细胞生物学实验细胞生物学实验动物石蜡切片的制作及HE染色实验目的1.1.熟悉动物石蜡切片的制作过程。2.2.掌握HE染色的基本原理和染色方法。 实验原理 石蜡切片是最基本的切片技术。苏木精与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法，经过HE染色后，细胞核被苏木精染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 实验用品器材：切片刀，切片机，恒温箱，熔蜡炉，蜡器材：切片刀，切片机，恒温箱，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖杯，酒精灯，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，水浴锅。度计，水浴锅。 药品：卡诺氏固定液、各种浓度的药品：卡诺氏固定液、各种浓度的乙醇乙醇、二甲二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液， 1% 1%伊红酒精伊红酒精溶液，溶液，1%1%盐酸酒精溶液，郝普特氏粘片剂，中盐酸酒精溶液，郝普特氏粘片剂，中性树胶。性树胶。1%1%番红，番红，1%1%固绿固绿材料：鼠肝、肾材料：鼠肝、肾取材取材固定固定脱水脱水透明透明透蜡透蜡包埋包埋修蜡和切片修蜡和切片贴片贴片脱蜡复水脱蜡复水染色染色水洗水洗分化分化漂洗漂洗脱水脱水复染复染脱水脱水镜检镜检封藏封藏石蜡切片制作过程石蜡切片制作过程洗涤洗涤镜检镜检实验步骤（HE染色）1.1.取材：取材： 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝肝 肾肾组组织织. .切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以常以5mm5mm2mm5mm5mm2mm，取下所需要的肝组织，取下所需要的肝组织，切成一小块切成一小块23mm23mm厚。厚。注意事项注意事项1 1、取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化成分、结构等发生变化( (搁置时间过久则产生蛋白质搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构组织活体时的形态结构) )。 2 2、切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分要损伤所需要的部分。实验步骤（HE染色）2.2.固定：固定： 将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入卡诺固定将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定液中固定，固定3050min3050min。注意事项注意事项1 1、一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。2 2、有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。3 3、固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20302030倍，倍，有些水分多的材料，中间应更换有些水分多的材料，中间应更换1212次新液。次新液。4 4、材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。固定的意义采用适当的化学药液采用适当的化学药液采用适当的化学药液采用适当的化学药液固定液浸渍切固定液浸渍切固定液浸渍切固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一胞和组织中的物质成分、终止细胞的一胞和组织中的物质成分、终止细胞的一胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使尽可能保持其活体时的结构。固定能使尽可能保持其活体时的结构。固定能使尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也组织硬化，有利于切片的进行，而且也组织硬化，有利于切片的进行，而且也组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。有媒浸作用，有利于组织着色。有媒浸作用，有利于组织着色。有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的类型固定液可分为单一固定液及混合固定液可分为单一固定液及混合固定液可分为单一固定液及混合固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸、升汞、锇酸马林）、酒精、醋酸、升汞、锇酸马林）、酒精、醋酸、升汞、锇酸马林）、酒精、醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的等，单一固定液不能固定细胞中的等，单一固定液不能固定细胞中的等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不所有成分；混合固定液可以互补不所有成分；混合固定液可以互补不所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有足，常用的混合固定液有足，常用的混合固定液有足，常用的混合固定液有BouinBouin氏氏氏氏液、液、液、液、ZenkerZenker氏液、氏液、氏液、氏液、FAAFAA液、液、液、液、CarnoyCarnoy氏液、氏液、氏液、氏液、SuSaSuSa液。液。液。液。实验步骤（HE染色）3.3.洗涤：洗涤： 75乙醇洗涤三次一般遵循以下三个原则一般遵循以下三个原则: : 1凡用水溶液配制的固定液，特别是含有铬酸、重铬酸钾的固定液，一律用水洗。2凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。3如固定液中含有苦味酸在70酒清中停留稍久时，可除去黄色。如用升汞固定的材料，在洗涤时，须加碘液，可除去汞的结晶。实验步骤（HE染色）4.4.脱水：脱水：脱水：脱水： 洗涤后加入洗涤后加入洗涤后加入洗涤后加入80%80%、90%90%各级乙醇溶液脱水各各级乙醇溶液脱水各各级乙醇溶液脱水各各级乙醇溶液脱水各12120min0min，放入，放入，放入，放入95%95%、100%100%各两次，每次各两次，每次各两次，每次各两次，每次3 30min0min。 注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：1 1、脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。2 2、在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器中的脱水剂，再用吸管吸尽器皿内剩余液，然后于吸管吸出器中的脱水剂，再用吸管吸尽器皿内剩余液，然后于吸管吸出器中的脱水剂，再用吸管吸尽器皿内剩余液，然后于吸管吸出器中的脱水剂，再用吸管吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂皿中加入高一级脱水剂皿中加入高一级脱水剂皿中加入高一级脱水剂。3 3、在低浓度乙醇或纯水中，每级停留不宜太长，否则易使组织变在低浓度乙醇或纯水中，每级停留不宜太长，否则易使组织变在低浓度乙醇或纯水中，每级停留不宜太长，否则易使组织变在低浓度乙醇或纯水中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体软，助长材料的解体软，助长材料的解体软，助长材料的解体。4 4、在高浓度乙醇或无水乙醇中，每级停留的时间也不宜太长，否在高浓度乙醇或无水乙醇中，每级停留的时间也不宜太长，否在高浓度乙醇或无水乙醇中，每级停留的时间也不宜太长，否在高浓度乙醇或无水乙醇中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片则会使组织变脆，影响切片则会使组织变脆，影响切片则会使组织变脆，影响切片。5 5、如需过夜，应停留在如需过夜，应停留在如需过夜，应停留在如需过夜，应停留在70%70%乙醇中。乙醇中。乙醇中。乙醇中。脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。 为什么要脱水？固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。乙醇为常用脱合，水分不脱尽，苯类不能浸入。乙醇为常用脱合，水分不脱尽，苯类不能浸入。乙醇为常用脱合，水分不脱尽，苯类不能浸入。乙醇为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从到高浓度递增的顺序进行，通常从到高浓度递增的顺序进行，通常从到高浓度递增的顺序进行，通常从3030或或或或5050乙醇开始，经乙醇开始，经乙醇开始，经乙醇开始，经7070、8585、9595直至无水乙醇，直至无水乙醇，直至无水乙醇，直至无水乙醇，每次时间为每次时间为每次时间为每次时间为1 1数小时，如不能及时进行各级脱数小时，如不能及时进行各级脱数小时，如不能及时进行各级脱数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在水，材料可以放在水，材料可以放在水，材料可以放在7070乙醇中保存，因高浓度乙乙醇中保存，因高浓度乙乙醇中保存，因高浓度乙乙醇中保存，因高浓度乙醇易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、醇易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、醇易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、醇易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。实验步骤（HE染色）5.5.透明：透明： 无水乙醇、二甲苯等量混合液无水乙醇、二甲苯等量混合液15min15min，二甲苯，二甲苯0.5h0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。（或至透明为止），须换一次二甲苯。注意事项：注意事项：使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。的水分进入。更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。在透明过程中，在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回无水乙醇说明材料中的水未被脱净，应退回无水乙醇中重新脱水，然后再透明。中重新脱水，然后再透明。为什么要透明？无水乙醇不能与石蜡相溶，还需用能与无水乙醇不能与石蜡相溶，还需用能与乙醇乙醇和石蜡相和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍剂各半的混合液浸渍1 12 2小时，再转入纯透明剂中浸渍。小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。易切出完整切片，最长为数小时。实验步骤（HE染色）6.6.透蜡：透蜡： 放入二甲苯和石蜡各半的混合液放入二甲苯和石蜡各半的混合液15-20min15-20min，再放，再放入石蜡入石蜡、石蜡、石蜡 透蜡各透蜡各20302030分钟。透蜡的目的分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在保持箱内温度在55605560左右，注意温度不要过高，左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱以免组织发脆。置于恒温箱0.5h0.5h。注意事项：注意事项：尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 脱水、透明、染色都在染色缸内进行实验步骤（HE染色）7.7.包埋：包埋： 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。立刻降温凝固成蜡块。 注意注意事项：事项：用于包埋的石蜡的熔点在用于包埋的石蜡的熔点在50605060之之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为的石蜡熔点为52565256，植物材料用的石蜡熔点，植物材料用的石蜡熔点为为54585458。 石蜡、蜡杯、蜡杯钳为什么透蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍液浸渍1 12 2小时，再先后移入小时，再先后移入2 2个熔化的石蜡液中浸渍个熔化的石蜡液中浸渍3 3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3 3左右的温箱中进行，左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56565858或或60606262两两种，可根据季节及操作环境温度来选用。种，可根据季节及操作环境温度来选用。制作包埋盒实验步骤（HE染色）8.8.修蜡：修蜡：修蜡：修蜡： 切片之前要把包埋好的蜡快修成梯形切片之前要把包埋好的蜡快修成梯形。9、 切片切片切片切片： （1） 将已修好的石蜡固定在台木上装在切片机的夹物台上将已修好的石蜡固定在台木上装在切片机的夹物台上。 （2） 摇动推动螺旋摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口但不可超过刀口。 （3） 调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为410410微米。微米。 （4） 一切调整好后可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块一切调整好后可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以4050r/min4050r/min。切成的蜡带到。切成的蜡带到2030cm2030cm长时，右手用另一支毛长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。（5） 用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。放大镜或显微镜下观察切片是否良好。（6） 切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 实验步骤（HE染色）10.10.贴片：贴片：取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹均匀。后用洗净的手指加以涂抹均匀。滴滴1212滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在在40454045）。此时蜡片因受热而伸展摊平。）。此时蜡片因受热而伸展摊平。展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于3737温箱温箱烘干，烘干，一昼夜干燥后即一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。可取出存放于切片盒待染。粘片剂的种类n n明胶液n n郝普特氏粘片剂n nLand氏液n n梅氏蛋白质实验步骤（HE染色）11.脱蜡复水： 石蜡切片经二甲苯、脱蜡各510min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级乙醇溶液中各35min，再放入蒸馏水中3min。 注注意：意：染色液多数为水溶液，因此，染色前必须染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多水浸蜡要短的多。实验步骤（HE染色） 12.染色： 切片放入苏木精中染色约1030min。注意注意：染色时间应根据染色剂的成染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色季室温低时可放入恒温箱中染色。实验步骤（HE染色）13.水洗： 以流水冲洗使切片显示蓝色为宜，但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。 实验步骤（HE染色）14.14.分化：分化： 分分化化就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明。将切片放入更加鲜明。将切片放入1%1%盐酸乙醇液中褪色，盐酸乙醇液中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。钟。注意注意：这一步骤是这一步骤是H.E.H.E.染染色成败的关键，如分化色成败的关键，如分化不当会导致染色不匀，或不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，效果差。如果染色适中，可取消此步骤。可取消此步骤。实验步骤（HE染色）15.15.漂洗：漂洗： 切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。馏水中漂洗一次。 16.16.脱水脱水： 切片入切片入50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇80%80%乙醇中各乙醇中各35min35min。17.17.复染：复染： 用用0.5%0.5%伊红乙醇液对比染色伊红乙醇液对比染色25min25min。 注意注意注意注意：伊红主要染细胞质，着色浓伊红主要染细胞质，着色浓伊红主要染细胞质，着色浓伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质合，如果细胞核染色较浓，细胞质合，如果细胞核染色较浓，细胞质合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反也应浓染，以获得鲜明的对比。反也应浓染，以获得鲜明的对比。反也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质之，如果细胞核染色较浅，细胞质之，如果细胞核染色较浅，细胞质之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色着色，并且经乙醇脱水时不易褪色着色，并且经乙醇脱水时不易褪色着色，并且经乙醇脱水时不易褪色实验步骤（HE染色）18.18.镜检镜检 如果需要制作永久切片，第如果需要制作永久切片，第1717步完成以后做以下步骤。步完成以后做以下步骤。19.19.脱水脱水： 放入放入95%95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中35min35min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。 19.19.透明：透明： 切片放入二甲苯切片放入二甲苯- -乙醇等量混合液中约乙醇等量混合液中约5min5min，然后放入，然后放入纯二甲苯纯二甲苯、中各中各35min35min。二甲苯应尽量保持无水，。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。 实验步骤（HE染色）20.20.封藏：中性树胶封存封藏：中性树胶封存 封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。学生实验结果：小鼠脾脏纵切永久切片学生实验结构：小鼠肾脏横切永久切片