昆虫滞育及其调控昆虫滞育及其调控董小林董小林Mobile：QQ：78465837Office：3-203第一节 滞育的概念在自然生态体系中，空间和时问是可变的，温度、湿度、光照、食物群体大小及相互关系等因素是在空间中不断变化。昆虫在这样的环境中反复面临着不利于发育及不适合繁殖的时间历期等问题，为了渡过这种不适合生存的空间和时间，昆虫已进化到了具有巧妙的生活习性和生理反应的适应。其中重要的策略之一就是滞育(Diapause)滞育研究的历史已经有一个多世纪了滞育是一种不能发育的生理状态，它能使有机体在不利的一个时期内更容易生存。当有机体进入滞育时，它一定是在其确定的时期内保持滞育状态而不管周围环境条件的变化。Lavemezu等(1986)将滞育描写为当昆虫面临极其恶劣或不利的环境时，通过遗传手段所采取的一种预定的生存策略将前者的定义作了进一步的补充和完善因为滞育是可遗传的第二节 滞育发育昆虫进入滞育时，体内发生一系列的生理、生化以及结构等变化来适应特殊的发育过程，即滞育发育这些变化涉及到昆虫各级调控机制的变化，且因虫种的不同而异。但其主要的、共同的特点如下：1呼吸量徽弱2体内含水量降低，干重增加3对低温的抵抗力增强，降低了对环境温度的过冷却点（冬天滞育。夏天滞育的昆虫正好相反）4.生殖器官发育不完全5.体内各种激素以及它所引起的代谢机制发生变化近五十年来，对昆虫滞育研究的范围广，领域深圳，所涉及的研究种类也很多。从温湿度、光照、食料等外部环境因素的研究到体内感受器、生理钟及神经内分泌系统：从外部行为特点的变化到内部复杂综合的作。从田问实验的观察、虫体内部的解剖到虫体的结扎。及器官组织的摘除和培养逐步发展到放射免疫和色谱等研究。随着生化技术和分子生物学的发展，昆虫滞育的研究也向前迈进。第三节 外界环境对滞育的影响在许多种昆虫中，光周期是诱导、维持和终止滞育的主要因素。而温湿度与食料只是起着辅助和伴随作用。一般而言，光周期是引起滞育的最有力的环境刺激，我们在亚洲玉米螟中也获得了直接的证据。在冬滞育昆虫中，通常日照逐渐缩短，温度逐渐降低是诱导滞育的主要因素，而夏滞育昆虫则相反。光周期之所以诱导许多昆虫发生滞育，因为光周期的年变化比温度的年变化更有规律性，它的年变化是逐日地，有规律地增加或减少的而温度的年变化是波动地增加或下降的由于昆虫种类广，变化大。因此，它们对环境的适应方式不尽相同。在某些种类中，温湿度和食料也起着主导作用，如棉红铃虫是由湿度引起滞育，低温也能使棉铃虫滞育。第四节 昆虫对外界环境的感受机理 昆虫是如何接受外界环境信息的？或者说，它是通过什么途径来接受光刺激呢？研究表明许多昆虫并非通进单眼和复眼，而是通过脑中枢直接感受外界光照刺激。昆虫脑对光周期的反应包括四个部分：1)感受器：将得到的信息转移到系统中2)光周期生理钟：测量光信号的持续时间，划分光暗周期为长日照或短日照3)光周期计算器：在个体发生的敏感期阶段，储存和计算光周期4)在固定的时间里，接受的信息转移到效应系统；效应系统根据激素产生的置决定光周期的反应以及发育方式(滞育或非滞育)第五节 昆虫滞育的类型及调控1、卵滞育的调控对昆虫卵滞育研究和了解最多的是家蚕。1952年Fukuda和Hasegwa曾通过器官移植实验发现滞育型的蛹和成虫中，咽下神经节(SG)分泌滞育激素(DH)而在非滞育型昆虫中SG是不活动的。之后发现，活动的SG较之不括动的SG具有更多的神经分泌细胞和更大的细胞质颗粒，从蛹到成虫的发育过程及滞育卵的诱导过程是通过DH调控的，DH又通过SG合成和释放。目前，对家蚕卵滞育的研究主要集中在体内生理生化的代谢、DH的作用方式以及分子生物学方面的研究。家蚕从蛹到成虫的发育时期，DH的分泌引起卵巢中糖原的增加以及脂肪体糖原及血淋巴海藻糖的降低。这是由靶器官-卵巢的反馈作用实现的。通过体外实验发现，Ca2+对于DH村澈海藻糖酵的活性是必需的，从而引起海藻糖进入卵巢。在卵巢发育的过程中，海藻糖在糖原台戚中起着重要的作用。DH是对特定阶段的滤泡细胞发生作用滤泡细胞膜上具有DH受体，与DH结合后，通过cGMP引起膜上海藻糖酶的活化，使血淋巴中海藻糖转化为葡萄糖。后者经载体运送到细胞质中形成糖原。2、幼虫与蛹滞育的调控幼虫和蛹滞育的昆虫在滞育前的幼虫阶段具有对光特别敏感的反应，在此期间的这种敏感性，敏感期昆虫在敏感期内积累和储存环境信息。不同的昆虫具有不同的敏感期，根据Saunders(1982)的统计，已搞清楚了15个目的328种昆虫的敏感期。幼虫与蛹滞育主要是通过蜕皮激素的暂时下降来实现的过去一直认为，昆虫的滞育是脑神经内分泌系统失去活性而引起激素缺乏来实现的，但许多研究已证实昆虫的滞育并非是激素缺乏的结果。如Beck(1968)曾在欧洲玉米螟的研究中发现，滞育幼虫具有活动的脑神经分泌系统，西南玉米杆草螟的滞育幼虫中具有较高的JH滴度。这使得人们对滞育的调节概念发生了变化。大多数昆虫促前胸腺激素（PTTH）的缺乏是导致幼虫和蛹滞育的关键PTTH的缺乏进一步抑制前胸腺合成和释放蜕皮激素脑-咽侧体-前胸腺被认为是控制滞育的功能单位。通过对滞育幼虫和滞育蛹蜕皮激素的测定发现，在整个滞育期间有一个很低的蜕皮激素滴度，将蜕皮激素类似物注射到滞育虫志后，刚昆虫停止滞育，开始发育正。可见，在许多昆虫中，蜕皮激素的有无对滞育的发生起着直接的、关键的作用。由于昆虫种类繁多，滞育所涉及的激素调控机制也不尽相同。主要有两种途径调节PTTH和蜕皮激素的滴度。一类是一些幼虫的滞育，如西南玉米杆草螟，二化螟等昆虫由脑中枢神经分泌细胞产生促咽侧体激素(AT)，AT引起咽侧体分泌保幼激素(JH)。JH的存在抑制脑神经分泌PTTH的合成，从而抑制前胸腺产生蜕皮激素，引起滞育。另一类是在大多数蛹和一些幼虫滞育的昆虫中，昆虫脑神经分泌细胞在接受外界环境刺激以后直接合成PTTH。但不释放到血淋巴中，抑制前胸腺产生蜕皮激素，而与JH无关。昆虫滞育期同体内小分子代谢物质如多元酚，包括甘油，山梨醇，甘露醇，核糖醇，赤藓糖醇等和一些糖类，包括海藻糖、蔗糖、果糖、葡萄糖等的变化对滞育的影响很大，称之为防寒物。多元酚作为防寒物的有力因素是因为它们溶于水，不影响酶和代谢过程，可自由地穿过膜。此外，它们可以稳定蛋白质的自然状态，阻止蛋白质在低温或冰冻时变性。一些幼虫和成虫的脂肪体和（或）血淋巴中有一种或几种蛋白质，在滞育昆虫中保持着较高的浓度，且随着滞育的终止而逐渐消逝。它被认为与滞育的发生有关称为滞育关联蛋白(DAP)，而在非滞育昆虫中无此蛋白。3，成虫滞育的调控机制成虫滞育的明显特点是行为、生殖和代谢发生变化。表现在飞行肌不发达，体表颜色变浅或有钻地行为，无变配和产卵能力及体内激素等方面以变化。在滞育方面研究比较多的成虫是马铃薯甲虫。与幼虫和蛹滞育不同，JH的缺乏是成虫滞育的主要因素，咽侧体（CA）控制其滞育和生殖。deWllde和deBoer（1961）曾发现咽侧体的切除相当于短日照光周期对滞育的诱导。如将无咽侧体的昆虫重新移入咽侧体或注射JH，滞育能够立即停止。短日照光周期诱导的滞育涉及到更多腺体的综合调控。虽然JH是主要目素，但它是各级水平综合反应的结果。成虫滞育期间JH的缺乏主要是抑制胚胎时卵的发生，而JH与卵黄原蛋白的沉积有关。另外的一些研究发现，JH控制成虫滞育的概念是不完全的。Adams和Filipi(1988)在双翅目成虫的研究中发现卵黄原蛋白的滴度水平是由JH和20-羟基蜕皮酮共同影响的。JH可能对于卵巢分泌蜕皮激素有作用，同时，蜕皮激素对于双翅目成虫的发育也是重要的。目前，昆虫滞育和发育研究的热点是脑激素神经肽除已经介绍的昆虫DH和PTTH外，还有促咽侧体澈素(AT)，脑内不仅有促进咽一体合底和分泌的神经肽，还具有JH抑制神经肽可抑制咽侧体合成和分泌JH。1，保幼激素（JH）对幼虫和成虫滞育的调节幼虫滞育是由于幼虫期保幼激素（JH）分泌过多，妨碍了昆虫进一步发育造成的；成虫滞育则是由于JH缺乏，阻碍了卵巢的发育而造成的（Nijhout,1994）。这两种理论基于JH在两个不同发育时期的两种基本功能，适用于一些昆虫的滞育。但最近的研究却得出了一些相反的结果。例如，对于幼虫滞育，钻竹虫进入幼虫滞育后，JH的含量不但没有明显升高，而且对滞育状态的幼虫注射JH类似物还能解除它的滞育，进一步发育成蛹（Singtripopetal.,2000）。第六节 昆虫滞育的种类和相应的激素调节机制对于成虫滞育，某些体内只能产生低水平JH的黑腹果蝇突变体仍能有效地进行卵黄蛋白的沉积，不会进入成虫滞育状态，而蜕皮激素却对卵黄沉积却起到更主要的作用（Gilbertetal.,1998）。因为幼虫和成虫都是昆虫活动的活跃时期，这两个时期的滞育比较容易受到环境因素的影响，它们的滞育程度往往都不深，所以起决定性的因素在不同昆虫中差异可能会比较大。2，PTTH-蜕皮激素对蛹滞育的调节蛹滞育的直接成因在不同种类昆虫中比较统一，那就是体内的蜕皮激素缺乏。蛹滞育决定期在幼虫期，幼虫期光照不足，会导致蛹期脑缺乏促前胸腺激素（PTTH），使得前胸腺产生的蜕皮激素（20-E）减少，不能进一步发育，于是形成了蛹滞育。PTTH刺激前胸腺的活性在很早就被确认，其功能在烟草天蛾中得到了系统的研究，而且在生理学水平上研究了PTTH、前胸腺和滞育的关系。但由于技术上的限制，烟草天蛾PTTH序列在很长一段时间都是未知的。PTTH最先在家蚕中被纯化克隆。大肠杆菌表达出来的烟草天蛾PTTH能刺激前胸腺分泌蜕皮激素，而且把表达的PTTH注射入滞育的Manduca能有效地解除其蛹滞育（Gilbertetal.,2000，Shionoyaetal.,2003）。这些结果都有力地支持了PTTH-蜕皮激素途径调节蛹滞育的理论。3，滞育激素对卵滞育的调节对于卵滞育机理的研究主要集中在家蚕。对于二化性家蚕，上一代卵的发育受到高温（25oC）和长光照（12h）刺激，发育到蛹期3.5天时，它的SG会产生大量的滞育激素（diapausehormone,DH），分泌到血淋巴中，作用于卵巢，导致卵的糖醇类碳水化合物含量明显升高，产下的卵为滞育卵（Yamashita,1996）。反之，在低温（15oC）和长光照（10h）的条件下的卵发育到蛹期时咽下神经节分泌的DH比较少，卵内的碳水化合物含量低，卵能正常发育（吕鸿声等，1991；Yamashita,1996）。4，昆虫滞育激素-性信息素合成激活肽（DH-PBAN）的基因结构和功能滞育激素首先在家蚕中被纯化测序，它含有24个氨基酸。随后，家蚕的DHcDNA也被克隆得到，发现它编码的194个氨基酸前体肽还包括一个已知神经肽、性信息素合成激活肽（PBAN）和三个新神经肽，并命名为SG神经肽-,（suboesophadealganglionneuropeptide,SGNP）。PBAN能刺激性腺分泌性信息素。它们都同时具有诱导卵滞育和刺激性腺分泌性信息素的功能。家蚕DH-PBAN基因序列包含五个内含子和六个外显子，它在基因组内是单拷贝。DH-PBANcDNA在鳞翅目中广泛存在，先后在玉米夜蛾、烟青虫、小地老虎、海灰翅夜蛾、烟芽夜蛾等昆虫中被克隆，它们的基因结构都很相似。家蚕和玉米夜蛾的免疫组化和原位杂交的结果表明，鳞翅目昆虫的DH-PBAN的mRNA和神经肽主要特异性地在咽下神经节(SG)的十多个神经分泌细胞中表达，在胸神经节和腹神经节中也有少量的表达。以家蚕为例，家蚕DH对卵巢的主要作用过程是：SG分泌DH，释放到血淋巴中，然后与卵巢膜上的受体结合，使得卵巢内的cGMP水平下降，从而激活了海藻糖酶的活性。海藻糖酶把血淋巴中的海藻糖分解成葡萄糖，葡萄糖再进一步转化成糖原,这是滞育的诱发过程。糖原在糖原磷酸化酶的作用下分解产生山梨醇和甘油，这是滞育的开始。山梨醇在山梨醇脱氢酶的作用下还原成果糖，果糖再进一步转化成糖原，这是滞育的结束。PBAN刺激性腺,使胞内钙离子和cAMP含量升高，而DH能降低卵巢膜胞内cGMP含量，这两个神经肽的信号传导的研究结果有些不一致。最近，在果蝇基因组中发现了一个能被神经肽激活的受体，根据类似受体在不同物种间的同源性，克隆得到了美洲棉铃虫的同源受体，并证明了它能被PBAN有效地激活，所以推测它就是PBAN受体。该类神经肽具体的信号转导机理还有待进一步研究。昆虫的结构与形态的微观机理；显微技术显微技术显微技术显微技术昆虫的行为昆虫的行为昆虫的行为昆虫的行为生理生理生理生理生物技术生物技术生物技术生物技术昆虫对外界的反应的生理生化机制；昆虫的遗传机理，并借助现代生现代生物技术手段物技术手段研究特定昆虫的某方面结构及特点。第七节 昆虫滞育的研究方法中华通草岭在自然界以成虫进行兼性滞育越冬，通过解剖其卵巢，观察颜色来判断是否滞育。卵巢无色透明(完全滞育型）卵巢黄绿色,端部呈乳白色（非滞育型）例子1置于恒温箱中,然后放于呼吸瓶中,用GH-305型红外线CO2测定仪测定成虫的呼吸量。图1 G H-305型红外线CO2测定仪一、呼吸强度的测定 仪器和器和试剂：美国 waters 600 液相色谱仪。JH标准样品为美国Sigma公司产品,甲醇、正乙烷为分析纯,重蒸后使用。 样品制品制备:取羽化后的非滞育成虫,置于玻璃匀浆器中,加入1ml重蒸甲醇匀浆,用甲醇冲冼研磨棒及研磨器,再加入重蒸正乙烷,封口后放在0-4冰箱中;吸取上层正乙烷提取液,再用正乙烷重复提取两次,合并三次正乙烷提取液,氮气吹干后用色谱纯甲醇定容,作液相色谱分析用。二、激素的测定色色谱条件条件:SPherC18柱,流动相为甲醇:水=75:25,流速0.5ml/min,检测波长=220nm,进样量20ul,以峰高定量。图2 美国waters公司600E型高效液相色谱仪例子2研究温度对多异瓢虫产卵前期的影响,总结了滞育与非滞育雌虫解剖形态学差异。在长光照14L: 10D条件下, 高温可加速卵巢发育,缩短产卵前期,低温则相反。滞育雌虫卵巢的解剖、卵黄原蛋白的沉积等。外因上：利用引起滞育的相反条件。内因上：利用激素调控。 引起和解除昆虫滞育的生态环境条件都是外因，必须通过内因才起作用；引起和解除昆虫滞育的内因是激素。第八节 打破昆虫滞育的常用方法光周期、温度和湿度是解除滞育的重要因子。进入滞育的昆虫需经过一段时期的滞育代谢后，才能解除滞育，恢复活动。例如：多数冬季滞育昆虫若经过一定的温度处理就能解除滞育；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis )、三化螟(walker)等滞育幼虫需补充一定的水分才能解除滞昆虫育；一些蟋蟀(Gryllus)和一些脉翅目昆虫当春天光照时数超过临界光周期时才能解除滞育。图3亚洲玉米螟幼虫（Ostrinia furnacalis larva） 一种七星瓢虫(Coccinella septempunctata)滞育诱导及滞育解除方法，步骤如下：（1）将七星瓢虫的成虫置于温度18、光周期L10：D14的条件下进行诱导，使所述七星瓢虫进入滞育态。（2）将步骤（1）滞育后的所述七星瓢虫转入温度24、光周期L16：D8的条件下，恢复发育。图4 七星瓢虫(Coccinella septempunctata ）本次课结束，谢谢！