液相色谱固定相种类、性质、液相色谱固定相种类、性质、选择原那么和适用范围选择原那么和适用范围主要内容主要内容基质及其种类基质及其种类1硅胶硅胶2氧化铝氧化铝3聚合物聚合物4化学键合固定相化学键合固定相5基质及其种类基质及其种类基质担体基质担体无机物基质无机物基质 ：刚性大，在溶剂刚性大，在溶剂中不容易膨胀。中不容易膨胀。有硅胶、羟基磷有硅胶、羟基磷灰石、石墨化碳、灰石、石墨化碳、氧化铝、氧化钛氧化铝、氧化钛以及氧化锆等金以及氧化锆等金属氧化物属氧化物1有机聚合物基质有机聚合物基质 ：刚性小、易紧缩，：刚性小、易紧缩，溶剂或溶质容易渗溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最结果减少传质，最终使柱效降低。主终使柱效降低。主要有交联苯乙烯要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。丙烯酸酯。 1 Xue Z D, He F, Feng Y Q. Wuhan University Journal, 2019, 48( 2): 142基质及其种类基质及其种类硅胶硅胶氧化氧化铝聚合物聚合物基基基基质质的种的种的种的种类类硅胶硅胶性质：性质： 硅胶是硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。硅胶除了具有良好的填料中最普遍的基质。硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的孔构造和比外表积、较好的化学稳定机械强度、容易控制的孔构造和比外表积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专注的外表化学反响等优点外性和热稳定性以及专注的外表化学反响等优点外2 , 还有一还有一个突出的优点就是其外表含有丰富的硅羟基个突出的优点就是其外表含有丰富的硅羟基, 这是硅胶可以这是硅胶可以进展外表化学键合或改性的根底进展外表化学键合或改性的根底3。缺陷是在碱性水溶性流。缺陷是在碱性水溶性流动相中不稳定。动相中不稳定。2 Kamahara M, N akamura H, Naka jima T. Anal Sc,i 1989,5: 4853 W ang J D, Shang Z H, Yu Y L. Method of H igh Efficient L iquid Chromatog raphy. Be ijing: China Petroleum and Chemistry Press ，1992: 107适用范围：适用范围： 硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。通常，硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。通常，硅胶基质的填料引荐的常规分析硅胶基质的填料引荐的常规分析pHpH范围为范围为2828。 硅胶硅胶1. 高高纯纯度的多孔球形硅胶基度的多孔球形硅胶基质质全多孔球形硅胶的制全多孔球形硅胶的制备备步步骤骤: 反响反响 凝胶凝胶 老化老化 洗洗涤涤 浸泡浸泡 枯燥枯燥 焙焙烧烧 4。制制备备方法分方法分为为四四类类: 堆砌硅珠堆砌硅珠法法 5、两相法、两相法 6、喷雾喷雾枯燥枯燥法法7和生物囊法和生物囊法8。 4 Yang X L, W ang J D, Xiong B H. Chinese Journal of chromatography,2000,18( 4): 308 5 Lu Z R. Chemical Reagents ,2019, 17( 5): 279 6 Unger K, Shick K alb J, P at G. G er 2155281, 1971 7 BergnaH E, Kirkland J J. US 4131542, 1978 8 L iX H. PhD D issertation. Beij ing: Institute of Chemistry, CAS ,19949 Lu Z R. Chemical Reagents (陆志仁. 化学试剂), 2019, 17( 5): 279图图1堆砌硅珠法消费硅胶的流程图堆砌硅珠法消费硅胶的流程图9硅胶硅胶图图2 硅球电镜图硅球电镜图10 10 蒋生祥，刘霞.硅胶基质高效液相色谱固定相J.Chinese Journal of Chromatography,2019, 25( 2): 164硅胶硅胶2硅胶基质键合正相色谱固定相硅胶基质键合正相色谱固定相33 硅胶基质键合反相色谱固定相硅胶基质键合反相色谱固定相44 硅胶基质手性色谱固定相硅胶基质手性色谱固定相4.1 多糖手性固定相多糖手性固定相 韩韩小茜等用小茜等用这这种固定相种固定相对对甲霜灵甲霜灵进进展了半制展了半制备备11 , 拆分拆分了了农药农药三三唑唑西西酮酮、戊菌、戊菌唑唑、己、己唑唑醇及醇及烯唑烯唑醇醇对对映体映体 12。张红张红丽丽等等13 和和罗兴罗兴平等平等14在在纤维纤维素素 三三( 3, 5二甲基苯基氨基二甲基苯基氨基甲酸甲酸酯酯) (CDMPC)上分上分别进别进展了分析和半制展了分析和半制备备雷雷诺嗪诺嗪的的HPLC方法研方法研讨讨. 11 H an X Q, Zhou Z Q, L iu C H, L iY M, Chen L R. Journal of Instrumental Analy sis (韩小茜, 周志强, 柳春辉, 李永民, 陈立仁. 分析测试学报), 2019, 21( 5 ): 40 12 H an X Q, W en X G, Guan YH, Chen L R. Chinese Journal of Applied Chemistry (韩小茜, 温晓光, 管永红, 陈立仁.运用化学), 2019, 21( 2 ): 14013 Zhang H L, L iX Y, Liu C H, Zhao Y F, L iYM, Chen L R.Chinese Journa l of Ana ly tical T esting and Instruments (张红丽, 李晓艳, 柳春晖, 赵艳芳, 李永民, 陈立仁. 分析测试与仪器), 2019, 10( 3 ): 151 14 Luo X P, Zhai Z D, Wu X M, Shi Y P, Chen L R, Li YM.J Sep Sc,i 2019, 29: 164硅胶硅胶4.2 大环手性固定相大环手性固定相 Hirose等等 15, 16 制备了含有制备了含有1 苯基苯基 1, 2 乙二醇乙二醇和和1 苯基苯基 1, 2 环己二醇手性单元的苯并环己二醇手性单元的苯并18 冠冠 6 手性手性固定相固定相, 对一些氨基酸和脂肪胺进展了拆分。对一些氨基酸和脂肪胺进展了拆分。Farkas 等等17 合成了吡啶并合成了吡啶并18 冠冠 6手性固定相手性固定相, 拆分了萘乙胺、苯丙氨拆分了萘乙胺、苯丙氨酸及丙氨酸和蛋氨酸的衍生物。酸及丙氨酸和蛋氨酸的衍生物。4.3 刷型手性固定相刷型手性固定相 Pirkle研研讨讨小小组组先后制先后制备备了了酸型的酸型的(R ) 苯甘氨酸的二硝苯甘氨酸的二硝基基苄酰苄酰(简简称称DNB)衍生物衍生物CSP ( DNBPG CSP )和和(R )亮氨酸亮氨酸的的DNB 衍生物衍生物CSP( DNB Leucine CSP)。这这一一类类型固定相被型固定相被称称为为第二代刷型手性固定相第二代刷型手性固定相, 它它们们能拆分很多能拆分很多带带有有烷烷基、基、醚醚基或基或氨基取代的氨基取代的给电给电子芳香子芳香环环的的对对映体。映体。 15 HiroseK, N akamura T, N ishioka R, U eshige T, T obea Y.Te trahedron Le tters, 2019, 44( 8 ): 1 549 16 HiroseK, Yongzhu Z, N akamura T, N ishioka R, UeshigeT, T obe Y. J Chromatog rA, 2019, 1 078: 35 17 Viktor F, T unde T, G yorgy O, Pete r H, M ik lo H. T etrahedron: Asymme try, 2019, 17( 12 ): 1 883硅胶硅胶5. 硅胶基硅胶基质键质键合离子色合离子色谱谱固定相固定相5.1硅胶基硅胶基质键质键合阴离子色合阴离子色谱谱固定相固定相5.2硅胶基硅胶基质键质键合阳离子色合阳离子色谱谱固定相固定相5.3阴阳离子同阴阳离子同时时分分别别的硅胶基的硅胶基质质固定相固定相5.4离子液体修离子液体修饰饰的硅胶基的硅胶基质质离子色离子色谱谱固定相固定相 把甲基咪把甲基咪唑唑 18键键合在合在经过经过氯氯丙基三甲氧基丙基三甲氧基硅硅烷试剂烷试剂硅硅烷烷化后的硅胶上制化后的硅胶上制备备了一种离子液体了一种离子液体键键合合硅胶固定相硅胶固定相, 键键合步合步骤骤如如图图3 所示。所示。该该固定相是一种固定相是一种强强阴离子交阴离子交换换固定相固定相, 可以很好地可以很好地对对无机、无机、有机阴离子有机阴离子进进展分展分别别, 分分别别度度大大, 柱效高。柱效高。图3.N甲基咪唑键合硅胶色谱固定相的制备 18 18 Q iu H D, Jiang S X, L iu X. J Chroma togrA, 2019, 1 103:2655.5硅胶整体柱离子色硅胶整体柱离子色谱谱固定相固定相 Xu等等 19 那么将十二那么将十二烷烷基硫酸基硫酸锂锂(L iDS)涂敷在涂敷在C18硅硅胶整体柱上胶整体柱上,快速分快速分别别了雨水中的了雨水中的H+ , Mg2+ 和和Ca2 + 。Lucy等等 20采用涂敷有外表活性采用涂敷有外表活性剂剂十二十二烷烷基二甲基溴化基二甲基溴化铵铵(DDAB)的短的的短的( 0.5 1 cm )硅胶整体柱硅胶整体柱, 用于低用于低压压下常下常见见无机阴离子无机阴离子的分的分别别。6.硅胶基硅胶基质质无机改性的色无机改性的色谱谱固定相固定相 敦惠娟等敦惠娟等 21, 22 利用利用LbLSA 方法在多孔硅胶微球外方法在多孔硅胶微球外表表组组装多装多层纳层纳米氧化米氧化锆颗锆颗粒粒, 制制备备了比外表了比外表积为积为172.53m2 /g、孔体孔体积为积为0.378 4 cm3 /g、具有良好化学、具有良好化学稳稳定性定性ZrO2/SiO2 核壳型色核壳型色谱谱填料填料, 并并对对其其进进展了表征。展了表征。 19 Xu Q, MoriM, Tanaka K, IkedoM, HuW Z. JChromatog r A, 2019, 1 026: 191 20 Pelletier S, Lucy C A. J Chromatogr A, 2019, 1 118: 12 21 Dun H J, Song X Q, We iY, Li YM, Chen L R. Chemical Journal of Chinese Universities (敦惠娟, 宋秀芹, 魏雨,李永民, 陈立仁. 高等学校化学学报), 2019, 24 ( 12 ):2 192 22 Dun H J, ZhangW Q, We iY, Song X Q, L iY M, Chen LR. Ana lChem, 2019, 76: 5 016硅胶硅胶硅胶硅胶 ZrO2 /SiO2 的制备工艺为的制备工艺为: ( 1)将酸化过的色谱用将酸化过的色谱用SiO2 球球浸入到十二烷基硫酸钠浸入到十二烷基硫酸钠( SDS)外表活性剂溶液中外表活性剂溶液中, 待在待在SiO2 球外表组装一层有机单分子膜球外表组装一层有机单分子膜后取出后取出, 洗去外表物理吸附成分洗去外表物理吸附成分, 枯燥。枯燥。( 2)将已被膜包覆的将已被膜包覆的SiO2 球放入氧化锆溶胶中球放入氧化锆溶胶中, 磁力搅拌磁力搅拌3 h后分别后分别, 用去离子水充分洗用去离子水充分洗涤涤, 枯燥。反复进展枯燥。反复进展( 1)、(2 )步步骤多次。骤多次。( 3)将制备的将制备的ZrO2 /有有机膜机膜/SiO2 球在一定温度下焙烧球在一定温度下焙烧后得后得ZrO2 /SiO2 核壳型色谱核壳型色谱填料填料, 制备工艺表示图见图制备工艺表示图见图4。图4 外表多层纳米氧化锆包覆硅球的制备步骤 23 23 Dun H J, ZhangW Q, We iY, Song X Q, L iY M, Chen LR. Ana lChem, 2019, 76: 5 016性质：性质： 具有与硅胶一样的良好物理性质，也能耐较大的具有与硅胶一样的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过如今曾经出现了在水相中稳定的氧化铝键稳定。不过如今曾经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的合相，并显示出优秀的pH稳定性。稳定性。 氧化铝氧化铝聚合物聚合物性质：性质： 以高交联度的苯乙烯以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的，它们的压力限制比无机填料低。苯乙烯压力限制比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水二乙烯苯基质疏水性强。运用任何流动相，在整个性强。运用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以范围内稳定，可以用用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以经过二乙烯苯疏水性更强，但它可以经过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以接受在二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以接受在pH13下反下反复冲洗。复冲洗。 适用范围： 聚合物基质广泛用于分别大分子物质。聚合物聚合物交交联聚苯乙聚苯乙烯 交交联聚苯乙聚苯乙烯微球是运用最微球是运用最为广泛的一种有机基广泛的一种有机基质色色谱固定相具有不溶解于各种有机溶固定相具有不溶解于各种有机溶剂在在pH 为114 的溶的溶剂环境中具有很高的化学境中具有很高的化学稳定性及介定性及介质外外表不存在自在离子等表不存在自在离子等优良特性。良特性。固定相合成：固定相合成： 将将 7.0g 氯甲基化聚苯乙甲基化聚苯乙烯树脂用脂用10ml 四四氢呋喃喃溶溶胀1h 然后参与然后参与40ml 乙二胺在乙二胺在70 反响反响24h 反响物反响物冷却后抽冷却后抽滤洗洗涤枯燥得到乙二胺枯燥得到乙二胺树脂脂I ，称取乙二胺，称取乙二胺树脂脂3.5g, 80ml 含含2%葡萄糖酸内脂的乙醇溶液一葡萄糖酸内脂的乙醇溶液一同参与反响瓶中同参与反响瓶中80下反响下反响24h 抽抽滤并依次用甲醇水并依次用甲醇水洗洗涤得到排阻色得到排阻色谱固定相固定相II。2424卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分别中的运用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448聚合物聚合物 该微球外表呈现强的疏水作用作为固定相可直接运用于反相色谱和以有机溶剂为流动相的排阻色谱中如用于以盐水为流动相的排阻色谱分别就必需对其外表进展化学改性.键合相制备过程24 ：PCH2Cl+H2NCH2CH2NH2PCH2NHCH2CH2NH2+HCl O ( I )( I )+OC(CHOH)3CHOCH2OHPCH2NHCH2CH2NHCO(CH OH)4CH2OH ( II ) P 表示树脂骨架24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分别中的运用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448聚合物聚合物 图5 是当流是当流动相从相从纯水向水向纯THF 变化化时未改性未改性(a )和和键合合了了 葡萄糖酸内葡萄糖酸内酯的聚的聚氯甲基甲基苯乙苯乙烯色色谱柱柱(b) 的柱的柱压降随降随时间的的变化化图。未改性的色。未改性的色谱柱柱在流在流动相相组成成变化化过程中柱程中柱压变化很大化很大阐明了填料的溶明了填料的溶胀程程度度较大。由大。由图可知，改性可知，改性树脂脂在水中的溶在水中的溶胀才干加才干加强。图5.聚氯甲基苯乙烯色谱柱的柱压降随时间的变化图 24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分别中的运用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448聚合物聚合物 图6是是 Lact、 Myo 和和Fer 在在II 树脂固定相上保管脂固定相上保管时间与流与流动相中硫酸相中硫酸钠浓度的关系可以看度的关系可以看出三种蛋白出三种蛋白质在硫酸在硫酸钠度度为00.50mol/L 范范围内保管内保管时间几几乎没有乎没有变化化这进一步一步证明了前述明了前述的蛋白的蛋白质与固定相之与固定相之间静静电作用作用力和疏水作用均很弱的力和疏水作用均很弱的结论阐明明合成的合成的II 型型 SEC 柱接近于理想柱接近于理想的的SEC 柱。柱。图6： Lact、 Myo 和Fer 在II 树脂固定相上保管时间与流动相中硫酸钠浓度的关系24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分别中的运用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448聚合物聚合物 图7 是是铁蛋白蛋白 乳球蛋白乳球蛋白和和细胞色素胞色素C 在以在以Tris 缓冲液冲液为流流动相固定相相固定相为II 型型树脂的脂的SEC 分分别图，三种蛋白，三种蛋白质的分子的分子量依次量依次为440,000 35,000 和和12,000 道道尔顿三种蛋白三种蛋白质的洗脱的洗脱次序与分子量大小的次序一致次序与分子量大小的次序一致阐明蛋白在明蛋白在II 型固定相上的分型固定相上的分别遵遵照排阻色照排阻色谱分分别机理。机理。图7 是铁蛋白 乳球蛋白和细胞色素C 在以Tris 缓冲液为流动相固定相为II 型树脂的SEC 分别图1. Fer； 2. b-Lact; 3. Cyt-C 24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分别中的运用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448基质的选择基质的选择硅胶基质：用于大部分的硅胶基质：用于大部分的HPLC分析，尤其是小分分析，尤其是小分子量的被分析物；子量的被分析物；聚合物：用于大分子量的被分析物质，主要用来制聚合物：用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。成分子排阻和离子交换柱。聚合物聚合物化学键合固定相化学键合固定相1.键合相的性质特点：键合相的性质特点： 将有机官能团经过化学反响共价键合到硅胶外表将有机官能团经过化学反响共价键合到硅胶外表的游离羟基上而构成的固定相称为化学键合相。这类的游离羟基上而构成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以经过改动固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以经过改动键合相有机官能团的类型来改动分别的选择性。键合相有机官能团的类型来改动分别的选择性。 2键键合相的种合相的种类类 键合相合相极性键合相极性键合相 ：氰基：氰基(-CN)、氨基、氨基(-NH2)和和二醇基二醇基(DIOL)键合相键合相 。非极性键合相非极性键合相 ：各种烷基：各种烷基(C1C18)和苯和苯基、苯甲基等，以基、苯甲基等，以C18运用最广。运用最广。 极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分别主要是基于极性键合基团与溶质分子间的相上的分别主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保管值较大。极性键合相有氢键作用，极性强的组分保管值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。时也可作反相色谱的固定相。 非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保管值和分别选择性都有影响，普通来说，样品容量随管值和分别选择性都有影响，普通来说，样品容量随烷基链长添加而增大，且长链烷基可使溶质的保管值烷基链长添加而增大，且长链烷基可使溶质的保管值增大，并经常可改善分别的选择性；但短链烷基键合增大，并经常可改善分别的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分别极性化合物时可得到对称相具有较高的覆盖度，分别极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质类似。质类似。 化学键合固定相化学键合固定相3固定相的固定相的选择选择化学键合固定相化学键合固定相 分别中等极性和极性较强的化合物 分别非极性和极性较弱的化合物 极性键合相极性键合相 非极性键合相非极性键合相