1 第九章 吸光光度法 9.1 吸光光度法的根本原理 9.2 光度计及其根本部件 9.3 显色反响及显色条件的选择 9.4 吸光度丈量条件的选择 9.5 吸光光度法的运用 29.1 9.1 吸光光度法的根本原理吸光光度法的根本原理 一、概述：一、概述： 比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种的一种 方法。方法。 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。性吸收的特性而建立起来的分析方法。3经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光经过经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光经过该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的吸收越强。吸收越强。 分光光度法：丈量物质对一定波长光线的吸收程度分光光度法：丈量物质对一定波长光线的吸收程度确定组分含量的方法。确定组分含量的方法。 4特点：特点： 灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达105106molL-1, 10-4%10-5%准确度可以满足微量组分的测定要求：准确度可以满足微量组分的测定要求： 相对误差相对误差25 操作简便快速操作简便快速运用广泛运用广泛5化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较化学分析：常量组分化学分析：常量组分(1%), Er 0.1%0.2% 根据化学反响根据化学反响, 运用玻璃仪器运用玻璃仪器 准确度高准确度高仪器分析：微量组分仪器分析：微量组分(104104* *选择性好选择性好 显色剂在测定波优点无明显吸收。显色剂在测定波优点无明显吸收。 对照性好对照性好, , max60 nm .max60 nm .* *反响生成的有色化合物组成恒定，稳定。反响生成的有色化合物组成恒定，稳定。* *显色条件易于控制，重现性好。显色条件易于控制，重现性好。501. 显色剂用量显色剂用量c(M)、pH一定一定9.3.2 显色条件确实定显色条件确实定c(R)c(R)c(R)Fe(SCN)n3-nMo(SCN)32+ 浅浅红红Mo(SCN)5 橙红橙红Mo(SCN)6- 浅红浅红512. 显色反响酸度显色反响酸度c(M)、 c(R)一定一定pHpH1pH64 吸光光度法中，仪器丈量不准也是误差的主要来源。 A=-lgT=bc 透过率读数误差透过率读数误差DT根本是个常数，由于根本是个常数，由于T的标尺是均匀的，的标尺是均匀的， DT是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和T的大小无关的大小无关 吸光度读数误差吸光度读数误差DA是随着是随着A的不同而变化，由于的不同而变化，由于A的刻的刻度标尺是不均匀的，度标尺是不均匀的，DA随着随着A的增大而增大的增大而增大65 不同的吸光度数值不同的吸光度数值A下，吸光度读数误差带来的测定浓下，吸光度读数误差带来的测定浓度误差度误差dc/c是不同的是不同的66 假设假设T为为0.5%，绘制不同透过率下浓度相对，绘制不同透过率下浓度相对误差变化曲线如图误差变化曲线如图9-16p254：T过高或过低，过高或过低，dc/c都是很大的，都是很大的，T在适宜的范围内丈量误差才是在适宜的范围内丈量误差才是可以接受的可以接受的 利用利用9-5公式令其导数为零，求出：公式令其导数为零，求出：T=0.368A=0.434浓度误差最小，约为浓度误差最小，约为1.4%。671086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度丈浓度丈量的相量的相对误差对误差与与T(或或A)的关的关系系实践任务中，应控制实践任务中，应控制T T在在70 70 10 10 , , A A在在0.150.151.01.0之间之间 ( (调调c, b, c, b, ) )68调整比色皿厚度和取样量等到达调整比色皿厚度和取样量等到达浓度误差大小和浓度误差大小和T/AT/A的读数范围有关：的读数范围有关： T=70 T=7010% / A=0.1510% / A=0.151.01.0时，时，浓度丈量误差为浓度丈量误差为1.4-2.2%1.4-2.2%； 假设要求准确度高些，假设要求准确度高些， 可控制可控制T=65-20% /A=0.2-0.7T=65-20% /A=0.2-0.769 吸光光度法的运用吸光光度法的运用1. 单一组分测定单一组分测定 规范曲线法规范曲线法1) 金属离子金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟丁二酮肟, Co-钴试剂钴试剂2) 磷的测定磷的测定: DNA中含中含P9.2%, RNA中含中含P9.5%, 可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄( 小小)Sn2+磷钼磷钼(V)蓝蓝( 大大)702. 2. 多组分的测定多组分的测定a)在1处测组分x, 在2处测组分yb) 在1处测组分x; 在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y c) x,y组分不能直接测定 P254A1= xl1 bcx+ yl1 bcy (在1处测得A1) A2 = xl2 bcx+ yl2 bcy (在2处测得A2)x1, x1, y1, y1, x2, x2, y2y2由由x,yx,y纯纯液液 在在 1, 1, 2 2处分别测得处分别测得713) 蛋白质测定蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4) 氨基酸测定氨基酸测定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5) 水质检测水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6) 药物含量测定药物含量测定比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法测定.7) 紫外吸收紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。苯丙氨酸、蛋白质等。72 4.4.配合物组成的测定配合物组成的测定3.3.一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定 5. 双波长分光光度法消除干扰双波长分光光度法消除干扰 6. 导数分光光度法导数分光光度法