燕 德 起1血清总胆红素和结合胆红素测定 改良改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红法测定血清总胆红素和结合胆红素素 胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素红素2改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【原理原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因素须有加速剂咖啡因- -苯甲酸钠苯甲酸钠- -醋酸钠醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应氮反应pH6.5pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素紫色偶氮胆红素( (吸收峰吸收峰530nm)530nm)转变成蓝转变成蓝色偶氮胆红素，在色偶氮胆红素，在600nm600nm波长比色，使检波长比色，使检测灵敏度提高。测灵敏度提高。3改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂试剂】1咖啡因咖啡因- -苯甲酸钠试剂苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠称取无水醋酸钠41.0g41.0g，苯甲酸钠，苯甲酸钠38.0g38.0g，乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.5g(EDTA-Na2)0.5g，溶于约，溶于约500ml500ml去离子水中，去离子水中，再加入咖啡因再加入咖啡因25.0g25.0g，搅拌使溶解，搅拌使溶解( (加入咖啡因后不能加热溶解加入咖啡因后不能加热溶解) )，用去离子水补足至用去离子水补足至1L,1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。2 2碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠称取氢氧化钠75.0g75.0g，酒石酸钠，酒石酸钠(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g，用去离子水溶解并补足至，用去离子水溶解并补足至1L1L，混匀。，混匀。置塑料瓶中，室温保存。置塑料瓶中，室温保存。3 372.5mmol/L72.5mmol/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠称取亚硝酸钠5.0g5.0g，用去离子水溶解，用去离子水溶解并定容至并定容至100ml100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3 3个个月。作月。作1010倍稀释成倍稀释成72.5mmol/L72.5mmol/L，冰箱保存，稳定期不少于，冰箱保存，稳定期不少于2 2周。周。4 428.9mmol/L28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸称取对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g，溶于，溶于800ml800ml去离子水中，加入浓盐酸去离子水中，加入浓盐酸15ml15ml，用去离子水补足至，用去离子水补足至1L1L。5 5重氮试剂重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml0.5ml和对氨基苯磺酸溶和对氨基苯磺酸溶液液20ml20ml，混匀即成。，混匀即成。6 65.0g/L5.0g/L叠氮钠溶液。叠氮钠溶液。4改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂试剂】7 7胆红素标准液胆红素标准液 (1) (1) 目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须用目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下： 收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml1ml，加入新鲜，加入新鲜0.154mmol/L 0.154mmol/L NaClNaCl溶液溶液24ml24ml，混合。在，混合。在414nm414nm波长，波长，1cm1cm光径，以光径，以0.154mmol/L 0.154mmol/L NaClNaCl溶液调零点，其吸光度应小于溶液调零点，其吸光度应小于0.1000.100；在；在460nm460nm的吸光度应小于的吸光度应小于0.040.04。(2) (2) 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在在2525条件下，光径条件下，光径1.0001.0000.001cm0.001cm，波长，波长453nm453nm，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数应在应在60 70060 7001 6001 600范围内；改良范围内；改良J-GJ-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在数应在74 38074 380866866。(3) (3) 胆红素标准贮存液胆红素标准贮存液(171mol/L) (171mol/L) 准确称取符合要求的胆红准确称取符合要求的胆红素素10mg10mg，加入二甲亚砜，加入二甲亚砜1ml1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L0.05mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液2ml2ml，使胆红素完全溶解后，移入，使胆红素完全溶解后，移入100ml100ml容量容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L0.1mol/L盐酸盐酸2ml2ml，边加边摇，边加边摇( (勿用力摇动，以免产生气泡勿用力摇动，以免产生气泡) )。最后以稀释用。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置44冰箱冰箱3d3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。内有效，但要求配后尽快作标准曲线。5改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【操作步骤】 混匀后，波长混匀后，波长600nm600nm，对照管调零，读取吸光度，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。6改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素标准曲线制作 混匀混匀( (不可产生气泡不可产生气泡) )，按总胆红素测定法操作。，按总胆红素测定法操作。每一浓度作每一浓度作3 3个平行管，并分别做标准对照管，用各自个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线 7改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【参考范围参考范围】 血清总胆红素：血清总胆红素：5.15.119mol/L(0.319mol/L(0.31.1mg/dl)1.1mg/dl)； 血清结合胆红素：血清结合胆红素：1.71.76.8mol/L(0.16.8mol/L(0.10.4mg/dl)0.4mg/dl)。【临床意义临床意义】 1 1血清总胆红素测定的意义血清总胆红素测定的意义(1) (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。有无黄疸及黄疸程度的鉴别。(2) (2) 肝细胞损害程度和预后的判断肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。(3) (3) 新生儿溶血症新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。血清胆红素有助于了解疾病严重程度。(4) (4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血再生障碍性贫血及数种继发性贫血( (主要见于癌或慢主要见于癌或慢性肾炎引起性肾炎引起) )，血清总胆红素减少。，血清总胆红素减少。8改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【临床意义临床意义】 2 2血清结合胆红素测定的意义血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。(1) (1) 比值比值20% 20% 溶血性黄疸，阵发性血红溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。(2) (2) 比值比值40%40%60% 60% 肝细胞性黄疸。肝细胞性黄疸。(3) (3) 比值比值60% 60% 阻塞性黄疸。阻塞性黄疸。但以上几类黄疸，尤其是但以上几类黄疸，尤其是(2)(2)、(3)(3)类之间有类之间有重叠。重叠。 9改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【注意事项注意事项】1 1胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。2 2轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。应尽量取空腹血。3 3叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。不呈色。4 4本法测定血清总胆红素，在本法测定血清总胆红素，在10103737条件下不受温度条件下不受温度变化的影响。呈色在变化的影响。呈色在2h2h内非常稳定。内非常稳定。10改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【注意事项注意事项】5 5标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。6 6胆红素大于胆红素大于342mol/L342mol/L的标本可减少标本用量，或用的标本可减少标本用量，或用0.154mmol/L 0.154mmol/L NaClNaCl溶液稀释血清后重测。溶液稀释血清后重测。7 7结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。情况下，问题更复杂。11改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素H H【评价评价】1 1灵敏度和线性范围灵敏度和线性范围 本法摩尔吸光系数为本法摩尔吸光系数为74 38074 380，标本，标本中胆红素中胆红素17.1mol/L17.1mol/L时吸光度约时吸光度约0.08(0.08(血清用量已达血清用量已达0.2m1)0.2m1)，正常血清总胆红素多数小于，正常血清总胆红素多数小于17.1mol/L17.1mol/L，手工法测定显，手工法测定显得灵敏度很不够。在病理血清结合胆红素增高在得灵敏度很不够。在病理血清结合胆红素增高在17.1mol/L17.1mol/L以下时，灵敏度同样不够。线性上限虽可做以下时，灵敏度同样不够。线性上限虽可做到到1.71.7吸光度，但手工法在胆红素超过吸光度，但手工法在胆红素超过171mol/L171mol/L时，吸时，吸光度已达光度已达0.80.8，应减量操作。分析仪检测灵敏度高得多，应减量操作。分析仪检测灵敏度高得多，最低吸光度可测至最低吸光度可测至0.020.02，线性上限可达，线性上限可达342mol/L342mol/L；但本；但本法需法需3 3次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。2 2精密度精密度 正常浓度时精密度较差，特别是批间正常浓度时精密度较差，特别是批间CVCV，据报，据报道为道为14%14%20%20%；而胆红素；而胆红素342mol/L342mol/L时，精密度佳，批内时，精密度佳，批内CVCV为为0.95%0.95%，批间，批间CV5%CV5%10%10%。12改良改良J-GJ-G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素H H【评价评价】3 3重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇(M-E(M-E法法) )或二甲亚砜或二甲亚砜等作加速剂，可做成单一试剂，反应等作加速剂，可做成单一试剂，反应pHpH和显色和显色pHpH都在酸性，都在酸性，560nm560nm波长比色，易于自动化。但灵敏度比改良波长比色，易于自动化。但灵敏度比改良J-GJ-G法略低，法略低，M-EM-E法摩尔吸光系数为法摩尔吸光系数为60 50060 500，HbHb干扰较明显，干扰较明显，HbHb1g/L1g/L时，需用样品空白校正。时，需用样品空白校正。4 4本法灵敏度高，且可避免其它有色物质的干扰，是测定本法灵敏度高，且可避免其它有色物质的干扰，是测定血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。现有些商品试剂盒称咖啡因法或现有些商品试剂盒称咖啡因法或J-GJ-G法，但不加碱性酒石法，但不加碱性酒石酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不如上述酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不如上述方法。方法。13胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【原理原理】 u胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，A450nm下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在pH8.0条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。u在pH3.74.5缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分胆红素氧化，非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。14胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【试剂试剂】10.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水90ml中，在室温(2530)用1mol/L盐酸调节pH至8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此液含4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。20.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。3BOD溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4冰箱可保存较长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万2万U/L，BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.31.0U/ml计算。4总胆红素标准液(342mol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。5结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，70保存，可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。15胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【操作步骤操作步骤】 总胆红素和结合胆红素测定分别按表总胆红素和结合胆红素测定分别按表 16胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素 加入加入BODBOD工作液后立即混匀，置工作液后立即混匀，置37C37C水浴水浴5min5min，用，用分光光度计，在分光光度计，在450nm450nm波长，去离子水调零，读取各波长，去离子水调零，读取各管吸光度管吸光度(A)(A)。用于对照管的比色杯与非对照管的比。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。色杯不得混用。17【计算】 血清总胆红素(mol/L) C总胆红素 血清结合胆红素(mol/L) CDTB【参考范围】 与重氮法相似， 总胆红素为10.264.10mol/L(n=97)， 结合胆红素为2.572.56mol/L(n=95)。胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素18胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【注意事项】 1BOD浓度的选择 文献报道BOD在反应液中终浓度为0.181.14U/ml。国内有些厂家的试剂盒，BOD在反应液中终浓度按标示值计算很高，但反应速度很慢。2.选择BOD浓度时，可根据所用制品在测定高胆红素血清标本或342mol/L标准液的反应速度，即能否在5min反应完全而确定。由于测定结合胆红素时反应液pH偏离BOD的最适范围，因此要求BOD有较高的浓度，一般使反应液中终浓度不低于0.5U/ml。19胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【注意事项】 3Hb在1.0g/L以下时，对结果影响不大。每升血清中分别加入维生素C 0.1g、半胱氨酸0.5g、谷胱苷肽0.5g、尿素0.5g、尿酸0.5g、葡萄糖10g、乙碘醋酸1g、白蛋白40g对总胆红素及结合胆红素测定几乎无干扰。每升血清中加L-多巴0.15g、-甲基多巴0.15g使结果偏低约10%。4BOD的最适pH 在pH7.39.0之间酶活性的pH曲线变化幅度不大，但最适pH为8.08.2。但在测定结合胆红素时，为防止Bu反应，选择pH为4.5，这时样本中mBc、dBc及大部分胆红素被氧化；pH低于4.0时，血清样本易发生混浊，严重干扰测定结果；郭健等报道，用枸橼酸盐、磷酸盐、硼酸盐和碳酸盐缓冲液比较时，枸橼酸盐缓冲液 (0.1mol/L，pH5.0)效果最好。20胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素5结合胆红素标准品 合成的二牛磺酸胆红素(DTB)为水溶性化合物，可与重氮化氨基苯磺酸直接反应，产生吸收光谱与偶氮胆红素相似的偶氮色素。用J-G法测得的摩尔吸光系数与Bu相同。20世纪80年代后期以来，国外结合胆红素测定大多用DTB作标准品。DTB反应前后的吸收光谱与Bu相似，最大吸收峰也在450460nm之间。6混浊问题Doumas报道，成人黄疸血清或肝素抗凝血浆，反应15min几乎均产生混浊而影响结果。在磷酸盐缓冲液中加入尿素可防止混浊。经电泳证明混浊是因球蛋白及纤维蛋白原沉淀引起。应避免使用肝素抗凝。7光对BOD法测定结合胆红素有较大影响。经过蓝光治疗的新生儿黄疽血清，用BOD法测定结合胆红素结果远比J-G法高，属假性增高。新生儿血清在体外经蓝光照射后，用高效液相色谱法(HPLC)未检出结合胆红素，重氮法结果通常保持不变，但BOD法结果显著增高。蓝光照射能产生光胆红素，其在 pH3.7易被BOD氧化。此种假性增高对临床监控新生儿黄疽及鉴别生理性黄疽与初期的病理性黄疽有影响。 21胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素【评价】1BOD法特异性高，手工操作简便快速，也适合于自动生化分析仪操作。结合胆红素的BOD法测定，解决了长期以来用重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素条件的不同，包括试剂种类和浓度的不同，以及结合胆红素结合胆红素反应时间不同造成测定值变异大的问题，提高了结合胆红素分析的特异性和准确度。2本法测定结合胆红素，灵敏度和线性上限均较重氮反应法高。但手工分析因受分光光度计检测范围限制，只能做到342mol/L左右，分析仪测定上限可到427.5mol/L，最高达598.5mol/L。但需受BOD用量的限制。3由于BOD来源困难，价格高，目前尚无国产试剂盒提供，而进口试剂则价高，故此法尚很少在临床实验室应用。2223