质粒提取和酶切分析中心实验室 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切分析的限制性内切酶酶切分析1. 实验目的实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性、学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法切的原理和方法 ，并理解限制性内切，并理解限制性内切酶是酶是DNA重组技术的关键工具。重组技术的关键工具。 n n感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。 上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类：型型*型第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：平头末端：异源同工酶：又称同裂酶有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（或同切酶）。同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5G|CG G33G GC|G53） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。同尾酶：同尾酶：如Xba1和Nhe1: 5T|CTAGA3 5G|CTAGC3 3AGATC|T5 3CGATC|G5 5T CTAGA3 5G CTAGC3 3AGATC T5 3CGATC G5 5TCTAGC3 3AGATCG5 这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli用Eco表示，所以用斜体字。v用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌 株 用 d， 即Hind。v如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind,Hind，Hind等。3. 酶切反应的设计一般应注意问题酶切反应的设计一般应注意问题: : 1)大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。2)反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为。同时RNA应该尽量消化去除。3)当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。4)酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。5)反应混合液中加入浓度为的BSA，可维持酶的稳定性。酶单位定义酶单位定义:活性单位：活性单位： 在最适反应条件下在最适反应条件下(温度、温度、PH值、离子值、离子浓度）浓度）1小时内完全酶切小时内完全酶切1g特定特定DNA底物所需的底物所需的限制酶的量。限制酶的量。4. 酶切实验中的注意事项酶切实验中的注意事项: :1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。4)终止酶反应可根据需要采用不同的方法：5) 酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。6) 若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。7) 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。4. 酶切实验设计的一般思路酶切实验设计的一般思路: :软件检测目的需要转移操作的目的基因片段含有的酶切位点情况，选择基因内部不存在的内切酶。确定双酶切的通用buffer确定内切酶的最适用量和酶切时间进行酶切实验3. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器质粒：重组质粒BamH核酸内切酶（Takara）酶解缓冲液(10K buffer)离心机，水浴锅10l微量移液器，无菌的0.5mL EP管4. 实验方法和步骤实验方法和步骤 Total ddH2O 10Buffer BamH DNA(50ng/l)10l 1l 1l2) 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶解的限制性内切酶酶解1) 质粒中质粒中RNA的酶解的酶解 向30l质粒溶液中加入10mg/mL Rnase 2l， 37水浴酶解小时。 置于30水浴酶解3小时。酶解完成后，分别进行电泳分析。Sac1 4-12U/Sac1 4-12U/m ml lXba1 8-20U/Xba1 8-20U/m ml lDNADNA限限制制性性内内切切酶酶对基基因因组DNADNA完完全全酶酶切切的的酶酶量量和所用的和所用的时间是是负相关的相关的如如Xba1:Xba1:50U50U完全完全酶酶切需要切需要5h, 5U5h, 5U完全完全酶酶切切则需要需要20h20h 碱裂解法小量制备质粒碱裂解法小量制备质粒DNA一实验目的及背景一实验目的及背景n n细菌质粒是一类双链、闭环的细菌质粒是一类双链、闭环的DNADNA，大小，大小范围从范围从1kb1kb至至200kb200kb以上不等。各种质粒都是以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。到后代。n n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒图谱的阅读n n复制起始位点复制起始位点OriOri 即控制复制起始的位点。即控制复制起始的位点。原核生物原核生物DNADNA分子中只有一个复制起始点。而真核生分子中只有一个复制起始点。而真核生物物DNADNA分子有多个复制起始位点。分子有多个复制起始位点。n n 抗生素抗性基因抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如可以便于加以检测，如Amp+Amp+ ，NeoNeon n多克隆位点多克隆位点MCSMCS克隆携带外源基因片段克隆携带外源基因片段 n nP/EP/E启动子启动子/ /增强子增强子n nTermsTerms 终止信号终止信号n n加加polypoly（A A）信号）信号 可以起到稳定可以起到稳定mRNAmRNA作用作用质粒图谱的阅读质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.质粒特点n n质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。n n质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.n n年由Lederburg正式命名为质粒。质粒类型n n质粒按复制方式分为两种类型：质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒松弛型质粒严紧型质粒严紧型质粒n n松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒n n1.1.松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-2000-30003000拷贝。拷贝。n n2. 2.严紧型质粒严紧型质粒n n严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。剂来增加。n n其他分类：其他分类：n n克隆质粒克隆质粒和和 表达质粒表达质粒n n原核质粒、真核质粒、穿梭质粒原核质粒、真核质粒、穿梭质粒 n n表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒就是指带有启动子，增强子等等，使就是指带有启动子，增强子等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒n n穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。比如说是指可以在多种宿主下复制。比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 质粒的应用n n大多数基因工程使用松弛型质粒。n n严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。n n质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。分离质粒DNA方法n n从大肠杆菌中分离质粒从大肠杆菌中分离质粒DNADNA方法众多，目前常方法众多，目前常用的用的n n碱裂解法；碱裂解法；n n煮沸法；煮沸法；n nSDSSDS法；法；n n 羟基磷灰石层析法等羟基磷灰石层析法等n n各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高碱变性法既经济且收得率较高, ,提取的质粒提取的质粒DNADNA可用于酶切可用于酶切, ,连接与转化。连接与转化。碱裂解法基本原理n n在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNADNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNADNA仍为自然状态。仍为自然状态。n n将将PHPH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体色体DNADNA之间交联形成不溶性网状结构，大部之间交联形成不溶性网状结构，大部分分DNADNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDSSDS的作用下形成沉的作用下形成沉淀，而质粒淀，而质粒DNADNA仍为可溶状态，通过离心可除仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体去大部分细胞碎片、染色体DNADNA、RNARNA及蛋白及蛋白质，质粒质，质粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒一步纯化质粒DNADNA。实验试剂实验试剂n n1 1菌种菌种 含质粒含质粒DNADNA的大肠杆菌工程菌的大肠杆菌工程菌DH5DH5n n2 2LBLB液体培养基液体培养基n n3 310mg/ml10mg/ml氨苄青霉素氨苄青霉素(Amp)(Amp)溶液溶液 n n4 4含含AmpAmp的的LBLB固体培养基固体培养基 n n5 5Tris-HClTris-HCl饱和酚饱和酚(pH8.0)(pH8.0)n n6 6溶溶液液 含含50mmol/L50mmol/L葡葡萄萄糖糖，10mmol/10mmol/ EDTA-NaEDTA-Na2 2，25mmol/L25mmol/LTris-HCl(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)。（。（8 8磅高压）磅高压）n n7 7溶溶液液 含含200mmol/L200mmol/LNaOHNaOH，10g/L10g/LSDSSDS，临临用用前前用用两两种种溶溶液液的贮存液配制。的贮存液配制。n n8 8溶溶液液 5mol/L5mol/L醋醋酸酸钾钾溶溶液液60ml(60ml(称称取取醋醋酸酸钾钾定定容容至至60ml)60ml)，冰冰醋酸和双蒸水混合而成。醋酸和双蒸水混合而成。n n9 910mg/mlRNaseA10mg/mlRNaseAn n1010TETE缓冲液缓冲液(pH8.0)(pH8.0)1111其他试剂其他试剂 氯仿、无水乙醇。氯仿、无水乙醇。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液三实验方法三实验方法1 1用用接接种种环环挑挑取取1 1环环冷冷冻冻保保存存的的含含质质粒粒DNADNA大大肠肠杆杆菌菌工工程程菌菌，划划线线接接种种于于含含有有AmpAmp的的LBLB固固体体培培养养基基平平板板上上，3737倒置培养约倒置培养约12h(12h(过夜过夜) )。2 2用用接接种种针针或或消消毒毒牙牙签签挑挑取取单单菌菌落落于于盛盛有有5 5mlmlLBLB液液体体培培养基养基( (含含100g/mlAmp)100g/mlAmp)的试管中，的试管中，3737摇荡培养过夜。摇荡培养过夜。3 3取取1ml1ml菌菌液液加加入入的的EPEP管管中中，1212000r/min000r/min离离心心2min2min，弃弃上清，真空抽吸注意换头。上清，真空抽吸注意换头。4. 4. 加加 入入 预预 置置 4 4 的的 STESTE溶溶 液液 100100 ll重重 悬悬 菌菌 斑斑 ， 1212000r/min000r/min离心离心1min1min，弃上清。，弃上清。5 5在沉淀中加入溶液在沉淀中加入溶液100l100l重悬菌斑，重悬菌斑，44静置静置5-10min5-10min。6 6加加入入200l200l新新鲜鲜配配制制的的溶溶液液，颠颠倒倒数数次次，轻轻轻轻混混匀匀，冰浴冰浴5 510min(10min(溶液变透明，粘稠，溶液变透明，粘稠，切忌延长切忌延长) )。7 7加加入入溶溶液液150l150l，颠颠倒倒混混匀匀，冰冰浴浴5 510min(10min(溶溶液液出出现现白白色色沉沉淀淀) )8 815000r/min15000r/min离心离心10min10min，将上清转移至另一，将上清转移至另一EPEP管中。管中。9 9加加等等体体积积酚酚抽抽提提1 1次次，1515000r/min000r/min离离心心3min3min，取取上上层层水水相相转转移移至至另一另一EPEP管。管。1010加加等等体体积积氯氯仿仿抽抽提提1 1次次，1515000r/min000r/min离离心心30sec30sec，取取上上层层水水相相转转移移至另一至另一EPEP管。管。1111加加入入2 2倍倍体体积积无无水水乙乙醇醇（预预置置-20-20），再再加加入入1/101/10体体积积的的3M3MNaAcNaAc，-20-20放置放置30min30min；15000r/min15000r/min离心离心10min10min，弃上清。，弃上清。1212用用70%70%乙乙醇醇洗洗涤涤沉沉淀淀，8 8000r/min000r/min，离离心心10min10min，弃弃乙乙醇醇，室室温温下下静置使乙醇挥发或真空干燥。静置使乙醇挥发或真空干燥。1313用用30l30l ddHddH2 2O O溶溶解解DNADNA沉沉淀淀，并并加加入入3l3l RNase,RNase,， 3737水水浴浴30min30min，-20-20保存。保存。四、结果检测1 1、电泳：、电泳：质粒质粒DNADNA的存在形式有的存在形式有3 3种：种：共价闭环共价闭环DNADNA，常以超螺，常以超螺旋形式存在；旋形式存在；开环开环DNADNA，此种质粒，此种质粒DNADNA两条链中有一条发生一两条链中有一条发生一处或多处断裂；处或多处断裂；线性线性DNADNA，因质粒，因质粒DNADNA的两条链在同一处断裂的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒而造成。在电泳时同一质粒DNADNA的的3 3种形式泳动速度：超螺旋种形式泳动速度：超螺旋线性开环线性开环 抽提产物经电泳分离、抽提产物经电泳分离、EBEB染色后，在紫外线灯下可观察到染色后，在紫外线灯下可观察到三条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒三条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNADNA。n n2 2、定量检测定量检测： 质粒质粒1 1：100100稀释，检测稀释，检测OD260OD260（双链（双链DNADNA在在1.8)1.8)，计算质粒，计算质粒DNADNA的浓度（的浓度（1OD260=50g1OD260=50g质粒质粒DNA/mlDNA/ml）1.菌体老化菌体老化2.碱裂解不充分碱裂解不充分3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.溶液使用不当溶液使用不当1.请涂布平板培养后，重新挑请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养选新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量3.不要频繁转接，每次接种时不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。使用浓度是否正确。4.溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊，置于现浑浊，置于37保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液直至溶解为清亮的溶液。五、质粒五、质粒五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原原因因对对策策1.混有蛋白混有蛋白2.混有混有RNA3.混有基因组混有基因组DNA1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.加入加入RNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间3.加入溶液加入溶液II 和和III后后防止剧烈振防止剧烈振荡，可能把基因组荡，可能把基因组DNA剪切成剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超的降解，培养时间不要超过过16小时。小时。五、质粒五、质粒五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题二：质粒纯度不高，如何解决？问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原原因因对对策策谢谢！