第八章第八章反胶束萃取反胶束萃取传统的分离方法的分离方法( (如溶如溶剂萃取技萃取技术)难以以应用于蛋白用于蛋白质的提取和的提取和分离。其主要原因有两个：分离。其主要原因有两个：一是被分离一是被分离对象蛋白象蛋白质等在等在40-5040-50便不便不稳定，开始定，开始变性，而性，而且且绝大多数蛋白大多数蛋白质都不溶于有机都不溶于有机溶溶剂，若使蛋白，若使蛋白质与有机溶与有机溶剂接接触，也会引起蛋白触，也会引起蛋白质的的变性；性；第八章第八章反胶束萃取反胶束萃取二是萃取二是萃取剂问题，蛋白，蛋白质分子表面分子表面带有有许多多电荷，普通的离子荷，普通的离子缔合型合型萃取萃取剂很很难奏效。因此研究和开奏效。因此研究和开发易于工易于工业化的、高效的生化物化的、高效的生化物质分分离方法己成离方法己成为当当务之急。之急。反胶束萃取法就是在反胶束萃取法就是在这一背景下一背景下发展起来的一种新型分离技展起来的一种新型分离技术。第一第一节概概述述一、反胶一、反胶团(Reversed Micelles) 两两性性表表面面活活性性剂在在非非极极性性有有机机溶溶剂中中亲水水性性基基团自自发地地向向内内聚聚集集而而成成的的，内内含含微微小小水水滴滴的的，空空间尺尺度度仅为纳米米级的的集集合合型型胶胶体体。是是一一种种自自我我组织和和排排列列而而成成的的，并并具具热力力学学稳定定的的有序构造。有序构造。第一第一节概概述述二、反胶二、反胶团的特异性功能：的特异性功能： (1)具具有有分分子子识别并并允允许选择性性透透过的半透膜的功能；的半透膜的功能； (2)在在疏疏水水性性环境境中中具具有有使使亲水水性性大大分分子子如如蛋蛋白白质等等保保持持活活性性的的功功能。能。第一第一节概概述述三、三、优点点 (1)有很高的萃取率和反萃取率并有很高的萃取率和反萃取率并具有具有选择性；性； (2)分分离离、浓缩可可同同时进行行，过程程简便；便； (3)能能解解决决蛋蛋白白质(如如胞胞内内酶)在在非非细胞胞环境中迅速失活的境中迅速失活的问题； 第一第一节概概述述 (4)由由于于构构成成反反胶胶团的的表表面面活活性性剂往往往往具具有有细胞胞破破壁壁功功效效，因因而而可可直直接接从从完完整整细胞胞中中提提取取具具有有活性的蛋白活性的蛋白质和和酶； (5)反反胶胶团萃萃取取技技术的的成成本本低低，溶溶剂可反复使用等。可反复使用等。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 一、反胶一、反胶团的构造的构造 1、胶、胶团的形成的形成 向水溶液中加入表面活性向水溶液中加入表面活性剂，当表面活性当表面活性剂的的浓度超度超过一定的一定的数数值时，表面活性，表面活性剂就会在水相就会在水相中形成胶体或微胶中形成胶体或微胶团，它是表面，它是表面活性活性剂的聚集体。的聚集体。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 将表面活性将表面活性剂溶于水中，当其溶于水中，当其浓度超度超过临界胶束界胶束浓度度(CMC)时，表面，表面活性活性剂就会在水溶液中聚集在一起就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束正常胶束(normal micelle)。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 在胶束中，表面活性在胶束中，表面活性剂的排列方向的排列方向是极性基是极性基团在外，与水接触，非极性在外，与水接触，非极性基基团在内，形成一个非极性的核心、在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物在此核心可以溶解非极性物质。第二第二节反胶反胶团的形成的形成2、反胶、反胶团的形成的形成 当向非极性溶当向非极性溶剂中加入表面中加入表面活性活性剂时，如表面活性，如表面活性剂的的浓度度超超过一定的数一定的数值时，也会在非极，也会在非极性溶性溶剂内形成表面活性内形成表面活性剂的聚集的聚集体。体。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 与在水相中不同的是，非极与在水相中不同的是，非极性溶性溶剂内形成的表面活性内形成的表面活性剂聚集聚集体，其疏水性的非极性尾部向外，体，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶指向非极性溶剂，而极性，而极性头向内，向内，与在水相中形成的微胶与在水相中形成的微胶团方向相方向相反，因而称之反，因而称之为反胶反胶团或反向胶或反向胶团 第二第二节反胶反胶团的形成的形成 图8-1是是几几种种可可能能的的表表面面活活性性剂聚聚集集体体的的微微观构构造造。在在反反胶胶团中中有有一一个个极极性性核核心心，。它它包包括括由由表表面面活活性性剂极极性性端端组成成的的内内表表面面、平平衡衡离离子子和和水水。此此极极性性核核具具有有溶溶解解极极性性物物质的的能能力力，极极性性核核溶溶解解水水后后，就就形形成成了了“水池水池”(water pool) 。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 这个个“水水池池”具具有有极极性性，可可以以溶溶解解具具有有极极性性的的分分子子和和亲水水性性的的生生物物大大分分子子，而而极极性性分分子子和和/或或亲水水性性的的生生物物大大分分子子也也因因此此可可“溶解溶解”在非极性的有机溶在非极性的有机溶剂中。中。第二第二节反胶反胶团的形成的形成如蛋白如蛋白质及其他及其他亲水物水物质能能够通通过螯合作用螯合作用进入此入此“水池水池”。由于周。由于周围水水层和极性基和极性基团的保的保护，保持了蛋白，保持了蛋白质的的天然构型，不会造成失活。天然构型，不会造成失活。第二第二节反胶反胶团的形成的形成二、表面活性二、表面活性剂 表面活性表面活性剂的存在是构成反胶的存在是构成反胶团的的必要条件。必要条件。1、表面活性、表面活性剂的的组成成 表面活性表面活性剂是由是由亲水憎油的极水憎油的极性基性基团和和亲油憎水的非极性基油憎水的非极性基团两两部分部分组成的两性分子。成的两性分子。第二第二节反胶反胶团的形成的形成2、表面活性、表面活性剂的种的种类 （1）阴离子表面活性）阴离子表面活性剂； （2）阳离子表面活性）阳离子表面活性剂； （3）非离子型表面活性）非离子型表面活性剂。 它它们都可用于形成反胶束。都可用于形成反胶束。第二第二节反胶反胶团的形成的形成3、常、常见表面活性表面活性剂 AOT、CTAB(溴代十六溴代十六烷基三甲基三甲铵)、TOMAC(氯化三辛基甲化三辛基甲铵)、PTEA(磷脂磷脂酰乙醇胺乙醇胺)，其中以，其中以AOT最最为常用。常用。 而常用于反胶而常用于反胶团萃取系萃取系统的非极性的非极性有机溶有机溶剂有有环己己烷、庚、庚烷、辛、辛烷、异、异辛辛烷、己醇、硅油等。、己醇、硅油等。第二第二节反胶反胶团的形成的形成（1）阴离子型）阴离子型 在在反反胶胶束束萃萃取取蛋蛋白白质的的研研究究中中，用用得得最最多多的的是是阴阴离离子子表表面面活活性性剂AOT(AerosolOT)，其其化化学学名名为丁丁二二酸酸2乙乙基基己己基基磺磺酸酸钠，结构式构式见图。第二第二节反胶反胶团的形成的形成第二第二节反胶反胶团的形成的形成 这种表面活性种表面活性剂容易容易获得，其特得，其特点是具有双点是具有双链，极性基，极性基团较小、形小、形成反胶束成反胶束时不需加助表面活性不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束并且所形成的反胶束较大，半径大，半径为170nm，有利于大分子蛋白，有利于大分子蛋白质进入。入。第二第二节反胶反胶团的形成的形成（2）阳离子型）阳离子型 CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide)溴化十六溴化十六烷基三甲胺基三甲胺/十六十六烷基三甲基胺溴基三甲基胺溴第二第二节反胶反胶团的形成的形成DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二溴化十二烷基二甲基二甲铵第二第二节反胶反胶团的形成的形成TOMAC (triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛化三辛基甲基甲铵第二第二节反胶反胶团的形成的形成 将阳离子表面活性将阳离子表面活性剂如如CTAB溶于有机溶溶于有机溶剂形成反胶束形成反胶束时，与，与AOT不同，不同，还需加入一定量的助需加入一定量的助溶溶剂(助表面活性助表面活性剂)。这是因是因为它它们在在结构上的差异造成的。构上的差异造成的。第二第二节反胶反胶团的形成的形成二、反胶二、反胶团的物理化学特性及制的物理化学特性及制备1反胶反胶团的物理化学特性的物理化学特性 反反胶胶团的的大大小小与与很很多多因因素素有有关关，如如表表面面活活性性剂和和非非极极性性有有机机溶溶剂的的种种类、浓度度；操操作作时体体系系的的温温度度、压力力；微微小水池中的离子小水池中的离子强度等等。度等等。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 有有机机溶溶剂相相中中的的反反胶胶团一一般般比比水水相相中中微微胶胶团的的空空间尺尺寸寸小小得得多多，通通常常为球球形形，有有些些情情况况下下也也可能成可能成为椭球形或棒形。球形或棒形。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 (1)反胶反胶团的的临界胶界胶团浓度度 将表面活性将表面活性剂在非极性有机溶在非极性有机溶剂相中能形成反胶相中能形成反胶团的最小的最小浓度称度称为临界胶界胶团浓度度(Critical Micelle Concentration，有，有时简称称CMC)， 第二第二节反胶反胶团的形成的形成这是体系特性，与表面活性是体系特性，与表面活性剂的的化学化学结构、溶构、溶剂、温度和、温度和压力等因力等因素有关。素有关。 在有机溶在有机溶剂中反胶中反胶团的表面活的表面活性性剂分子分子缔合数，与水溶液系合数，与水溶液系统相相比要小，而且疏水性的碳比要小，而且疏水性的碳链越越长缔合数越小。合数越小。 第二第二节反胶反胶团的形成的形成 CMC的数的数值可通可通过测定各种物理定各种物理性性质的突的突变( (如表面如表面张力、渗透力、渗透压等等) )来确定。由于来确定。由于实验方法不同，所得的方法不同，所得的CMC值往往往往难于完全一致，但是突于完全一致，但是突变点点总是落在一个很窄的是落在一个很窄的浓度范度范围内，内，故用故用CMC范范围来表示更来表示更为方便。方便。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 反胶反胶团不能理解不能理解为一成不一成不变的的刚性球，它的生成或解体、性球，它的生成或解体、缔合数增合数增大或减小以及各反胶大或减小以及各反胶团之之间的相互的相互作用速度很快，即反胶作用速度很快，即反胶团的构成分的构成分子子间能能发生重生重组现象，其象，其过渡渡时间很短，最大也很短，最大也仅为10-5 s。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 (2)反胶反胶团含水率含水率W 反胶反胶团的大小以及反胶的大小以及反胶团内微水相内微水相 的物理化学性的物理化学性质因反胶因反胶团含水率含水率W的不同而差的不同而差别很大。很大。W用水用水 和表面和表面活性活性剂的的浓度之比来定度之比来定义，即：，即： 第二第二节反胶反胶团的形成的形成如表面活性如表面活性剂是是AOT，则： W是个非常重要的参数，是个非常重要的参数，W越大，反越大，反胶胶团的半径越大。的半径越大。“水池水池”越大，越大， “水池水池”大小与溶大小与溶剂和表面活性和表面活性剂的种的种类与与浓度、温度、离子度、温度、离子强度等因素有关，度等因素有关，一般一般为520nm，其内水池的直径，其内水池的直径d用用下式下式计算。算。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 W 含水率（含水率（water content）; M， 分分别为水的相水的相对分子分子质量和密度量和密度; surf 界面界面处一个表面活性一个表面活性剂分子的面分子的面积; N 阿佛加德阿佛加德罗常数常数 AOT在异辛在异辛烷中形成的反胶中形成的反胶团直径直径(d)可用可用下述下述经验式推算式推算 d =0.3W+0.24 (nm)d=6WMsurfN第二第二节反胶反胶团的形成的形成 反胶反胶团“水池水池”中的水与普通的中的水与普通的水在性水在性质上是有差异的。当上是有差异的。当W16时，“水水池池”中中的的水水逐逐渐接接近近主主体体水水相相粘粘度度，胶胶团内也形成二重内也形成二重电荷荷层第二第二节反胶反胶团的形成的形成 但即使当但即使当W值很大很大时，水池内水，水池内水的理化性的理化性质也不能与正常的水完全也不能与正常的水完全相同，特相同，特别是在接近表面活性是在接近表面活性剂亲水水头的区域内。的区域内。 见图8-3。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 当蛋白当蛋白质分子与反胶分子与反胶团直径相比大直径相比大得多得多时(例如，当相例如，当相对分子分子质量超量超过100200kD)，难于溶解到反胶于溶解到反胶团中。中。 当反胶当反胶团的含水率的含水率W较低低时，反胶，反胶团水池内水的理化性水池内水的理化性质与正常水相与正常水相差差悬殊殊。第二第二节反胶反胶团的形成的形成第二第二节反胶反胶团的形成的形成2反胶反胶团的制的制备 制制备反胶反胶团系系统一般有以下三种方法：一般有以下三种方法： (1)注入法注入法 将将含含有有蛋蛋白白质的的水水溶溶液液直直接接注注入入到到含含有有表表面面活活性性剂的的非非极极性性有有机机溶溶剂中中去去，然然后后进行行搅拌拌直直到到形形成成透透明明的的溶溶液液为止止。这种种方方法法的的过程程较快快并并可可较好好地地控控制制反反胶胶团的平均直径和含水量。的平均直径和含水量。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 (2)相相转移法移法 将将酶或或蛋蛋白白质从从主主体体水水相相转移移到到含含表表面面活活性性剂的的非非极极性性有有机机溶溶剂中中形成反胶形成反胶团蛋白蛋白质溶液。溶液。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 即即将将含含蛋蛋白白质的的水水相相与与含含表表面面活活性性剂的的有有机机相相接接触触，在在缓慢慢的的搅拌拌下下，一一部部分分蛋蛋白白质转入入(萃萃入入)有有机机相相。此此过程程较慢慢，但但最最终的的体体系系处于于稳定定的的热力力学学平平衡衡状状态，这种种方方法法可可在在有有机机溶溶剂相中相中获得得较高的蛋白高的蛋白质浓度。度。第二第二节反胶反胶团的形成的形成 (3)溶解法溶解法 对非水溶性蛋白非水溶性蛋白质可用可用该法。将含法。将含有反胶有反胶团(W3-30)的有机溶液与蛋白的有机溶液与蛋白质固体粉末一起固体粉末一起搅拌，使蛋白拌，使蛋白质进入入反胶反胶团中，中，该法所需法所需时间较长。含蛋。含蛋白白质的反胶的反胶团也是也是稳定的，定的，这也也说明明反胶反胶团“水池水池”中的水与普通水的性中的水与普通水的性质是有区是有区别的。的。 第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩一、反胶一、反胶团萃取原理萃取原理 从从宏宏观上上看看反反胶胶团萃萃取取，是是有有机机相相-水水相相间的的分分配配萃萃取取，和和普普通通的的液液液液萃萃取取在在操操作作上上具具有有相相同同特特征征。微微观上上，如如图8-4所所示示，是是从从主主体体水水相相向向溶溶解解于于有有机机溶溶剂相相中中纳米米级的的、均均一一且且稳定定的的、分分散散的的反反胶胶团微微水水相中的分配萃取。相中的分配萃取。 第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 其特点是萃取其特点是萃取进入有机相的生物入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶而避免了与有机溶剂相直接接触而相直接接触而引起的引起的变性、失活。性、失活。 第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 pH、离子、离子强度、表面活性度、表面活性剂浓度度等等(如表如表8-1所示所示)因素会因素会对反胶反胶团萃萃取取产生影响。通生影响。通过对它它们的的调整，整，对分离分离场(反胶反胶团)-待分离物待分离物质(生生物大分子等物大分子等)的相互作用加以控制，的相互作用加以控制，能能实现对目的物目的物质高高选择性的萃取性的萃取和反萃取。和反萃取。 第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 另另外外，因因有有机机相相内内反反胶胶团中中微微水水相相体体积最最多多仅占占有有机机相相的的几几个个百百分分点点，所所以以它它同同时也也是是一一个个浓缩操操作作。如如后后所所述述，只只要要直直接接添添加加盐类，就就可可能能从从已已和和主主体体水水相相分分开开的的有有机机相相中中分分离离出出含含有有目目的的物物的的浓稠稠水水溶溶液液，操作上非常操作上非常简单。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩1、 三元相三元相图及萃取蛋白及萃取蛋白质 对一一个个由由水水、表表面面活活性性剂和和非非极极性性有有机机溶溶剂构构成成的的三三元元系系统，存存在在有有多多种种共共存存相相，可可用用三三元元相相图表表示示，图是是水水AOT异异辛辛烷系系统的的相相图示例。示例。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩水水AOT异辛异辛烷系系统相相图反胶束萃取蛋白反胶束萃取蛋白质的示意的示意团第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩从从图中可知，能用于蛋白中可知，能用于蛋白质分离分离的的仅是位于底部的两相区，在此区是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分内的三元混合物分为平衡的两相：平衡的两相：一相是含有极少量有机溶一相是含有极少量有机溶剂和表和表面活性面活性剂的水相；的水相；一相是作一相是作为萃取萃取剂的反胶束溶液。的反胶束溶液。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 这共存的两相共存的两相组成，用系成，用系线(图中中虚虚线)相相连。这一体系的物理化学性一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作，因非常适合于萃取操作，因为界面界面张力在力在0.12mN/m范范围内，密度差内，密度差为10-20，反胶束溶液粘度适中，反胶束溶液粘度适中，大大约为1mPas这一数量一数量级。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩蛋白蛋白质进入反胶束溶液是一种入反胶束溶液是一种协同同过程，即在宏程，即在宏观两相两相(有机相和水相有机相和水相)界面界面间的表面活性的表面活性剂层，同，同邻近的近的蛋白蛋白质发生静生静电作用而作用而变形，接着形，接着在两相界面形成了包含有蛋白在两相界面形成了包含有蛋白质的的反胶束，此反胶束反胶束，此反胶束扩散散进入有机相入有机相中，从而中，从而实现了蛋白了蛋白质的萃取的萃取第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩2、 蛋白蛋白质溶入反胶束溶液的推溶入反胶束溶液的推动力力与分配特性与分配特性（1）推）推动力力 蛋白蛋白质溶入反胶束溶液的推溶入反胶束溶液的推动力力主要包括表面活性主要包括表面活性剂与蛋白与蛋白质的静的静电作用力和位阻效作用力和位阻效应。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩静静电作用力：作用力： 在反胶束萃取体系中，表面活性在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白与蛋白质都是都是带电的分子，因此的分子，因此静静电相互作用肯定是萃取相互作用肯定是萃取过程中的程中的一种推一种推动力。力。 其中一个最直接的因素是其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋白它决定了蛋白质带电基基团的离解速的离解速率及蛋白率及蛋白质的的净电荷。当荷。当pHpI时，蛋白蛋白质呈呈电中性；中性；pHpI时，蛋白，蛋白质带正正电荷；荷；pHpI时，蛋白，蛋白质带负电荷。荷。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩即随着即随着pH的改的改变，被萃取蛋白，被萃取蛋白质所所带电荷的符号和多少是不同的。因此，荷的符号和多少是不同的。因此，如果静如果静电作用是蛋白作用是蛋白质增溶增溶过程的主程的主要推要推动力，力，对于阳离子表面活性于阳离子表面活性剂形形成的反胶束体系，萃取只成的反胶束体系，萃取只发生在水溶生在水溶液的液的pHpI时，此，此时蛋白蛋白质与表面活与表面活性性剂极性极性头间相互吸引，而相互吸引，而pHpI时，静静电排斥将抑制蛋白排斥将抑制蛋白质的萃取；的萃取；第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 对于阴离子表面活性于阴离子表面活性剂形成的反形成的反胶束体系，情况正好相反。此外，胶束体系，情况正好相反。此外，离子型表面活性离子型表面活性剂的反离子并不都的反离子并不都固定在反胶束表面。固定在反胶束表面。 改改变水相条件水相条件(如如pH值和离子种和离子种类及其及其强度等度等)又可使蛋白又可使蛋白质由有机由有机相重新返回水相相重新返回水相实现反萃取反萃取过程。程。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 位阻效位阻效应 许多多亲水性物水性物质，如蛋白，如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可以通核酸及氨基酸等，都可以通过溶溶入反胶束入反胶束“水池水池”来达到它来达到它们溶溶于非水溶于非水溶剂中的目的。中的目的。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 但是反胶束但是反胶束“水池水池”的物理的物理性性(大小、形状等大小、形状等)及其中水的活及其中水的活度是可以用度是可以用W的的变化来化来调节的，的，并且会影响大分子如蛋白并且会影响大分子如蛋白质的增的增溶或排斥，达到溶或排斥，达到选择性萃取的目性萃取的目的，的，这就是所就是所谓的位阻效的位阻效应。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（2） 反胶束萃取中蛋白反胶束萃取中蛋白质的分配特性的分配特性蛋白蛋白质在两相在两相间的分配系数的分配系数第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩反胶束反胶束浓度度M与表面活性与表面活性剂浓度度Ssurf的关系的关系为M= Ssurf/N (N为聚焦数聚焦数)第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 3、反胶束萃取蛋白、反胶束萃取蛋白质的的动力学力学 研究萃取和反萃取研究萃取和反萃取过程的程的动力学力学可可为人人们提供界面作用机制，从蛋提供界面作用机制，从蛋白白质在两相在两相间的的扩散散动力学，可找力学，可找到萃取到萃取过程的控制步程的控制步骤，对合理合理设计萃取系萃取系统和装置具有理和装置具有理论指指导意意义。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（1 1）传递步步骤萃取萃取过程程蛋白蛋白质在互不相溶的两相在互不相溶的两相间的的传递可分可分为三步：三步：蛋白蛋白质从水溶液主体从水溶液主体扩散到界面；散到界面；在界面形成包容蛋白在界面形成包容蛋白质的反胶束；的反胶束；含有蛋白含有蛋白质的反胶束在有机相中的反胶束在有机相中扩散离开散离开界面。界面。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩反萃取反萃取过程程 反萃反萃过程同程同样有三步：有三步：含有蛋白含有蛋白质的反胶束从有机相主体的反胶束从有机相主体扩散到界面；散到界面；包容蛋白包容蛋白质的反胶束在界面崩裂；的反胶束在界面崩裂；蛋白蛋白质从界面从界面扩散到水溶液主体。散到水溶液主体。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（2 2）动力学方程力学方程蛋白蛋白质进入或离开反胶束相的入或离开反胶束相的传递通量通量可用下式可用下式计算：算：萃取萃取过程程反萃取反萃取过程程第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 式中式中Kf、Kr分分别为萃取及反萃取萃取及反萃取过程的表程的表观传质系数；系数；Cw、C0分分别为水水相和有机相中蛋白相和有机相中蛋白质浓度；度；m为萃取的萃取的分配系数；分配系数；m为反萃取的分配系数；反萃取的分配系数；t为时间。 可以通可以通过实验求得求得传质系数，从系数，从总传质系数和分系数和分传质系数的大小可以判系数的大小可以判断断过程控制的程控制的类型。型。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（3）萃取和反萃取的）萃取和反萃取的过程控制程控制 三种三种类型：型： 反反应(包括相内反包括相内反应和界面反和界面反应)控制控制过程；程； 扩散散(或或传质)控制控制过程；程； 混合控制混合控制过程。程。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩萃取萃取过程程 速率是由速率是由扩散散传输机制控制的。机制控制的。 Dekker等在等在TOMAC反胶束萃取反胶束萃取淀粉淀粉酶时，证实了萃取了萃取过程的速率决程的速率决定于淀粉定于淀粉酶在水相在水相边界界层的的扩散速度。散速度。 蛋白蛋白质的大小、所的大小、所带电荷种荷种类和和电荷密度荷密度对萃取的快慢有重大影响。萃取的快慢有重大影响。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 在在TOMAC/庚庚烷体系中萃取和反萃体系中萃取和反萃取苯丙氨酸的取苯丙氨酸的动力学特征力学特征时，通，通过对传递通量方程通量方程进行非行非线性回性回归分析分析计算，得到前萃取算，得到前萃取过程的界面反程的界面反应动力力学常数学常数8000cm4/mol.min,误差率差率1000%。表明界面反表明界面反应速度非常快，速度非常快，萃取萃取过程由程由扩散控制。散控制。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩反萃取反萃取过程程 主要由界面反主要由界面反应过程控制。程控制。 增大离子增大离子强度，即增大了度，即增大了AOT反反胶束的胶束的刚性和性和稳定性，使界面作用定性，使界面作用过程程变慢，反萃速率降低。慢，反萃速率降低。这说明了萃明了萃取与反萃取的控制取与反萃取的控制过程是不同的。由程是不同的。由于界面作用于界面作用过程程较慢，一般反萃取平慢，一般反萃取平衡所需衡所需时间要比萃取要比萃取过程程长。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩二、反胶二、反胶团的溶解作用的溶解作用 由于反胶由于反胶团内存在微水池，故可内存在微水池，故可溶解氨基酸、溶解氨基酸、肽和蛋白和蛋白质等生物分等生物分子，子，为生物分子提供易于生存的生物分子提供易于生存的亲水微水微环境。境。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 关于反胶关于反胶团溶解蛋白溶解蛋白质的形式，的形式，有人提出了四种模型，如有人提出了四种模型，如图所示。所示。 (a)为水壳模型，蛋白水壳模型，蛋白质位于水池位于水池的中心，周的中心，周围存在的水存在的水层将其与反将其与反胶胶团壁壁(表面活性表面活性剂)隔开；隔开；第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩(b)蛋白蛋白质分子表面存在分子表面存在强烈疏水区域，烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；疏水区域直接与有机相接触；(c)蛋白蛋白质吸附于反胶吸附于反胶团内壁；内壁；(d)蛋白蛋白质的疏水区与几个反胶的疏水区与几个反胶团的表的表面活性面活性剂疏水尾疏水尾发生相互作用，被生相互作用，被几个小反胶几个小反胶团所所“溶解溶解”。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩bcda第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 表面性表面性质不同的蛋白不同的蛋白质可能以不可能以不同的形式溶解于反胶同的形式溶解于反胶团相，但相，但对于于亲水性蛋白水性蛋白质，目前普遍接受的是，目前普遍接受的是水壳模型。因水壳模型。因为许多多实验数据均数据均间接地接地证明了水壳模型的正确性。明了水壳模型的正确性。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩例如：例如： (1)反胶反胶团内内酶的的结构和活性与构和活性与W值密切密切相关，相关，说明明酶对其周其周围存在的水存在的水层非非常敏感；常敏感； (2)反胶反胶团内内酶反反应动力学行力学行为与在正与在正常的水相中相似，活性与常的水相中相似，活性与pH的关系同的关系同样表表现为钟状曲状曲线。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩三、三、 影响反胶束萃取蛋白影响反胶束萃取蛋白质的主要因素的主要因素 蛋白蛋白质的萃取，与蛋白的萃取，与蛋白质的表面的表面电荷荷和反胶束内表面和反胶束内表面电荷荷间的静的静电作用，以作用，以及反胶束的大小有关。所以，任何可以及反胶束的大小有关。所以，任何可以增增强这种静种静电作用或作用或导致形成致形成较大的反大的反胶束的因素，都有助于蛋白胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。的萃取。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 只要通只要通过对这些因素些因素进行系行系统的的研究，确定最佳操作条件，就可得研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目到合适的目标蛋白蛋白质萃取率，从而萃取率，从而达到分离达到分离纯化的目的。化的目的。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩1、水相、水相pH值对萃取的影响萃取的影响 水相的水相的pH值决定了蛋白决定了蛋白质表面表面电荷的状荷的状态、从而、从而对萃取萃取过程造成程造成影响。只有当反胶束内表面影响。只有当反胶束内表面电荷，荷，也就是表面活性也就是表面活性剂极性基极性基团所所带的的电荷与蛋白荷与蛋白质表面表面电荷相反荷相反时，两，两者者产生静生静电引力，蛋白引力，蛋白质才有可能才有可能进入反胶束。入反胶束。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩对于阳离子表面活性于阳离子表面活性剂、溶液的、溶液的pH值需高于蛋白需高于蛋白质的的pI值，反胶束萃取才能，反胶束萃取才能进行；行； 对于阴离子表面活性于阴离子表面活性剂，当，当pHpI时，萃取率几乎萃取率几乎为零，当零，当pHpI时，萃取率，萃取率急急剧提高，提高，这表明蛋白表明蛋白质所所带的的净电荷与荷与表面活性表面活性剂极性极性头所所带电荷符号相反，两荷符号相反，两者的静者的静电作用作用对萃取蛋白萃取蛋白质有利。有利。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 如果如果pH值很低，在界面上会很低，在界面上会产生生白色絮凝物，并且萃取率也降低白色絮凝物，并且萃取率也降低这种情况可种情况可认为是蛋白是蛋白质变性之故。性之故。水相水相pH值对几种相几种相对分子分子质量量较小小的蛋白的蛋白质的萃取影响的萃取影响见图。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 对不同相不同相对分子分子质量的蛋白量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当萃取率的影响有差异性，当蛋白蛋白质相相对分子分子质量增加量增加时，只有，只有增大增大(pH-pI)值的的绝对值，相，相转移才移才能能顺利完成。利完成。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩如如-糜蛋白糜蛋白酶(相相对分子分子质量量为25000)的萃取率在的萃取率在pH值低于低于pI值2-4时达到最高，而牛血清蛋白达到最高，而牛血清蛋白(相相对分分子子质量量为68000)在相同的系在相同的系统中根本中根本不不发生相生相转移。移。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 这种差异性可解种差异性可解释为：对于包含于包含大蛋白分子的反胶束，其尺寸大蛋白分子的反胶束，其尺寸远大大于于“空核空核”的反胶束，萃取的反胶束，萃取时势必必要消耗要消耗较多的能量，多的能量，这些能量只能些能量只能通通过较强的静的静电相互作用得到相互作用得到补偿。用用调节pH的作用来增加蛋白的作用来增加蛋白质分子分子表面表面电荷的方法，正是达到增荷的方法，正是达到增强静静电作用的一条途径。作用的一条途径。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩对那些尺寸小于那些尺寸小于“空核空核”的反胶的反胶束中水体束中水体积的蛋白的蛋白质，只要其所携，只要其所携带的的净电荷与表面活性荷与表面活性剂电性相反，萃性相反，萃取就能取就能发生。生。蛋白蛋白质的相的相对分子分子质量量Mr与与( (pH-pI) )绝对值呈呈线性关系性关系,这种关系，种关系，对阴离子及阳离子表面活性阴离子及阳离子表面活性剂所形成所形成的反胶束体系同的反胶束体系同样适用。适用。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩2、 离子离子强度度对萃取率的影响萃取率的影响离子离子强度度对萃取率的影响主要是萃取率的影响主要是由离子由离子对表面表面电荷的屏蔽作用所决定荷的屏蔽作用所决定的：的： a.离子离子强度增大后，反胶束内表面度增大后，反胶束内表面的双的双电层变薄，减弱了蛋白薄，减弱了蛋白质与反胶与反胶束内表面之束内表面之间的静的静电吸引，从而减少吸引，从而减少蛋白蛋白质的溶解度；的溶解度；第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 b.反胶束内表面的双反胶束内表面的双电层变薄后，薄后，也减弱了表面活性也减弱了表面活性剂极性基极性基团之之间的斥力，使反胶束的斥力，使反胶束变小，从而使蛋小，从而使蛋白白质不能不能进入其中；入其中； c.离子离子强度增加度增加时，增大了离子向，增大了离子向反胶束内反胶束内“水池水池”的迁移并取代其的迁移并取代其中蛋白中蛋白质的的倾向，使蛋白向，使蛋白质从反胶从反胶束内被束内被盐析出来；析出来；第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 d.盐与蛋白与蛋白质或表面活性或表面活性剂的相互作的相互作用，可以改用，可以改变溶解性能，溶解性能，盐的的浓度越高，度越高，其影响就越大。其影响就越大。 如离子如离子强(KCl 浓度度)对萃取核糖酸萃取核糖酸酶a,细胞色素胞色素c和溶菌和溶菌酶的影响的影响见图,由由图可可见，在，在较低的低的KCl浓度下，蛋白度下，蛋白质几乎全几乎全部被萃取，当部被萃取，当KCl浓度高于一定度高于一定值时,萃萃取率就开始下降，直至几乎取率就开始下降，直至几乎为零。零。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩3、表面活性、表面活性剂类型的影响型的影响: 前面已前面已经提到阴离子表面活性提到阴离子表面活性剂、阳离子表面活性阳离子表面活性剂和非离子表面活和非离子表面活性性剂都可用于形成反胶束都可用于形成反胶束。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩 关关键是是应从反胶束萃取蛋白从反胶束萃取蛋白质的的机理出机理出发，选用有利于增用有利于增强蛋白蛋白质表面表面电荷与反胶束内表面荷与反胶束内表面电荷荷间的的静静电作用和增加反胶束大小的表面作用和增加反胶束大小的表面活性活性剂。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩还应考考虑形成反胶束及使反胶形成反胶束及使反胶束束变大大( (由于蛋白由于蛋白质的的进入入) )所需的所需的能量的大小、反胶束内表面的能量的大小、反胶束内表面的电荷荷密度等因素，密度等因素，这些都会些都会对萃取萃取产生生影响影响第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩4、表面活性、表面活性剂浓度的影响度的影响 增大表面活性增大表面活性剂的的浓度可增加反胶束度可增加反胶束的数量，从而增大的数量，从而增大对蛋白蛋白质的溶解能力。的溶解能力。但表面活性但表面活性剂浓度度过高高时，有可能在溶，有可能在溶液中形成比液中形成比较复复杂的聚集体，同的聚集体，同时会增会增加反萃取加反萃取过程的程的难度。因此，度。因此，应选择蛋蛋白白质萃取率最大萃取率最大时的表面活性的表面活性剂浓度度为最佳最佳浓度。度。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩总结反胶束体系反胶束体系对核糖核酸核糖核酸酶a与伴刀豆球蛋白与伴刀豆球蛋白进行萃取的行萃取的结果，得果，得到了分配系数到了分配系数K同表面活性同表面活性剂浓度度S以及以及pH值的关系式：的关系式： 1nKA十十B*pH十十(C十十D*pH)lnS 式中系数式中系数A、B、C、D取决于蛋白取决于蛋白质的性的性质，可通，可通过实验测定。定。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩5、离子种、离子种类对萃取的影响萃取的影响 阳离子的种阳离子的种类对萃取率的影响主要体萃取率的影响主要体现在改在改变反胶束内表面的反胶束内表面的电荷密度上。荷密度上。通常反胶束中表面活性通常反胶束中表面活性剂的极性基的极性基团不不是完全是完全电离的，有很大一部分阳离子仍离的，有很大一部分阳离子仍在胶在胶团的内表面上的内表面上(相反离子相反离子缔合合)。极。极性基性基团的的电离程度愈大，反胶束内表面离程度愈大，反胶束内表面的的电荷密度愈大，荷密度愈大，产生的反胶束也愈大。生的反胶束也愈大。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩6、影响反胶束、影响反胶束结构的其他因素构的其他因素（1）有机溶）有机溶剂的影响的影响: 有机溶有机溶剂的种的种类影响反胶束的大小，影响反胶束的大小，从而影响水增溶的能力，所以可以利从而影响水增溶的能力，所以可以利用因溶用因溶剂作用引起的不同胶束作用引起的不同胶束结构构实现选择性增溶生物分子的目的，如性增溶生物分子的目的，如-胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶随溶随溶剂的不同在反胶束的不同在反胶束中增溶的比率会出中增溶的比率会出现显著的差著的差别。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（2）助表面活性）助表面活性剂的影响的影响: 当使用阳离子表面活性当使用阳离子表面活性剂时，引，引入助表面活性入助表面活性剂，能，能够增增进有机相有机相的溶解容量，的溶解容量，这多半是由于胶束尺多半是由于胶束尺寸增加而寸增加而产生的。生的。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩（3）温度的影响）温度的影响: 温度的温度的变化化对反胶束系反胶束系统中的物中的物理化学性理化学性质有激烈的影响，增加温有激烈的影响，增加温度能度能够增加蛋白增加蛋白质在有机相的溶解在有机相的溶解度，例如增加温度可使度，例如增加温度可使-胰凝乳蛋胰凝乳蛋白白酶进入入NH4-氯仿相并在仿相并在转移率上移率上分分别增加增加50。第三第三节生理活性物生理活性物质的分离的分离浓缩第四第四节在分离工在分离工艺中的中的应用用 利用利用图8-8和和图8-9的静的静电相互作用，相互作用，通通过三步分离操作三步分离操作(图8-13)，分离了核糖，分离了核糖核酸核酸酶a，细胞色素胞色素c和溶菌和溶菌酶。调整整pH，进行正萃取分离，通行正萃取分离，通过控制控制KCl浓度，度，反萃取分离，能反萃取分离，能获得得较好的分离效果和好的分离效果和收率。通收率。通过立体性相互作用立体性相互作用(图8-12)和静和静电相互作用的相互作用的组合，三步能分离溶菌合，三步能分离溶菌酶、-胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶和和BSA。 第四第四节在分离工在分离工艺中的中的应用用 使使用用如如图8-14所所示示二二级混混合合分分离离型型萃萃取取流流程程，用用TOMAC0.1(体体积分分数数)辛辛醇醇异异辛辛烷的的溶溶液液体体系系连续分分离离。淀淀粉粉酶，控控制制第第一一级水水相相中中酶浓度度在在较低低水水平平上上，使使失失活活速速度度很很小小，第第二二级水水相相中中酶的的回回收收率率为84，浓缩了了17倍。倍。第四第四节在分离工在分离工艺中的中的应用用 分分离离膜膜型型的的液液液液反反胶胶团萃萃取取是是上上述述混混合合分分离离型型的的改改进型型，以以疏疏水水性性多多孔孔质膜膜(接接触触比比表表面面积较大大，30300cm2cm3)作作为液液液液两两相相的的接接触触界界面面，如如在在聚聚丙丙烯中中空空膜膜组件件的的内内外外两两侧，分分别流流过含含有有蛋蛋白白质的的水水相相和和含含有有反反胶胶团的的有有机机相相(AOTn-辛辛烷)。第四第四节在分离工在分离工艺中的中的应用用 调整整内内外外两两侧的的压力力差差，防防止止膜膜面面乳乳浊液液的的生生成成，以以保保持持液液液液界界面面。在在这种种场合合下下，因因膜膜自自身身对蛋蛋白白质透透过无无选择性性，可可以以认为和和一一般般的的反胶反胶团萃取分离法具有相同原理。萃取分离法具有相同原理。第四第四节在分离工在分离工艺中的中的应用用 这种种方方式式的的一一个个大大的的优点点是是，没没有有在在一一般般连续性性液液液液萃萃取取法法中中成成为问题的的进料料和和液液泛泛等等制制约因因素素，可可自自由由地地改改变液液流流的的流流速速。总物物质移移动速速度度和和膜膜面面积也也比比一一般般方方法法大大，另另外外在在原原理理上上是是连续式式的的，放放大大也也较容易等。容易等。 第五第五节 反胶束萃取的反胶束萃取的应用用 一、反胶束萃取蛋白一、反胶束萃取蛋白质的的应用用1、同、同时提取蛋白提取蛋白质和油脂和油脂: 在在AOT-异辛异辛烷反胶束同反胶束同时萃取花生蛋白萃取花生蛋白和花生油的和花生油的过程，程，讨论了影响萃取的主了影响萃取的主要因素，得到了最佳萃取工要因素，得到了最佳萃取工业条件。萃条件。萃取后，油取后，油进入有机相，而蛋白入有机相，而蛋白质溶入反溶入反胶束中。克服了胶束中。克服了传统方法工方法工艺复复杂,得率得率低低,蛋白蛋白质容易容易变性的缺点性的缺点同同时用蒸用蒸馏方法将油和方法将油和烃分开分开,提提炼出了油脂出了油脂2、分离蛋白、分离蛋白质混合物混合物:Chang在在Aliquat336/异辛异辛烷反胶束分离枯草反胶束分离枯草杆菌中两种杆菌中两种酶和淀粉和淀粉酶和中性蛋白和中性蛋白酶时，通，通过加入助表面活性加入助表面活性剂丁醇丁醇,有效地分离了有效地分离了这两种不同等两种不同等电点的点的酶。3、从、从发酵液中分离和提酵液中分离和提纯酶: Krishnakant用用AOT/异辛异辛烷体系体系从土豆从土豆发酵液中提取酸性磷酸酵液中提取酸性磷酸酶,在在pH值810,萃取水相与有机相体萃取水相与有机相体积比比为3B1,反萃水相与有机相体反萃水相与有机相体积比比为1B1时得到最大活性的酸性磷酸得到最大活性的酸性磷酸酶。二、反胶束中的二、反胶束中的酶学研究学研究 有机相有机相酶催化反催化反应在生物工程在生物工程领域域的的应用用,引起人引起人们极大极大兴趣，其相关趣，其相关研究文献迅速增多。研究文献迅速增多。20多年的研究多年的研究表明，有机介表明，有机介质中中酶催化反催化反应与水与水介介质中反中反应相比具有相比具有许多特点和多特点和优势。 含微量水的反胶束体系具有以下几个含微量水的反胶束体系具有以下几个显著著特点：特点： 可可进行水不溶性化合物的催化行水不溶性化合物的催化转化，拓化，拓宽了了酶的作用底物的作用底物; 酶的的热稳定性大大提高；定性大大提高； 减少了有水引起的副反减少了有水引起的副反应；能改；能改变反反应的的平衡点平衡点,使反使反应朝期望的方向朝期望的方向进行；行； 可使极性不同的底物与反可使极性不同的底物与反应物原位分离，物原位分离，降低分离能耗。降低分离能耗。