第二节 免疫分析方法及其运用一 放射免疫分析法 利用放射性核素可探测的灵敏性，准确性与抗原抗体反响的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。根本类型和原理 竞争性结合反响：放射免疫分析(RIA-以放射核素标志抗原与反响系统中未标志的抗原竞争特异性抗体的根本原理来测定待检样品中抗原量的分析方法。非竞争性结合反响：免疫放射分析(IRMA)用放射性核素标志的过量抗体非竞争结合抗原，经固相分别，测定待测样品中抗原量的分析方法。2.常用的放射性核素 125I、131I、3H、14C。3. 标志物的制备及鉴定 标志物：是指经过直接或间接的化学反响将放射性核素衔接到被标志分子上锁构成的化合物。要求：高比度、高纯度、完好的免疫活性、不能破坏抗原决议簇。直接标志法铬氨酸残基和组氨残基间接标志法联接标志，引入添加基团标志物的纯化：采用分别的方法离子交换层析法。标志物的鉴定：放射化学纯度、免疫活性、比放射性计算法和本身置换法。4. 放射免疫分析一、原理：Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定， Ag的量为一个系列浓度。竞争结合竞争结合抗原抗体复合物与规范抗原的关系* AgAb复合物的量取决于Ag的量Ag量越大， * AgAb量越少Ag量越小， * AgAb量越大丈量* AgAb量或丈量多余* Ag量可推算出Ag量二. 规范曲线的建立以* AgAb的放射性强度与* Ag的放射性强度的比值或以* AgAb的放射性强度与总放射性强度的比值作纵坐标，规范抗原浓度为横坐标做曲线，得到一条规范曲线。在同样条件下测定样品，计算出抗原抗体复合物的放射性强度与总放射性强度的比值，在规范曲线上找出待测抗原的量。二、丈量步骤恒量的* Ag、Ab参与反响管中参与待测样品、或规范品知浓度37或4 温育参与分别剂分别结合及游离部分测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制造规范曲线待测样品的结合率从规范曲线上求出浓度0 2 4 8 16 32 64 12880 70 60 50 40 30 20 10结结 合合%浓浓 度度二. 免疫放射分析方法单位点IRMA：先将过量的标志抗体与待测抗原进展反响，构成抗原抗体复合物，反响平衡后，用固相抗原结合反响液中剩余的游离标志抗体，然后进展分别，测定抗原抗体复合物的放射量。双位点IRMA：先用固相抗体与抗原反响，然后再用过量的标志抗体与已结合于固相抗原的另外一个抗原决议簇结合，构成抗体-抗原-标志抗体复合物，分别出剩余的标志抗体，测定固相上的放射性。IRMA与RIA的比较对表项目RIAIRMA反应原理竞争性结合非竞争性结合反应参数与待检抗原的关系呈反比呈正比标记物抗原抗体反应速率较慢高特异性较高高灵敏度较高高二. 荧光免疫分析方法荧光免疫技术是以荧光素标志的特异性抗体或抗原作为试剂，用于相应抗体或抗原的分析鉴定和定量测定，主要有荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两种类型。非均相荧光免疫测定法：需求分别抗原抗体复合物和剩余的标志物，然后测定复合物或剩余标志物的量，从而计算出标本中的抗原量。均相荧光免疫测定法：不需求分别复合物与剩余标志物，直接测定剩余的标志物的量，计算出标本中的抗原量。一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的方式从激发态回到基态，这种激发态，以光辐射的方式从激发态回到基态，这种景象称为分子发光，在此根底上建立起来的分析方景象称为分子发光，在此根底上建立起来的分析方法为分子发光分析法法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射方式释放能量分子在退激过程中以光辐射方式释放能量荧光的产生根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：分为以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光原子发射光原子发射光谱法谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反响能激发而发光化学发光：以化学反响能激发而发光化学发化学发光分析法光分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法荧光效率：发射荧光的光量子数与吸收光的光量子数的比值荧光淬灭：处于激发态的电子不能回复到基态，所吸收的能量不能以荧光的方式发射。荧光素：具有光致荧光特性的染料。时间分辨荧光免疫测定法以镧系元素螯合物标志抗体或抗原，利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长一样的荧光分开的技术。原理：镧系元素与螯合物络合，再与抗原或抗体结合，参与荧光加强剂，紫外光照射激发出荧光，进而测定。主要类型；固相双位点夹心法：待测物与固相抗体反响后，再参与Eu3+标志抗体反响，生成Eu3+标志抗体-抗原-固相抗体复合物，所测荧光强度与待测物浓度呈正比。固相抗原竞争法:将大分子抗原包被在固相上成为固相抗原，固相抗原与待测抗原共同竞争限量的Eu3+标志抗体，待测抗原浓度越高，固相抗原结合的标志抗体就越小，所测荧光强度与待测物浓度呈反比。固相抗体竞争法待测抗原和Eu3+标志抗原与固相抗体发生竞争性结合，分别剩余的Eu3+标志抗原与Eu3+标志抗原抗体复合物，在固相中参与加强剂，测定复合物的荧光强度，荧光强度与待测抗原浓度呈反比。TR-FIA的特点：镧系元素螯合物荧光寿命很长；激发光与荧光的波长差别显著。运用：荧光偏振免疫测定法利用物质分子在溶液中旋转速度与分子大小呈反比的特点对荧光抗体进展检测的技术。原理：荧光素标志抗原和待测抗原与抗体发生竞争结合反响，当标志抗原与相应抗体的量恒定时，反响平衡时结合形状的标志抗原量与待测抗原呈反比。荧光偏振的强度与抗原浓度呈反比。以抗原浓度为横坐标，荧光偏振强度为纵坐标作图，建立关系。 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术开展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA如今已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的根底上开展起来的一种新型的免疫测定技术 。 酶联免疫分析法一、根本原理一、根本原理 它采用抗原与抗体的特异反响将待它采用抗原与抗体的特异反响将待测物与酶衔接，然后经过酶与底物产生测物与酶衔接，然后经过酶与底物产生颜色反响，用于定量测定。测定的对象颜色反响，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体免疫吸附剂固相的抗原或抗体免疫吸附剂酶标志的抗原或抗体标志物酶标志的抗原或抗体标志物酶作用的底物显色剂酶作用的底物显色剂 丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，但仍保管其免疫活性，然后加一种抗体抗原但仍保管其免疫活性，然后加一种抗体抗原与酶结合成的偶联物标志物，此偶联物仍保与酶结合成的偶联物标志物，此偶联物仍保管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原抗体反响结合后，上的抗原抗体反响结合后，再加上酶再加上酶的相应底的相应底物，即起物，即起催化水解催化水解或氧化复或氧化复原反响而原反响而呈颜色。呈颜色。 其所生成的颜色深浅其所生成的颜色深浅与欲测的抗原抗体含与欲测的抗原抗体含量成正比。量成正比。 这种有色产物可用肉这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显眼、光学显微镜、电子显微镜察看，也可以用分光微镜察看，也可以用分光光度计酶标仪加以测光度计酶标仪加以测定。定。 其方法简单，方便迅其方法简单，方便迅速，特异性强。速，特异性强。二、酶及其底物二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原, , 半抗原半抗原在交联剂作用下结合的产物。是在交联剂作用下结合的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反响，还具有酶促反响，显示出生物免疫反响，还具有酶促反响，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反响将得到不同的颜色反响. .酶 底底 物物显色色反反应 测定波定波长 辣根辣根过氧化物氧化物酶 邻苯二胺苯二胺四甲替四甲替联苯胺苯胺氨基水氨基水杨酸酸邻联苯甲胺苯甲胺2,2-2,2-连胺基胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐 橘橘红色色黄色黄色棕色棕色兰色色蓝绿色色492492460460449449425425642642碱性磷酸碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸磷酸盐+ +重氮重氮盐 黄色黄色红色色 400400500500葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚甲硫酚嗪+ +噻唑兰 黄色黄色深深蓝色色 405405420420-半乳糖半乳糖苷苷酶 甲基甲基伞酮基半乳糖苷基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光光黄色黄色 360,450360,450420420 ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 一双抗体夹心法一双抗体夹心法二间接法二间接法三竞争法三竞争法 四双位点一步法四双位点一步法五捕获法测五捕获法测IgMIgM抗体抗体六运用亲和素和生物素的六运用亲和素和生物素的ELISA ELISA 一双抗体夹心法一双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体衔接构成固相抗体载体衔接构成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 参与封锁蛋白溶液以封锁载体参与封锁蛋白溶液以封锁载体外表残留的蛋白结合位点外表残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封锁蛋白洗涤并除去未结合的封锁蛋白加受检标本抗原构成加受检标本抗原构成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标志抗体酶标志抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进展加底物进展酶催化反响酶催化反响 根据颜色反响的根据颜色反响的程度进展该抗原程度进展该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标志的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。二间接法二间接法包被固相载体包被固相载体: : 用知抗原包被用知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反响的程度进展根据颜色反响的程度进展该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定三竞争法三竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体于测定抗体 。用知特异性用知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对看管只加一定量酶标抗原对看管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对看管与测定管吸光度值之比，根据对看管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量 对看管由于只加酶标抗原，与固对看管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度那么随待测抗原和测定管的显色程度那么随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，参上结合的酶标抗原量减少。因此，参与底物后显色反响较弱。与底物后显色反响较弱。 4 双位点一步法双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如运用针对抗原分子上两个不同抗原决议簇的在双抗体夹心法测定抗原时，如运用针对抗原分子上两个不同抗原决议簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，那么在测定时可使标本的参与和单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，那么在测定时可使标本的参与和酶标抗体的参与两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反酶标抗体的参与两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反响时间，如运用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。响时间，如运用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的运用使测定抗原的单克隆抗体的运用使测定抗原的ELISA提高到新程度。提高到新程度。五捕获法测五捕获法测IgM抗体抗体血清中针对某些抗原的特异性血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性常和特异性IgG同时存在，后者会同时存在，后者会干扰干扰IgM抗体的测定。因此测定抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将一切血清抗体多用捕获法，先将一切血清IgM包括异性包括异性IgM和非特异性和非特异性IgM固定在固相上，在去除固定在固相上，在去除IgG后再后再测定特异性测定特异性IgM.操作步骤如下：操作步骤如下：1将抗人将抗人IgM抗体衔接在固相载体上，构成固相抗人抗体衔接在固相载体上，构成固相抗人IgM.洗涤。洗涤。2参与稀释的血清标本：保温反响后，血清中的参与稀释的血清标本：保温反响后，血清中的IgM抗体被固相抗抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。3参与特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性参与特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。结合。洗涤。4参与针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反响参与针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反响结合。洗涤。结合。洗涤。5加底物显色：如有颜色显示，那么表示血清标本中的特异性加底物显色：如有颜色显示，那么表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反响。抗体存在，是为阳性反响。六运用亲和素和生物素的六运用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD,每每个分子由个分子由4个亚基组成，可以和个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。个生物素分子亲密结合。如今运用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素如今运用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素strepavidin。生物素。生物素biotin又称维生素又称维生素H,分子量分子量244.31,存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素素-羟基琥珀亚胺酯羟基琥珀亚胺酯biotin-hydroxysuccinimide,BNHS可与蛋白质、糖类和酶等可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子构成生物素化的产物。亲和素与生物多种类型的大小分子构成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反响，但特异性强，亲和力大，两素的结合，虽不属免疫反响，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有个亲和素分子有4个生物素个生物素分子的结合位置，可以衔接更多的生物素化的分子，构成分子的结合位置，可以衔接更多的生物素化的分子，构成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶偶联起来，就可大提高联起来，就可大提高ELISA的敏感度。的敏感度。