还经常作料措施。在工业生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。为纠正异常发酵的一个重要手段。一、补料的内容一、补料的内容 所谓所谓补料补料，顾名思义是在发酵过顾名思义是在发酵过程中补充某些养料以维持菌的生理程中补充某些养料以维持菌的生理代谢活动和合成的需要。代谢活动和合成的需要。补料的内容大致可分为以补料的内容大致可分为以下下四个方面四个方面 1. 1.补充微生物能源和碳源补充微生物能源和碳源，如在发酵，如在发酵液中添加葡萄糖、饴糖、液化淀粉。作为消沫剂的天液中添加葡萄糖、饴糖、液化淀粉。作为消沫剂的天然油脂，同时也起了补充碳源的作用。然油脂，同时也起了补充碳源的作用。2. 2.补充菌体所需要的氮源补充菌体所需要的氮源，如在发酵过，如在发酵过程添加蛋白胨、豆饼粉、花生饼、玉米浆、酵母粉和程添加蛋白胨、豆饼粉、花生饼、玉米浆、酵母粉和尿素等有机氮源。有的发酵品种还采用通入氨气或添尿素等有机氮源。有的发酵品种还采用通入氨气或添加氨水。以上这些碳源，由于它本身和代谢后的酸碱加氨水。以上这些碳源，由于它本身和代谢后的酸碱度也可用于控制发酵的合适的度也可用于控制发酵的合适的PHPH值范围。值范围。3. 3.加入某些微生物生长或合成加入某些微生物生长或合成需要的微量的需要的微量的元素或无机盐元素或无机盐，如磷酸盐、硫酸盐、氯化钴，如磷酸盐、硫酸盐、氯化钴等。等。4. 4.对于产诱导酶的微生物，在补料中适当加入该对于产诱导酶的微生物，在补料中适当加入该酶的酶的作用底物作用底物，是提高酶产量的重要措施。，是提高酶产量的重要措施。二、补料的原则二、补料的原则这里就涉及菌体的这里就涉及菌体的代谢调节问题代谢调节问题。菌体的生理调节活动和生物合成，菌体的生理调节活动和生物合成，除了决定于本身的除了决定于本身的遗传特性遗传特性外，外，还决定于外界的还决定于外界的环境条件环境条件早期的发酵生产是采用一次投早期的发酵生产是采用一次投料发酵，到放罐结束料发酵，到放罐结束其中一个重要的条件就是其中一个重要的条件就是培养培养基的组成和浓度基的组成和浓度若在若在菌体的生长阶段菌体的生长阶段，有过于丰富的碳源，有过于丰富的碳源和氮源以及适合的生长条件，就会使菌体向和氮源以及适合的生长条件，就会使菌体向着大量繁殖菌丝的方向发展，使得养料主要着大量繁殖菌丝的方向发展，使得养料主要消耗在菌丝生长上；消耗在菌丝生长上；而在而在生物合成阶段养料生物合成阶段养料便不足以维持正便不足以维持正常生理代谢和合成的需要，导致菌丝过早地常生理代谢和合成的需要，导致菌丝过早地自溶，使生物合成阶段缩短。自溶，使生物合成阶段缩短。 在补料工艺采用之前，工业生产的发酵周在补料工艺采用之前，工业生产的发酵周期一般只维持期一般只维持2 25d5d，采用补料工艺后，发酵，采用补料工艺后，发酵周期都周期都相应延长相应延长 在现代发酵工业的大规模生产中，在现代发酵工业的大规模生产中，中间补中间补料的数量为基础料的料的数量为基础料的1-3倍倍。如果把所补加料全部合并在基础培养基内，对发酵如果把所补加料全部合并在基础培养基内，对发酵的培养将难于设想，这势必造成菌体代谢的紊乱而的培养将难于设想，这势必造成菌体代谢的紊乱而失去控制，也可能因培养基浓度太高，影响细胞内失去控制，也可能因培养基浓度太高，影响细胞内渗透压而无法生长。渗透压而无法生长。因此，补料的原则就在于控制因此，补料的原则就在于控制微生物的微生物的中间代谢中间代谢，使之向着，使之向着有利于产物积累的方向发展有利于产物积累的方向发展为此，要根据菌体的为此，要根据菌体的生长代谢、生物合生长代谢、生物合成规律成规律，利用中间补料的措施给予产生菌适，利用中间补料的措施给予产生菌适当的调节，让它在生物合成阶段有足够而又不过当的调节，让它在生物合成阶段有足够而又不过多的养料供给其合成和维持正常代谢的需要。多的养料供给其合成和维持正常代谢的需要。 鉴于我们对微生物的代谢规律尚未充分掌握，鉴于我们对微生物的代谢规律尚未充分掌握，现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的。三、补糖的控制三、补糖的控制 在确定补料的内容后，选择适在确定补料的内容后，选择适当的时机是相当重要的。当的时机是相当重要的。以四环素以四环素发酵中间加葡萄糖为例，发酵中间加葡萄糖为例，图图12-13a12-13a和和b b表示三表示三种不同的开始加糖时间的效果。种不同的开始加糖时间的效果。可见，补糖时间对发酵的产量有很可见，补糖时间对发酵的产量有很大的影响，过早加糖，有可能刺激大的影响，过早加糖，有可能刺激菌丝的生长，从而加速糖的利用，菌丝的生长，从而加速糖的利用，在相同糖耗情况下，单位就明显低在相同糖耗情况下，单位就明显低于加糖时间适当的批号。于加糖时间适当的批号。补糖的时机不能单纯以补糖的时机不能单纯以培养时间培养时间作为依据作为依据还要根据基础培养基中的还要根据基础培养基中的碳源种类、用量碳源种类、用量和消耗速度、前期发酵条件、菌和消耗速度、前期发酵条件、菌种特性和种子质量种特性和种子质量等因素判断。等因素判断。因此，根据代谢变化如残糖含量、因此，根据代谢变化如残糖含量、PHPH值或菌丝形值或菌丝形态来考虑，比较切合实际。态来考虑，比较切合实际。在确定补糖开始时间后，补糖在确定补糖开始时间后，补糖的方式和控制指标也有讲究的方式和控制指标也有讲究如如在四环素发酵过程中，若以还原糖的水平作在四环素发酵过程中，若以还原糖的水平作为指标，则不同阶段还原糖控制在不同的水平为指标，则不同阶段还原糖控制在不同的水平上，补糖效果也两样。一般在加糖后开始的阶上，补糖效果也两样。一般在加糖后开始的阶段，如能维持较高浓度的还原糖含量，对生物段，如能维持较高浓度的还原糖含量，对生物合成有利；但高浓度还原糖含量不宜维持过久，合成有利；但高浓度还原糖含量不宜维持过久，否则会导致菌丝大量繁殖，影响单位增加。否则会导致菌丝大量繁殖，影响单位增加。补糖方法控制不好，便收不到应有的效果补糖方法控制不好，便收不到应有的效果 还原糖维持的水平因具体情况而略还原糖维持的水平因具体情况而略有差异，似乎维持在有差异，似乎维持在0.8%0.8%1.5%1.5%较为适较为适合。合。图图12-1412-14和图和图12-1512-15是维持在不同还是维持在不同还原糖水平的四环素发酵加糖的作用，显原糖水平的四环素发酵加糖的作用，显然，还原糖维持在然，还原糖维持在0.8%0.8%1.2%1.2%对四环素对四环素合成有利。合成有利。 实验表明实验表明，如在最适的补加葡，如在最适的补加葡萄糖的条件下，能正确控制萄糖的条件下，能正确控制菌丝量的菌丝量的增加、糖的消耗与发酵单位增长增加、糖的消耗与发酵单位增长三者三者之间的关系，就可获得比采用丰富培之间的关系，就可获得比采用丰富培养基时更长的生物合成期。养基时更长的生物合成期。除了还原糖作为控制指标外，除了还原糖作为控制指标外，也有以也有以总糖总糖作为指标。作为指标。如土霉素发酵补充原则，前期少量多次，控制如土霉素发酵补充原则，前期少量多次，控制总糖总糖5%5%6%6%；中期保持半饥饿状态，残糖控；中期保持半饥饿状态，残糖控制在制在4%4%5%5%；后期，残糖在；后期，残糖在3%3%4%4%；放罐在；放罐在2%2%左右。左右。 有的发酵控制，还须有的发酵控制，还须参考糖的耗用速度、参考糖的耗用速度、PHPH值变化、菌丝发育情况、用油多少、值变化、菌丝发育情况、用油多少、发酵液粘度、罐内实际体积发酵液粘度、罐内实际体积等参数。等参数。补糖的方式一般都以补糖的方式一般都以间歇定间歇定时加入时加入为主，但近年来也开为主，但近年来也开始注意用始注意用定时连续滴加定时连续滴加的方的方式补进所需要的养料。式补进所需要的养料。连续滴加，比分批加入控连续滴加，比分批加入控制效果更好制效果更好有时会出现一次补料过多，十几小时不增加单位的现有时会出现一次补料过多，十几小时不增加单位的现象，这可能是由于环境的突然变化，对象，这可能是由于环境的突然变化，对菌体来菌体来说需要一个更新适应的过程说需要一个更新适应的过程。这种。这种突然改变有时还可能导致合成方向的改变，使单位突然改变有时还可能导致合成方向的改变，使单位受到影响。为了便于连续滴加，有的工厂采用简单受到影响。为了便于连续滴加，有的工厂采用简单的滴加装置，可计算滴加速率和加入的总量。的滴加装置，可计算滴加速率和加入的总量。这可以避免一次大量加入而引起菌体的代谢这可以避免一次大量加入而引起菌体的代谢受到受到环境突然改变环境突然改变的影响的影响四、补充氮源及无机盐四、补充氮源及无机盐主要起着补充菌体的主要起着补充菌体的无机氮源和调节无机氮源和调节PHPH值值得得作用。作用。通氨时要通氨时要掌握细流，注意泡沫掌握细流，注意泡沫情况。为了情况。为了避免一次加入过多，造成局部过碱，也有把氨水管避免一次加入过多，造成局部过碱，也有把氨水管道接到空气分管内，藉气流带入，可迅速与培养液道接到空气分管内，藉气流带入，可迅速与培养液混合均匀。混合均匀。通氨通氨是某些发酵生产外补料工艺中是某些发酵生产外补料工艺中的有效措施的有效措施有些工厂根据发酵代谢的具体情况，中间添加某有些工厂根据发酵代谢的具体情况，中间添加某些具有些具有调节生长代谢作用的物调节生长代谢作用的物料料，如磷酸盐、尿素、硝酸盐、，如磷酸盐、尿素、硝酸盐、NaSONaSO4 4、酵、酵母粉或玉米浆等。母粉或玉米浆等。如遇如遇生长迟慢、耗糖低，习惯补生长迟慢、耗糖低，习惯补充适量的磷酸盐充适量的磷酸盐，以促进糖的作用，但，以促进糖的作用，但需注意培养时间和空气流量的配合。需注意培养时间和空气流量的配合。又如土霉素发酵前期又如土霉素发酵前期补补2-3次酵母粉次酵母粉，结，结果放罐单位比对照组高出约果放罐单位比对照组高出约1500u/mL1500u/mL。又如，青霉素发酵不正常时，菌丝展不开，成葫又如，青霉素发酵不正常时，菌丝展不开，成葫芦状，糖不被利用，这时芦状，糖不被利用，这时添加尿素添加尿素水溶液有水溶液有一定好处。一定好处。 总之，补料工艺是总之，补料工艺是控制中间代谢控制中间代谢的较为灵活的措施的较为灵活的措施。不同微生物的品。不同微生物的品种或者同一个品种而菌种或培养条件不种或者同一个品种而菌种或培养条件不同，控制方法也略有差异，不能照搬套同，控制方法也略有差异，不能照搬套用，用，需要根据具体情况，通过实需要根据具体情况，通过实践确定最适的控制方法。践确定最适的控制方法。在补料中应注意以下几个在补料中应注意以下几个问题问题料液配比要适合料液配比要适合，过浓会影响到消毒及料液，过浓会影响到消毒及料液的输送，过稀则料液体积增大，而带来一系列问题的输送，过稀则料液体积增大，而带来一系列问题如发酵单位稀释、液面上升、加油量增加等；如发酵单位稀释、液面上升、加油量增加等；由于经常性添加物料，应注意由于经常性添加物料，应注意加强无菌控制加强无菌控制，对设备和操作都须从严掌握；对设备和操作都须从严掌握；此外应考虑此外应考虑经济核算，节约粮食经济核算，节约粮食，注意培，注意培养基的碳氮平衡等。养基的碳氮平衡等。