动物细胞工程动物细胞工程动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备动物细胞核移植动物细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程动物细胞工程的基础的基础v动物细胞工程常用的技术手段又有哪些呢？动物细胞工程常用的技术手段又有哪些呢？ 就是从动物机体中取出就是从动物机体中取出相关组织相关组织，将，将它分散成它分散成单个细胞单个细胞，然后，放在，然后，放在适宜的培适宜的培养基养基中，让这些细胞中，让这些细胞生长和增殖生长和增殖。1、概念：、概念：一、动物细胞培养一、动物细胞培养2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶或胰蛋白酶或胶原蛋白酶胶原蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液10代代细胞细胞部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成动物体最终培养成动物体50代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系3.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：代谢旺盛，分化程度低，代谢旺盛，分化程度低，增殖能力强，容易培养增殖能力强，容易培养去掉组织去掉组织间蛋白间蛋白3、动物细胞培养过程中几个重要的概念、动物细胞培养过程中几个重要的概念（1） 细胞贴壁：细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层单层）。）。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。（2） 接触抑制：接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时表面相互接触时，细胞，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。制。正常动物细胞培养特点正常动物细胞培养特点： 贴壁生长、接触抑制贴壁生长、接触抑制（3）原代培养）原代培养 严格的说，即从体内取出组织分散为单个细胞严格的说，即从体内取出组织分散为单个细胞后，接种培养到第一次传代的这个后，接种培养到第一次传代的这个初次培养阶段；初次培养阶段；通常也通常也把第把第1 1代代细胞的培养与胞的培养与传10代以内的代以内的细胞培胞培养养统称称为原代培养原代培养。（4）传代培养）传代培养 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后, , 用用胰蛋胰蛋白酶白酶处理处理, ,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下来下来, ,然后加入新的然后加入新的培养液培养液, ,将将细胞分离稀释细胞分离稀释, ,并并从原培养瓶内转接到新从原培养瓶内转接到新的培养瓶内培养的培养瓶内培养, ,这个过程称这个过程称传代培养。（传代培养。（分瓶培分瓶培养的过程养的过程） （5 5）细胞株：细胞株： 从原代培养细胞群中筛选出进行从原代培养细胞群中筛选出进行传代培传代培养的细胞养的细胞，能传到，能传到40-5040-50代，其代，其遗传物质没有遗传物质没有发生变化。发生变化。 （6 6）细胞系：细胞系： 传到传到40-5040-50代后有代后有部分细胞遗传物质发生部分细胞遗传物质发生了变化了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限无限传代传代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系各个新名词之间的联系各个新名词之间的联系细胞贴附在培养瓶内细胞贴附在培养瓶内壁表面上生长和分裂壁表面上生长和分裂随细胞增多，细胞间相互接触就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞间相互接触就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变遗传物质未改变遗传物质未改变1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养 （葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、维（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、维生素、微量元素、动物血清等）生素、微量元素、动物血清等）3、温度和、温度和PH 温度温度36.5+0.5度，度，pH7.27.44、气体环境、气体环境95%空气空气+5%CO2，O2是细胞代谢所必需的，是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的的主要作用是维持培养液的pH。 4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件保证细胞顺利保证细胞顺利的生长增殖的生长增殖离体培养的细胞对离体培养的细胞对微生物和有毒物质微生物和有毒物质没有防御能力没有防御能力5 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用（1 1）生产蛋白生物制品：）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体单克隆抗体等。等。（3 3）用于）用于检测有毒物检测有毒物质质（2 2）获得大量自身的）获得大量自身的皮肤细胞皮肤细胞，用于植皮。，用于植皮。（4 4）用于生理、病理、药理等方面的研究，）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据为治疗和预防疾病提供理论依据（5 5）作为基因工程的受体细胞）作为基因工程的受体细胞获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清促生长因子促生长因子蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目6 6、植物细胞和动物细胞培养的比较、植物细胞和动物细胞培养的比较 1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是变的细胞是 - -（ ） A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 - -（）（） A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养AD3 3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （ ） A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性 C. C.取材十分方便取材十分方便 D D分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D 4. 4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（ ） A.A.培养基不同；培养基不同； B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行； C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D.D.动物细胞培养只能得到大量细胞，而植物动物细胞培养只能得到大量细胞，而植物 细胞能培养成植株。细胞能培养成植株。A二、克隆技术二、克隆技术1、概念：克隆就是、概念：克隆就是无性繁殖无性繁殖，具体地说，是，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群出来的一群遗传特性相同遗传特性相同的的DNA分子、细胞分子、细胞或个体或个体。a.分子水平上：分子水平上：一般指一般指DNA克隆。克隆。b.细胞水平上：细胞水平上：指一个单一的细胞分裂所形指一个单一的细胞分裂所形成的成的细胞群体细胞群体。c.个体水平上：个体水平上：指基因型完全相同的两个或指基因型完全相同的两个或两个以上个体。两个以上个体。2、克隆的条件：、克隆的条件：a.具有物种具有物种完整基因组完整基因组的细胞核的的细胞核的活细胞活细胞（如：（如：乳腺上皮细胞乳腺上皮细胞）b.能有效调控细胞核发育的能有效调控细胞核发育的细胞质物质细胞质物质（去核的去核的卵细胞质卵细胞质）。）。c.完成胚胎发育必要的环境条件（完成胚胎发育必要的环境条件（诱导核诱导核-质重组细质重组细胞生长、分化的实验条件和怀孕母体的子宫环境胞生长、分化的实验条件和怀孕母体的子宫环境）。）。3、技术基础：、技术基础：1.植物克隆的技术基础是植物克隆的技术基础是组织培养组织培养2.动物克隆的技术基础是动物克隆的技术基础是动物细胞培养动物细胞培养 1. 概念：概念：将动物的一个细胞的将动物的一个细胞的细胞核细胞核，移入一个已，移入一个已经去掉细胞核的经去掉细胞核的卵母细胞卵母细胞中，使其重组并发育成一中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。核移植核移植动物体物体细胞分化程度高，恢胞分化程度高，恢复其全能性十分困复其全能性十分困难三、动物体细胞核移植技术三、动物体细胞核移植技术胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复细胞分化程度低，恢复全能性容易全能性容易用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称为克隆动物2、原理：原理： 动物细胞动物细胞核核具有全能性具有全能性（哺乳（哺乳动物）动物）3、类型：、类型：卵母细胞卵母细胞（受体细胞）（受体细胞）黑面母绵羊黑面母绵羊( (受体动物) )白面母绵羊白面母绵羊( (供体动物) )乳腺细胞乳腺细胞（供体细胞（供体细胞) )去核卵去核卵母细胞母细胞供体核供体核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠重组细胞重组细胞4.体细胞核移植过程体细胞核移植过程1.1.）克隆羊多利培育过程：）克隆羊多利培育过程：代孕动物特别注意：特别注意：1.1.克隆动克隆动物性状与供体动物完物性状与供体动物完全一样吗？全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒的遗传物质（如线粒体体DNADNA）来自于受体卵）来自于受体卵母细胞母细胞. .二、生物的性状不仅二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还与遗传物质有关，还受环境的影响。受环境的影响。2. 受体动物、供体动受体动物、供体动物、代孕动物性别有物、代孕动物性别有要求吗？要求吗？（M卵母细胞）卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞受体细胞激活，受体细胞激活，完成细胞分裂、完成细胞分裂、发育发育胚胎移植胚胎移植2）克隆牛的培育过程）克隆牛的培育过程取供体细胞传代取供体细胞传代培养培养1010代以内的代以内的细胞细胞. .为什么？为什么？供体细胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞采集培养卵母细胞采集培养卵母细胞（M中期：供质中期：供质）去核去核去核卵去核卵母细母细胞胞注入注入细胞融合细胞融合重重组组细细胞胞构建重组构建重组胚胎胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母体代孕母体生出与生出与供体供体奶奶牛遗传基础相牛遗传基础相同的犊牛同的犊牛归纳归纳:1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植和胚胎移植核移植和胚胎移植（胎生动物）（胎生动物）2.受体细胞：受体细胞：卵细胞、受精卵、卵细胞、受精卵、M期卵母细胞（常用）期卵母细胞（常用）3.取卵母细胞作受体细胞的取卵母细胞作受体细胞的原因原因是是:含有促使细胞核表达含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件全能性的物质和营养条件；它是最大的细胞；它是最大的细胞,易操作易操作。核移植流程核移植流程:电刺电刺激法激法激活激活方法：化学法，物理法方法：化学法，物理法目的：使其完成细胞分裂和发育目的：使其完成细胞分裂和发育5、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植器官的移植6、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题胚胎移植动物幼体产出胚胎移植动物幼体产出 概率概率10克隆动物存在着健康问题克隆动物存在着健康问题克隆动物的食品安全性问题存在争议克隆动物的食品安全性问题存在争议黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重组细胞早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫克隆羊克隆羊1 1、写出、写出abab所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a a表示：表示：b b表示表示: : 2 2、实施细胞工程时，所需受体、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面雌绵羊的基因型为、若黑面雌绵羊的基因型为AA,AA,白面白面雄绵羊的基因型为雄绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊的基，则克隆羊的基因型为：因型为： 性别为：性别为： 核移植技术核移植技术胚胎移植技术胚胎移植技术白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aaaa雄性雄性1、概念：也称、概念：也称 ，是指，是指 或或 动物细动物细胞结合形成一个细胞的过程。形成的具有原来两个或胞结合形成一个细胞的过程。形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的多个细胞遗传信息的单核细胞单核细胞称为称为 。细胞杂交细胞杂交两个两个多个多个杂交细胞杂交细胞四、动物细胞融合四、动物细胞融合2 2、原理：、原理： 膜的流动性膜的流动性3.3.动物细胞融合过程：动物细胞融合过程：细胞膜穿通细胞膜穿通细胞膜融合细胞膜融合细胞核融合，形成细胞核融合，形成单核单核杂种细胞杂种细胞不同不同DNA的两个的两个或以上细胞或以上细胞 灭活的病灭活的病 毒或毒或PEG诱导诱导细细胞融合胞融合完成的完成的标志标志: :细胞核细胞核融合成融合成一个核一个核5 5、最有价值的应用：、最有价值的应用： 制备单克隆抗体制备单克隆抗体4、意义：、意义：克服了远缘杂交不亲和性障碍克服了远缘杂交不亲和性障碍。植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞融合胞融合融合融合原理原理细胞膜的流胞膜的流动性、性、细胞胞的全能性的全能性细胞膜的流胞膜的流动性性融合融合方法方法用用纤维素素酶酶、果胶、果胶酶酶去去除除细胞壁后胞壁后诱导原生原生质体融合体融合用用胰蛋白胰蛋白酶酶或胶原蛋白或胶原蛋白酶酶使使细胞分散后，胞分散后，诱导细胞融合胞融合诱导手段手段离心、离心、电刺激、振刺激、振动、显微操作、聚乙二醇等微操作、聚乙二醇等诱导与植物体与植物体细胞胞杂交相比，交相比，还可用可用灭活的病毒活的病毒诱导结果果获取取杂种植株种植株获得得杂种种细胞，以生胞，以生产细胞胞产品品用途用途克服克服远缘杂交不交不亲和的障和的障碍，碍，扩展展杂交交亲本范本范围，培育新品种培育新品种制制备单克隆抗体、病毒克隆抗体、病毒疫苗、干疫苗、干扰素等素等、植物、动物细胞融合的比较、植物、动物细胞融合的比较1、单克隆抗体单克隆抗体概念概念: 由单个由单个B B淋巴细胞淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高、 纯纯 度度 高、产高、产 量量 大。大。 五、单克隆抗体的制备五、单克隆抗体的制备2 2、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程 注射注射 抗原抗原效应效应B淋巴淋巴细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体诱导其融合的方诱导其融合的方法有哪些？法有哪些？专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性第二次筛选第二次筛选（重复筛选重复筛选 3至至4次）次）AA型、型、BB 型、型、 A 型、型、B型型目的：目的：AB型杂交瘤细胞型杂交瘤细胞目的：目的：能产生能产生所需抗体所需抗体的细胞的细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞（3）制）制备过程程为何要何要经过多次多次筛选？方法：方法：选择性培养基筛选选择性培养基筛选方法：方法：有限稀释法，（即多有限稀释法，（即多孔细胞培养板培养，抗原抗孔细胞培养板培养，抗原抗体特异结合检测）体特异结合检测）第一次筛选第一次筛选 比较比较项目项目第一次筛选第一次筛选第二次筛选第二次筛选原理原理目标目标在选择性培养基中在选择性培养基中添添加某种药物加某种药物，特异性，特异性杀死相同细胞自身融杀死相同细胞自身融合的细胞及未融合的合的细胞及未融合的细胞细胞抗原抗原抗体的特抗体的特异性结合异性结合杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能无限增殖，又既能无限增殖，又能产生能产生特异性抗体特异性抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞单克隆抗体在诊断的应用上，具有单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、准确、高效、简易、快速高效、简易、快速的优点的优点1 1、作为诊断试剂、作为诊断试剂2 2、用于治疗疾病和运载药物、用于治疗疾病和运载药物疗效高、毒副作用小的新型药物疗效高、毒副作用小的新型药物“生物导弹生物导弹”应用：应用：“生物导弹生物导弹”单克隆抗体药物单克隆抗体药物向导作用向导作用观点观点理由理由不赞成不赞成(1)(1)克隆人严重违反了人类伦理道德克隆人严重违反了人类伦理道德(2)(2)克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念的伦理道德观念(3)(3)克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人全的人(4)(4)克隆技术尚不成熟克隆技术尚不成熟赞成赞成(1)(1)技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法得到解决检查等方法得到解决(2)(2)克隆人是一项科学研究，既然是科学，就应该允许克隆人是一项科学研究，既然是科学，就应该允许研究克隆人研究克隆人中国政府中国政府的态度的态度中国政府的观点：不赞成，不允许，不支持，不接受中国政府的观点：不赞成，不允许，不支持，不接受任何生殖性克隆人的实验，任何生殖性克隆人的实验，不反对不反对治疗性克隆治疗性克隆六、克隆技术引发的伦理问题六、克隆技术引发的伦理问题【堂堂清堂堂清】1.单克隆抗体的优点是单克隆抗体的优点是_特异性强、灵敏度高、可大量制备特异性强、灵敏度高、可大量制备2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的原因是原因是_每一个每一个B B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体3.产生抗体的细胞是产生抗体的细胞是_ 产生单克隆抗体的细胞是产生单克隆抗体的细胞是_效应效应B B细胞（浆细胞）细胞（浆细胞）杂交瘤细胞杂交瘤细胞4.杂交瘤细胞的特点杂交瘤细胞的特点:_既能无限增殖，又能分泌特异性抗体既能无限增殖，又能分泌特异性抗体5.首轮筛选是为了获得首轮筛选是为了获得_ 第二轮筛选时为了获得第二轮筛选时为了获得_杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞6.为什么灭活病毒能够作为动物细胞融合的为什么灭活病毒能够作为动物细胞融合的诱导剂？不灭活的是否可以？诱导剂？不灭活的是否可以？2.下下图是是单克隆抗体制克隆抗体制备过程示意程示意图，据，据图回答：回答：（1）图中中A过程是从小鼠的脾程是从小鼠的脾脏中取得中取得_细胞，胞，该细胞能胞能够产生生_。从小鼠体内提取分离从小鼠体内提取分离该细胞之前，胞之前，应给小鼠注射小鼠注射_类物物质。（2）B过程是一个程是一个_过程，程，该过程的程的进行需要行需要灭活的活的_或或_的的诱导。效应效应B抗体抗体抗原抗原细胞融合细胞融合 病毒病毒 聚乙二醇聚乙二醇