TheTechniquesandApplicationofTheTechniquesandApplicationofConfocalLaserScanningMicroscopyConfocalLaserScanningMicroscopy-影响共聚焦影响共聚焦扫描中描中图像像质量的量的设备要素和制要素和制样要素要素书面实验报告：书面实验报告：1 如何判别共聚焦图片的荧光质量？如何判别共聚焦图片的荧光质量？2 影响共聚焦图像质量的硬件要素有哪些？影响共聚焦图像质量的硬件要素有哪些？请同窗们撰写好实验报告后，下次实习前由请同窗们撰写好实验报告后，下次实习前由各班班长收齐并交给中心担任教学的王教各班班长收齐并交给中心担任教学的王教师处！师处！一一. .概述概述二二. .影响共聚焦影响共聚焦检测质量的主要量的主要设备参数参数三三. .因因样本的本的处置不当影响共聚焦置不当影响共聚焦检测质量的量的 要素要素四四. .样本制造本制造过程需求留意的程需求留意的问题光电倍增管光电倍增管检测针孔检测针孔光源针孔光源针孔光源光源分色镜分色镜物镜物镜样本样本聚集平面聚集平面评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：1 1荧光标志反响的特异性和荧光信号定位准确性荧光标志反响的特异性和荧光信号定位准确性荧光标志反响的特异性和荧光信号定位准确性荧光标志反响的特异性和荧光信号定位准确性2 2坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性3 3荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性4 4荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度5 5荧光稳定性荧光稳定性荧光稳定性荧光稳定性6 6荧光信号的分布的一致性荧光信号的分布的一致性荧光信号的分布的一致性荧光信号的分布的一致性7 7两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性8 8背景噪声干扰性背景噪声干扰性背景噪声干扰性背景噪声干扰性一一. .概述概述二二. .影响共聚焦影响共聚焦检测质量的主要量的主要设备参数参数三三. .样本的本的处置及影响共聚焦置及影响共聚焦检测质量的要素量的要素四四. .样本制造本制造过程需求留意的程需求留意的问题影响影响影响影响获获取取取取图图像像像像质质量主要的共聚焦参数：量主要的共聚焦参数：量主要的共聚焦参数：量主要的共聚焦参数：1 1 1 1检测针检测针孔孔孔孔Detector Pinhole Detector Pinhole Detector Pinhole Detector Pinhole 2 2 2 2激光功率激光功率激光功率激光功率(Power) (Power) (Power) (Power) 3 3 3 3声光控制器声光控制器声光控制器声光控制器 AOTF-Acousto Optic Tunable Filter) AOTF-Acousto Optic Tunable Filter) AOTF-Acousto Optic Tunable Filter) AOTF-Acousto Optic Tunable Filter)4 4 4 4光光光光电电倍增管增益及静噪控制倍增管增益及静噪控制倍增管增益及静噪控制倍增管增益及静噪控制PMT Gain & PMT OffsetPMT Gain & PMT OffsetPMT Gain & PMT OffsetPMT Gain & PMT Offset5 5 5 5反复反复反复反复扫扫描描描描- - - -数字减噪数字减噪数字减噪数字减噪Li.A.Li.A.Li.A.Li.A.、Aver.Aver.Aver.Aver. 6 6 6 6扫扫描描描描图图分辨率分辨率分辨率分辨率FormatFormatFormatFormat: : : : 除此以外除此以外除此以外除此以外 物物物物镜镜ObjectiveObjectiveObjectiveObjective、 扫扫描速度描速度描速度描速度Scan SpeedScan SpeedScan SpeedScan Speed 扫扫描方向描方向描方向描方向Unidirectional Scan / Bidirectional ScanUnidirectional Scan / Bidirectional ScanUnidirectional Scan / Bidirectional ScanUnidirectional Scan / Bidirectional Scan (X-Direction) (X-Direction) (X-Direction) (X-Direction) 数数数数码码放大放大放大放大Zoom InZoom InZoom InZoom In PinholePinholePinholePinhole检测针检测针孔：默孔：默许值许值=1=1，数，数值值111讯讯燥比燥比较较好好Pin=0.2Pin=1Pin=2光光电电倍增管倍增管 PMT PMT gain /PMT ffset PMT PMT gain /PMT ffset领领会会值值：480 500 Gain 680 760 - 8 - 0 Offest + 0 + 2480 500 Gain 680 760 - 8 - 0 Offest + 0 + 2025502550255用用用用线线平均法平均法平均法平均法进进展展展展线扫线扫描描描描用用用用线线平均法平均法平均法平均法进进展展展展线扫线扫描描描描Line Line AversgeAversge的的作作用用是是运运用用平平均均法法线线扫扫描描的的图图像像，即即对对每每条条线线进进展展反反复复多多次的次的扫扫描，并求每个采描，并求每个采样样点的算点的算术术平均平均值值。领领会会值值：常常用用2 2、4 4，ACCUACCU扫扫描方式描方式选选4 4、8 8。AversgeAversge的的功功能能是是运运用用平平均均法法线线扫扫描描的的图图像像，即即对对每每张张图图像像进进展展反反复复多多次的次的扫扫描，并求每个采描，并求每个采样样点的算点的算术术平均平均值值。领领会会值值：常用：常用2 2、4 4。Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=2Li.A=2Aver=2Aver=2Li.A=2Li.A=2Aver=0Aver=0单单向、双向向、双向向、双向向、双向扫扫描描描描功能：假功能：假功能：假功能：假设设点点点点击击UnidirectionalUnidirectionalUnidirectionalUnidirectional、Bidirectional ScanBidirectional ScanBidirectional ScanBidirectional Scan按按按按钮钮，会启，会启，会启，会启动动双向双向双向双向扫扫描方式，假描方式，假描方式，假描方式，假设设不点不点不点不点击击此按此按此按此按钮钮，就默，就默，就默，就默许单项扫许单项扫描方式描方式描方式描方式单向扫描单向扫描双向扫描双向扫描单位单位400400800800线数每秒线数每秒80080016001600线数每秒线数每秒1000100020002000线数每秒线数每秒SpeedSpeed扫扫描速度描速度描速度描速度选择选择功能：假功能：假设设点点击击SpeedSpeed按按钮钮，会翻开，会翻开扫扫描速度描速度调调理理对话对话框，框，选择选择不同不同扫扫描速度描速度单向扫描单向扫描单向扫描单向扫描单位单位单位单位400400线数每秒默许值线数每秒默许值线数每秒默许值线数每秒默许值800800线数每秒线数每秒线数每秒线数每秒10001000线数每秒线数每秒线数每秒线数每秒ZoomZoom电电子放大子放大共聚焦共聚焦显显微微镜术镜术中中图图像的放大倍数取决于物像的放大倍数取决于物镜镜的放大倍数和的放大倍数和电电子子放大倍数。物放大倍数。物镜镜的放大的放大产产生的原是生的原是图图像本身就一个放大倍数，像本身就一个放大倍数，还还可以可以经过电经过电子放大子放大进进一步提高放大倍数。一步提高放大倍数。预电预电子放大倍数子放大倍数为为2 2 的的图图像相比，像相比，电电子放大倍数子放大倍数为为2 2时时，扫扫描点数不描点数不变变，边长边长减半，减半，扫扫描描长长的面的面积仅为积仅为原原场场的四分之一。的四分之一。这样这样提高了提高了扫扫描的放大倍数和分描的放大倍数和分辨率。辨率。虽虽然放大倍数可以提高很多，但也不是无限的放大的，其极限然放大倍数可以提高很多，但也不是无限的放大的，其极限值值取决于物取决于物镜镜的分才干。的分才干。对对于易于漂白的于易于漂白的样样本、本、样样本的本的荧荧光光强强度很低的度很低的样样本、多光子本、多光子扫扫描描方式，建方式，建议议少用少用电电子放大。由于子放大。由于进进展展电电子放大子放大时时，扫扫描描频频率加率加强强，扫扫描描时间间时间间隔减小，隔减小，样样本容易遭到光本容易遭到光损伤损伤。默默许值许值 Zoom=1 Zoom=11X2X4X8X16X32X64Xothers一一. .概述概述二二. .影响共聚焦影响共聚焦检测质量的主要量的主要设备参数参数三三. .因因样本的本的处置不当影响共聚焦置不当影响共聚焦检测质量的量的 要素要素四四. .样本制造本制造过程需求留意的程需求留意的问题荧荧光光光光标标志后志后志后志后样样品品品品荧荧光光光光强强度低的能度低的能度低的能度低的能够缘够缘由有：由有：由有：由有：1.1.1.1.所运用的所运用的所运用的所运用的荧荧光探光探光探光探针浓针浓度度度度过过低。低。低。低。2.2.2.2.2.2.2.2.标标志志志志条条条条件件件件不不不不适适适适当当当当：孵孵孵孵育育育育的的的的时时间间、温温温温度度度度不不不不当当当当，大大大大多多多多数数数数情情情情况况况况下都是下都是下都是下都是样样品与探品与探品与探品与探针针孵育温度太低或孵育温度太低或孵育温度太低或孵育温度太低或时间时间太短呵斥。太短呵斥。太短呵斥。太短呵斥。3.3.3.3.3.3.3.3.荧荧光光光光探探探探针针失失失失效效效效。这这是是是是一一一一种种种种很很很很常常常常见见的的的的标标志志志志失失失失败败缘缘由由由由。荧荧光光光光探探探探针针普普普普通通通通要要要要低低低低温温温温保保保保管管管管、不不不不要要要要反反反反复复复复冻冻溶溶溶溶、运运运运用用用用液液液液现现用用用用现现配配配配制制制制，另外其要在保另外其要在保另外其要在保另外其要在保质质期内运用。期内运用。期内运用。期内运用。荧荧光光光光标标志后志后志后志后样样品品品品荧荧光光光光强强度低的能度低的能度低的能度低的能够缘够缘由有：由有：由有：由有：4.4.4.4.所所所所用用用用介介介介质质、pHpHpHpH值值不不不不适适适适当当当当。例例例例如如如如FITCFITCFITCFITC：在在在在pH6-8pH6-8pH6-8pH6-8时时，很很很很难难跨跨跨跨过过完完完完好好好好的的的的活活活活细细胞胞胞胞膜膜膜膜使使使使之之之之染染染染色色色色，但但但但在在在在。pHpHpHpH为为9 9 9 9时时，可可可可以以以以跨跨跨跨膜膜膜膜进进入入入入细细胞。胞。胞。胞。5.5.5.5.细细胞胞胞胞形形形形状状状状不不不不正正正正常常常常。例例例例如如如如，有有有有一一一一些些些些探探探探针针只只只只标标志志志志活活活活细细胞胞胞胞，假假假假设设细细胞活性不胞活性不胞活性不胞活性不够够那么那么那么那么难难以以以以标标志上志上志上志上荧荧光。光。光。光。6.6.6.6.探探探探针针溶溶溶溶解解解解不不不不充充充充分分分分。虽虽然然然然参参参参与与与与溶溶溶溶液液液液的的的的探探探探针针量量量量足足足足够够，但但但但探探探探针针没没没没有完全溶解，因此，有完全溶解，因此，有完全溶解，因此，有完全溶解，因此，实实践接触践接触践接触践接触细细胞的探胞的探胞的探胞的探针浓针浓度很低。度很低。度很低。度很低。荧荧光光光光标标志后志后志后志后样样品品品品荧荧光光光光强强度低的能度低的能度低的能度低的能够缘够缘由有：由有：由有：由有：7.7.7.7.探探探探针针走走走走漏漏漏漏。例例例例如如如如，用用用用可可可可透透透透细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的探探探探针针FDAFDAFDAFDA标标志志志志细细胞胞胞胞后后后后，应应在在在在40404040分分分分钟钟内内内内测测定定定定，否否否否那那那那么么么么其其其其从从从从进进人人人人开开开开场场，120120120120分分分分钟钟后后后后，其其其其荧荧光光光光就就就就只只只只剩下剩下剩下剩下约约10101010，细细胞内的胞内的胞内的胞内的荧荧光探光探光探光探针针会大部分走漏到会大部分走漏到会大部分走漏到会大部分走漏到细细胞外。胞外。胞外。胞外。8.8.8.8.8.8.8.8.探探探探针针选选择择错错误误。探探探探针针的的的的化化化化学学学学方方方方式式式式直直直直接接接接影影影影响响响响标标志志志志的的的的结结果果果果。例例例例如如如如标标志志志志活活活活细细胞胞胞胞Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+，运运运运用用用用nu0-3nu0-3nu0-3nu0-3荧荧光光光光探探探探针针时时，其其其其有有有有两两两两种种种种方方方方式式式式，Fluo-3 Fluo-3 Fluo-3 Fluo-3 AMAMAMAM和和和和Fluo-3Fluo-3Fluo-3Fluo-3；直直直直接接接接与与与与活活活活细细胞胞胞胞共共共共孵孵孵孵育育育育标标志志志志时时，要要要要用用用用荧荧光光光光探探探探针针的的的的跨跨跨跨膜膜膜膜方方方方式式式式Fluo-3AMFluo-3AMFluo-3AMFluo-3AM，而而而而不不不不能能能能用用用用Fluo-3Fluo-3Fluo-3Fluo-3，后后后后者者者者可可可可用用用用显显微微微微注注注注射射射射等等等等方方方方式式式式导导入入入入细细胞胞胞胞。而而而而Fura-2Fura-2Fura-2Fura-2采采采采用用用用双双双双波波波波长长检检测测比比比比率率率率法法法法，Fluo-Fluo-Fluo-Fluo-3 3 3 3是是是是单单波波波波长长检检测测，Fura-2Fura-2Fura-2Fura-2的的的的激激激激发发波波波波长长是是是是340nm340nm340nm340nm和和和和380nm380nm380nm380nm，发发射射射射波波波波长长为为510nm510nm510nm510nm。Fluo-3Fluo-3Fluo-3Fluo-3的的的的激激激激发发波波波波长长是是是是506nm506nm506nm506nm，最最最最大大大大发发射射射射波波波波长长为为526nm526nm526nm526nm。Fura-2Fura-2Fura-2Fura-2可可可可以以以以采采采采用用用用流流流流式式式式细细胞胞胞胞仪仪检检测测，Fluo-3Fluo-3Fluo-3Fluo-3普普普普通通通通采采采采用用用用激激激激光光光光管管管管聚聚聚聚焦焦焦焦或或或或荧荧光光光光显显微微微微镜检测镜检测。荧荧光光光光标标志后志后志后志后样样品品品品荧荧光光光光强强度低的能度低的能度低的能度低的能够缘够缘由有：由有：由有：由有：9.9.9.9.荧荧光光光光干干干干扰扰。样样品品品品中中中中的的的的自自自自发发荧荧光光光光光光光光谱谱范范范范围围很很很很宽宽，有有有有时时会会会会干干干干扰扰正正正正常常常常细细胞胞胞胞染染染染色色色色，例例例例如如如如，叶叶叶叶绿绿素素素素的的的的自自自自发发荧荧光光光光光光光光谱谱范范范范围围很很很很宽宽且且且且强强度高，会覆盖某些度高，会覆盖某些度高，会覆盖某些度高，会覆盖某些红红、黄、黄、黄、黄、绿绿色色色色荧荧光。光。光。光。10.10.10.10.10.10.10.10.荧荧光光光光重重重重合合合合，例例例例如如如如。FITCFITCFITCFITC的的的的荧荧光光光光光光光光谱谱和和和和GFPGFPGFPGFP的的的的荧荧光光光光光光光光谱谱在在在在有有有有很很很很大大大大一一一一部部部部分分分分是是是是重重重重合合合合的的的的，在在在在荧荧光光光光显显微微微微镜镜下下下下很很很很难难分分分分开开开开。因因因因此此此此假假假假设设不不不不具具具具备备分分分分开开开开二二二二者者者者光光光光谱谱的的的的仪仪器器器器设设备备，应应尽尽尽尽量量量量防防防防止止止止二二二二者者者者同同同同时时出如今同一出如今同一出如今同一出如今同一样样品中。品中。品中。品中。荧荧光光光光标标志后志后志后志后样样品品品品荧荧光光光光强强度低的能度低的能度低的能度低的能够缘够缘由有：由有：由有：由有：11.11.11.11.察察察察看看看看样样品品品品荧荧光光光光的的的的条条条条件件件件不不不不适适适适宜宜宜宜。有有有有时时，虽虽然然然然样样品品品品曾曾曾曾经经标标志志志志了了了了荧荧光光光光，但但但但是是是是假假假假设设察察察察看看看看样样品品品品所所所所运运运运用用用用的的的的条条条条件件件件不不不不适适适适宜宜宜宜，也也也也会会会会察察察察看看看看不不不不到到到到荧荧光光光光。例例例例如如如如APCAPCAPCAPC红红标标志志志志的的的的样样品品品品，其其其其最最最最大大大大激激激激发发波波波波长长为为650nm650nm650nm650nm，用用用用普普普普通通通通荧荧光光光光显显微微微微镜镜很很很很难难看看看看到到到到；共共共共聚聚聚聚焦焦焦焦显显微微微微镜镜激激激激光光光光谱线谱线中用中用中用中用633nm633nm633nm633nm的激光的激光的激光的激光谱线谱线才干采集到其才干采集到其才干采集到其才干采集到其图图像。像。像。像。12.12.12.12.有有有有淬淬淬淬灭灭剂剂存存存存在在在在。假假假假设设介介介介质质中中中中含含含含有有有有淬淬淬淬灭灭剂剂，也也也也会会会会使使使使荧荧光光光光下下下下降降降降或或或或完完完完全全全全淬淬淬淬灭灭。其其其其他他他他缘缘由由由由：例例例例如如如如，参参参参与与与与试试剂剂种种种种类类、顺顺序序序序错错误误、漏加、漏加、漏加、漏加试剂试剂及不当的操作均可及不当的操作均可及不当的操作均可及不当的操作均可导导致致致致荧荧光光光光标标志失志失志失志失败败。一一. .概述概述二二. .影响共聚焦影响共聚焦检测质量的主要量的主要设备参数参数三三. .因因样本的本的处置不当影响而共聚焦置不当影响而共聚焦检测质量的量的要素要素四四. .样本制造本制造过程需求留意的程需求留意的问题标标本反复离心洗本反复离心洗本反复离心洗本反复离心洗涤涤会呵斥会呵斥会呵斥会呵斥细细胞的粘附性降低，在免疫胞的粘附性降低，在免疫胞的粘附性降低，在免疫胞的粘附性降低，在免疫组组化染色化染色化染色化染色过过程中容易脱片，因此在制程中容易脱片，因此在制程中容易脱片，因此在制程中容易脱片，因此在制备备涂片前涂片前涂片前涂片前载载玻片上玻片上玻片上玻片上应应涂粘附涂粘附涂粘附涂粘附剂剂；为节为节省省省省试剂试剂和便于和便于和便于和便于镜镜下察看和下察看和下察看和下察看和记记数，数，数，数，应应将将将将细细胞集中到直胞集中到直胞集中到直胞集中到直径径径径0.60.60.60.61.0cm1.0cm1.0cm1.0cm的的的的圆圆圈内，圈内，圈内，圈内，细细胞面胞面胞面胞面积积占占占占视视野的野的野的野的20%20%20%20%以上以上以上以上为为宜；宜；宜；宜；粘液丰富的粘液丰富的粘液丰富的粘液丰富的标标本如痰液、胃液等，未本如痰液、胃液等，未本如痰液、胃液等，未本如痰液、胃液等，未经经特殊特殊特殊特殊处处置，普通置，普通置，普通置，普通不宜作免疫不宜作免疫不宜作免疫不宜作免疫组组化化化化标标志。志。志。志。一制一制一制一制备细备细胞涂片胞涂片胞涂片胞涂片应应留意：留意：留意：留意：二二 固定组织时应留意固定组织时应留意 :应应力求力求力求力求坚坚持持持持组织组织新新新新颖颖，勿使其枯燥，尽快固定，勿使其枯燥，尽快固定，勿使其枯燥，尽快固定，勿使其枯燥，尽快固定处处置；置；置；置；组织块组织块不宜不宜不宜不宜过过大大大大过过厚，必需小于厚，必需小于厚，必需小于厚，必需小于2cmXl.5cmx0.3cm2cmXl.5cmx0.3cm，尤，尤，尤，尤其是其是其是其是组织块组织块厚度必需控制在厚度必需控制在厚度必需控制在厚度必需控制在0.3cm0.3cm以内；以内；以内；以内；固定液必需有足固定液必需有足固定液必需有足固定液必需有足够够的量，在体的量，在体的量，在体的量，在体积积上普通大于上普通大于上普通大于上普通大于组织组织2020倍以上，倍以上，倍以上，倍以上，否那么否那么否那么否那么组织组织中心固定不良影响效果；中心固定不良影响效果；中心固定不良影响效果；中心固定不良影响效果；组织组织固定后固定后固定后固定后应应充分水洗。充分水洗。充分水洗。充分水洗。 三薄片样本三薄片样本三薄片样本三薄片样本Thin SamplesThin Samples对于单层培育的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是对于单层培育的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是对于单层培育的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是对于单层培育的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜63XGlyc63XGlyc、100XOil100XOil。四厚片样本四厚片样本Thick Samples对对于厚于厚于厚于厚样样本本本本20202mm2mm在运用中在运用中在运用中在运用中应应留意：留意：留意：留意：盖玻片要盖玻片要盖玻片要盖玻片要贴紧样贴紧样本，不要留有空隙，以免任本，不要留有空隙，以免任本，不要留有空隙，以免任本，不要留有空隙，以免任务间务间隔不隔不隔不隔不够产够产生生生生象差；象差；象差；象差；采用任采用任采用任采用任务间务间隔足隔足隔足隔足够长够长的物的物的物的物镜镜10X10X、20X20X或或或或40X40X，不可以，不可以，不可以，不可以用油用油用油用油镜镜，油，油，油，油镜镜的任的任的任的任务间务间隔短，会隔短，会隔短，会隔短，会顶顶破盖玻片，破盖玻片，破盖玻片，破盖玻片，损损坏坏坏坏样样本，本，本，本，甚至物甚至物甚至物甚至物镜镜，且成像也不明晰；，且成像也不明晰；，且成像也不明晰；，且成像也不明晰；进进展断展断展断展断层层成像会有成像会有成像会有成像会有荧荧光光光光损损失，从而影响失，从而影响失，从而影响失，从而影响图图像的像的像的像的质质量，采取提量，采取提量，采取提量，采取提高高高高检测针检测针孔孔孔孔Pinhole1(AU),Pinhole1(AU),添加激光穿透性；添加激光穿透性；添加激光穿透性；添加激光穿透性；在在在在进进展展展展“Continuous“Continuous扫扫描描描描时时，找到最亮的，找到最亮的，找到最亮的，找到最亮的层层面面面面进进展展展展调调焦焦焦焦调调整相整相整相整相应应参数。参数。参数。参数。五玻片处置和涂胶五玻片处置和涂胶 对对对对易易易易呵呵呵呵斥斥斥斥细细细细胞胞胞胞、组组组组织织织织脱脱脱脱片片片片的的的的问问问问题题题题采采采采取取取取以以以以下下下下两两两两措措措措施施施施，可可可可防防防防止止止止脱片景象出现。脱片景象出现。脱片景象出现。脱片景象出现。 1 1载载载载玻玻玻玻片片片片和和和和盖盖盖盖玻玻玻玻片片片片处处处处置置置置新新新新载载载载玻玻玻玻片片片片上上上上有有有有油油油油污污污污，必必必必需需需需经经经经过过过过清清清清洁洁洁洁液液液液浸浸浸浸泡泡泡泡121224h24h，流流流流水水水水充充充充分分分分漂漂漂漂洗洗洗洗后后后后用用用用蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水清清清清洗洗洗洗5 5遍遍遍遍以以以以上上上上，浸浸浸浸泡泡泡泡在在在在9595酒酒酒酒精精精精内内内内2h2h，用用用用绸绸绸绸布布布布擦擦擦擦干干干干或或或或用用用用红红红红外外外外线线线线烤烤烤烤箱箱箱箱烤烤烤烤干干干干均均均均可可可可，贮贮贮贮放放放放于于于于玻玻玻玻片片片片盒盒盒盒内内内内备备备备用用用用。盖盖盖盖玻玻玻玻片片片片很很很很薄薄薄薄，以以以以上上上上处处处处置置置置程程程程序序序序必必必必需需需需缩缩缩缩短短短短，清清清清洁洁洁洁液液液液浸浸浸浸泡泡泡泡只只只只需需需需2h2h，流流流流水水水水冲冲冲冲洗洗洗洗留留留留意意意意勿勿勿勿损损损损伤伤伤伤玻玻玻玻片片片片等等等等。不不不不主主主主张张张张用用用用烘烤箱枯燥。烘烤箱枯燥。烘烤箱枯燥。烘烤箱枯燥。 2. 2.载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；六自发荧光六自发荧光Autofluorescence首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？淬灭、漂白；淬灭、漂白；淬灭、漂白；淬灭、漂白；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织自发荧光淬灭剂组织自发荧光淬灭剂组织自发荧光淬灭剂组织自发荧光淬灭剂 AutoFluo Quencher AutoFluo Quencher AutoFluo Quencher AutoFluo Quencher 十十. . 定位与定量丈量定位与定量丈量应留意的留意的问题定位：定位：1.Pinhole1.Pinhole尽能尽能够的的为1AU 1AU ；2.2.确确认共定位共定位时要取两个通道要取两个通道荧光光相互关相互关扰的的对照照图像。像。定量：定量：1.1.仪器的各个参数和器的各个参数和样本制造的条本制造的条件必需一致；件必需一致；2.2.必需用原始必需用原始图像像进展定量丈量；展定量丈量；3.Pinhole3.Pinhole尽能尽能够的大。的大。3-D样本制本制备的根本原那么的根本原那么1 1、固定：、固定：2 2、能否需求切片？、能否需求切片？ 激发的穿透力为激发的穿透力为50-500um50-500um 取决于荧光探针对组织的浸透才干。取决于荧光探针对组织的浸透才干。 免疫荧光标志的样本：用震荡切片机切厚片免疫荧光标志的样本：用震荡切片机切厚片3 3、透明、透明 酒精脱水酒精脱水 二甲苯透明二甲苯透明 二甲苯二甲苯+ +少量中性树胶湿封少量中性树胶湿封4 4、封片：、封片： 防止样本变形防止样本变形 防止荧光褪色防止荧光褪色醛类：4%4%中性甲中性甲醛 构造保管好，但抗体浸透差；构造保管好，但抗体浸透差；+ 0.1%Triton+ 0.1%Triton有机溶有机溶剂：丙：丙酮、甲醇、甲醇 有利抗体浸透；部分抗原能有利抗体浸透；部分抗原能够被抽提被抽提