专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯( ( ( (K K K K. . . .B B B B. . . .M M M Mu u u ul l l ll l l li i i is s s s) ) ) )发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位: :一一. .基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮碱基含氮碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OH”OH”OH”OH”和和和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在即在即在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3333和和和和5555碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3 3 3、5555磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNADNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OH”OH”OH”OH”末端称为末端称为末端称为末端称为3333端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5555端端端端3.3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3355，另一条链为，另一条链为5533）脱氧）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。. 与与 交替连接，排列在外侧，交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；构成基本骨架； 排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连接起来，形连接起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对，配对， 一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.DNA.DNA的复制的复制2.2.时期时期有丝分裂间期、减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期、减数第一次分裂前的间期。3.3.场所场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.1.概念概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。4.4.基本条件基本条件酶酶: :解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料: :四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.边解旋边复制边解旋边复制( (过程）过程）5.5.复制特点复制特点.半保留复制（结果）半保留复制（结果）6.6.遵循原则：遵循原则：碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因8.8.复制的意义复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了子分子通过复制使遗传信息从亲代传给了子代，从而保持了遗传信息的连续性。代，从而保持了遗传信息的连续性。规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：细胞内总结：细胞内DNADNA复制的基本要点复制的基本要点打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3333端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断. .PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）2.DNA2.DNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开始延端开始延伸伸DNADNA链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3.DNA3.DNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成方向的合成方向总是从子链的总是从子链的55端向端向33端延端延伸。伸。1.1.定义：定义：是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术。能以极片段的技术。能以极少量的少量的DNADNA为模板，在几小时内复制出上百万为模板，在几小时内复制出上百万份的份的DNADNA拷贝。拷贝。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断4.PCR4.PCR原理原理.在在8080100C100C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。构将解体，双链分开，这个过程称为变性。.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。.PCR.PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。质上也是一台能够自动调控温度的仪器。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解聚合酶解决了高温导致决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。5.Taq DNA5.Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用6.6.需要为需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质缓冲液缓冲液、DNADNA模板，分别与两条模板链相结合模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚聚合酶，同时通过控制温度使合酶，同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复制在体外反复进行。复进行。7.PCR7.PCR扩增的过程扩增的过程专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使以上。一定时间后，使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。应作准备。.复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合。单链的互补序列配对结合。.延伸延伸DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的一条新的DNADNA链。链。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断PCR PCR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断引物引物引物引物 引物引物引物引物 55553333555555553333555533333333PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断母链母链母链母链母链母链母链母链引物引物引物引物引物引物引物引物55553 3 3 3555555553333555533333333Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断母链母链母链母链 母链母链母链母链第第1 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.PCR.PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成，而是人工合成的的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸9.9.细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点（详见导学案）不同点（详见导学案）.PCR.PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的过对反应温度的控制来实现的10.PCR10.PCR的重要应用：的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。8.PCR8.PCR技术的特点：技术的特点：PCRPCRPCRPCR技术是技术是技术是技术是80808080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、它具有特异、敏感、产率高、快速、它具有特异、敏感、产率高、快速、它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性简便、重复性简便、重复性简便、重复性好、易自动化等突出。好、易自动化等突出。好、易自动化等突出。好、易自动化等突出。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断1 1、PCRPCR仪仪. .设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。用一次更换一次。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断1.1.准备准备2.2.移液移液. .实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。用手指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心离心约约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环仪的循环程序。程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494，5min5min5min5min30303030次次次次94949494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1minPCRPCR一般经历一般经历三十多次三十多次循环，每次循环可以分循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸. .专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6.6.注意事项注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断. .理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三三. .课题成果评价课题成果评价1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a2a2n n. .实验中实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与收峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2.2.过程过程.稀释稀释 2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即蒸馏水，即将样品进行将样品进行5050倍稀释倍稀释. .专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零。紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值.计算计算.计算计算DNADNA含量含量( ( g g) )50(260nm50(260nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数5050：50 50 g g /ml /ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的比色杯中的吸光值为吸光值为1 1。专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断光光吸吸收收值值波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.2专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断比色杯比色杯专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断