显微观察方式显微观察方式奥林巴斯光学北京办事处奥林巴斯光学北京办事处齐冬齐冬观察方式观察方式1.明场观察明场观察2.暗场观察暗场观察(暗视野暗视野)3.相差观察相差观察(相衬观察相衬观察)4.偏光观察偏光观察5. DIC观察观察(微分干涉微分干涉)6. RC观察观察(浮雕相衬浮雕相衬)7.荧光观察荧光观察( (一一) )明场观察方式明场观察方式常规观察方式常规观察方式应用领域：应用领域：常规镜检、病理、染色标本优点：优点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感明场观察显微镜的调节明场观察显微镜的调节l l瞳距调节瞳距调节l l屈光度调节屈光度调节l l光路转换光路转换l l聚光镜中心聚光镜中心l l孔径光栏设置孔径光栏设置瞳距调节瞳距调节刻度指示刻度指示屈光度调节屈光度调节调节调节屈光度调节指示光光路路转转换换100%100%80%80%20%20%100%100%聚光镜中心调节聚光镜中心调节 光轴中心调节螺钉光轴中心调节螺钉光轴中心调节螺钉光轴中心调节螺钉 视场光阑视场光阑视场光阑视场光阑 孔径光阑孔径光阑孔径光阑孔径光阑10X10X10X10X物镜物镜物镜物镜 标本标本标本标本 聚光镜升降旋钮聚光镜升降旋钮聚光镜升降旋钮聚光镜升降旋钮孔径光栏调节孔径光栏调节N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物孔孔径径光光栏栏开开度度与与图图象象100%70%30%HRLCHCLRMRMC( (二二) )暗视野观察方式暗视野观察方式1 原理原理丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。2 特点特点观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 0.004 um (明场um)”超显微“。3 缺点缺点只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高（灰尘、盖片、载片）4 4 应用：应用：应用：应用：微小粒子、细菌形态观察、微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察细菌记数，透明标本观察等等( (二二) )暗视野观察方式暗视野观察方式（三）相差观察方式（三）相差观察方式1 原理原理利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共轭面：吸收光线，直射光通过共轭面：吸收光线，直射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过物镜物镜相板相板 聚光镜环状光阑聚光镜环状光阑( (三三) )相差观察方式相差观察方式2 特点特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3 缺点缺点需要光强高切片不能太厚(210um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜( (三三) )相差观察方式相差观察方式4 应用：应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)( (三三) )相差观察方式相差观察方式5 调节：调节：苛勒照明调节将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配）对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合（四）偏光观察方式（四）偏光观察方式1 原理原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜自然光（多自然光（多振动面）振动面）偏振器偏振器1偏振器偏振器2偏振光（单偏振光（单一振动面）一振动面）各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等（四）偏光观察方式（四）偏光观察方式应用：应用：矿物质、化学物品鉴别鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等（五）微分干涉（五）微分干涉（DIC）观察方法观察方法（五）微分干涉观察方法（五）微分干涉观察方法1 原理原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。（五）微分干涉观察方法（五）微分干涉观察方法2 特点特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。（五）微分干涉观察方法（五）微分干涉观察方法3 缺点缺点需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂4 应用：应用：无色透明活体标本的细微结构，无无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本，染色标本，显微操作色荧光标本，染色标本，显微操作等等（五）微分干涉观察方法（五）微分干涉观察方法（六）浮雕相衬显微镜（六）浮雕相衬显微镜（六）浮雕相衬显微镜（六）浮雕相衬显微镜1 原理原理斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。2. 历史历史1975年，Robert Hoffman 博士发明2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3. 特点特点提高未染色标本的可见性和对比度；图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕；可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ；可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织；聚光镜的工作距离可以设计的更长； RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察（六）浮雕相衬显微镜（六）浮雕相衬显微镜4. 缺点缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5. 应用应用所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作（六）浮雕相衬显微镜（六）浮雕相衬显微镜荧荧光光观观察察方方法法什么是荧光什么是荧光 ?l 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。射出的长波光。l显微镜荧光利用光源激发显微镜荧光利用光源激发光化荧光光化荧光荧光的种类荧光的种类自发（固有）荧光自发（固有）荧光 二次荧光二次荧光荧光显微镜的作用原理宽谱线发射光宽谱线发射光（汞灯）（汞灯）滤掉其他光，透过滤掉其他光，透过激发光激发光激发滤激发滤色片色片吸收滤吸收滤色片色片滤掉激发光，透过滤掉激发光，透过荧光荧光标本受激发产生标本受激发产生荧光向四周发散荧光向四周发散激发光受反射、折射激发光受反射、折射或衍射向四周发散或衍射向四周发散荧光的性质荧光的性质l吸收光，必需有激发光源吸收光，必需有激发光源l荧光波长激发波长（损失热能）荧光波长激发波长（损失热能）l荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度l有不同程度的衰减有不同程度的衰减l荧光强度取决于激发光强度、被检物浓荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率度、荧光效率荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途优点：优点：l检出能力高（放大作用）检出能力高（放大作用）l对细胞的刺激小（可以活体染色）对细胞的刺激小（可以活体染色）l能进行多重染色能进行多重染色用途：用途：l物体构造的观察物体构造的观察荧光素荧光素l荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体抗体荧光等荧光等l发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析 荧光显微镜的种类荧光显微镜的种类 透射式透射式荧光显微镜的种类荧光显微镜的种类落射式落射式荧光显微镜的主要部件荧光显微镜的主要部件 透射式透射式l吸收滤色镜吸收滤色镜l暗场聚光镜暗场聚光镜l激发滤色镜激发滤色镜l汞灯光源汞灯光源 落射式落射式l吸收滤色镜吸收滤色镜l分光镜分光镜l激发滤色镜激发滤色镜l汞灯光源汞灯光源落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造荧光显微镜光源荧光显微镜光源 汞灯光源汞灯光源: :提供激发光提供激发光( (U U、V V、B B、G) G) 氙灯光源：氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定高峰值更宽，更稳定荧光显微镜激发透镜组荧光显微镜激发透镜组 激发激发滤色镜滤色镜: : 激发波长选择激发波长选择 激发透镜组激发透镜组（激发块）（激发块）: : T%nmBAND PASS入射光入射光发射光发射光激发激发 滤色镜滤色镜分光分光 滤色镜滤色镜吸收吸收 滤色镜滤色镜落射荧光显微镜各部件特性和落射荧光显微镜各部件特性和作用作用 吸收滤色镜吸收滤色镜: :荧光透过荧光透过, ,阻挡杂光阻挡杂光 分色镜分色镜: :反射激发光反射激发光, ,荧光透过荧光透过A 透过透过AA 反射反射BB 透过透过B 阻挡阻挡nmnmT%T%A落射荧光显微镜各部件特性和落射荧光显微镜各部件特性和作用作用 吸收滤色镜吸收滤色镜: :荧光透过荧光透过, ,阻挡杂光阻挡杂光 分色镜分色镜: :反射激发光反射激发光, ,荧光透过荧光透过A 透过透过AA 反射反射BB ，C 透过透过nmnmT%T%AC滤色镜的选择滤色镜的选择荧光素的特性荧光素的特性荧光素的特性荧光素的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性滤色镜的特性激发激发激发激发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收带宽对图象的影响带宽对图象的影响SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480WIB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490FITC+PIFITC+PI多重染色标本的多色观察多重染色标本的多色观察FITC+Texas Red+DAPIFITC+Texas Red+DAPI三色滤色镜的特性曲线三色滤色镜的特性曲线激发激发激发激发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收双重染色标本的单色和双色观双重染色标本的单色和双色观察察 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIBDAPI+FITCDAPI+FITCFITC+PIFITC+PI单色滤色镜的特性曲线单色滤色镜的特性曲线双色滤色镜的特性曲线双色滤色镜的特性曲线现行显微镜特点和各种滤色镜现行显微镜特点和各种滤色镜自由组合自由组合 激激发块发块吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜油油镜镜应应使使用用荧荧光光油油 物镜光栏物镜光栏的运用的运用光栏全开启光栏全开启光栏适当关小光栏适当关小减少杂散光干扰减少杂散光干扰荧光的衰减荧光的衰减 防衰减的方法防衰减的方法l使用抗衰减剂使用抗衰减剂l选择衰减小的荧光素选择衰减小的荧光素l降低激发光强度降低激发光强度l降低标本中氧的浓度降低标本中氧的浓度有衰减的标本有衰减的标本使用抗衰减剂的效果使用抗衰减剂的效果汞灯灯箱构造汞灯灯箱构造灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮汞灯中心调节方法汞灯中心调节方法l l放置荧光调中板或一张白纸于载物台上放置荧光调中板或一张白纸于载物台上l l转入转入B或或G激发滤色镜激发滤色镜l l用用10X物镜观察并聚焦物镜观察并聚焦l l取下取下10X物镜物镜l l通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸l l通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心于白纸上圆环中心1.明场观察明场观察常规染色片（常规染色片（HE染色等）染色等）2.暗场观察暗场观察微粒外观（细菌记数等）微粒外观（细菌记数等）3.相差观察相差观察活细胞标本（细胞培养、活细胞标本（细胞培养、膜片钳等）膜片钳等）4.偏光观察偏光观察双折射物质（晶体检测）双折射物质（晶体检测）5. DIC观察观察活细胞等（细胞培养，显活细胞等（细胞培养，显微操作等）微操作等）6. RC观察观察 显微操作显微操作7.荧光观察荧光观察 物质鉴定（抗体、抗原、物质鉴定（抗体、抗原、荧光原位杂交荧光原位杂交等）等）