兔子免疫血清和无免疫血清兔子免疫血清和无免疫血清成分分析比较成分分析比较作者：钟园园、郑晓阳作者：钟园园、郑晓阳目录目录v前言前言v材料、仪器设备与方法材料、仪器设备与方法 v结果分析结果分析 v讨论与总结讨论与总结 前言前言 血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液体血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液体,具具有维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用。有维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用。它主要由水和各种化学成分组成它主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分包括这些化学成分包括白蛋白、白蛋白、1 、2 、- 球蛋白球蛋白,甘油三酯甘油三酯,总胆总胆固醇固醇,谷丙转氨酶等。动物在生命活动过程中常常会谷丙转氨酶等。动物在生命活动过程中常常会受到病原微生物的侵袭而发病甚至死亡。为了防止受到病原微生物的侵袭而发病甚至死亡。为了防止动物发生传染性疾病动物发生传染性疾病,所以常常对其进行免疫接种。所以常常对其进行免疫接种。动物获得免疫能力对自身生理有什么影响，这是一动物获得免疫能力对自身生理有什么影响，这是一个值得研究的方向。本实验主要是粗略地测量血清个值得研究的方向。本实验主要是粗略地测量血清中的成分在免疫后与无免疫中的含量变化，从宏观中的成分在免疫后与无免疫中的含量变化，从宏观上把握免疫对血清成分含量的影响。上把握免疫对血清成分含量的影响。前言前言 血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目,目目前国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷前国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷酸一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一酸一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一醋酥煮沸显色法及邻苯二甲醛一硫酸显色法和邻苯醋酥煮沸显色法及邻苯二甲醛一硫酸显色法和邻苯二甲醛法等。本实验我们采用的是邻苯二甲醛法。二甲醛法等。本实验我们采用的是邻苯二甲醛法。其在临床上的意义：血清中总胆固醇的浓度可作为其在临床上的意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的脂类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的代谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响代谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响血清总胆固醇的浓度。血清总胆固醇的浓度。前言前言 血清谷丙转氨酶活力的测定为一种较好的早期血清谷丙转氨酶活力的测定为一种较好的早期诊断肝炎的方法之一。其在临床上有重要意义：正诊断肝炎的方法之一。其在临床上有重要意义：正常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放入血中。所以血清中此酶活力很低。当肝脏、心放入血中。所以血清中此酶活力很低。当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。本实验采用纸层析法和比色法探究动物免疫依据。本实验采用纸层析法和比色法探究动物免疫对血清成分含量的影响。对血清成分含量的影响。 前言前言 分离、纯化与鉴定分离、纯化与鉴定球蛋白的方法很多，球蛋白的方法很多，本实验用醋酸纤维素膜电泳法对蛋白质进行本实验用醋酸纤维素膜电泳法对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速且可重复的方法。本次血清清蛋白与且可重复的方法。本次血清清蛋白与-球蛋球蛋白的分离与鉴定覆盖了传统生化技术，包括白的分离与鉴定覆盖了传统生化技术，包括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技术。术。 1. 1材料来源及处理v4号血清：由生命与环境科学学院生化试验室提供。从四只兔子分别提取号血清：由生命与环境科学学院生化试验室提供。从四只兔子分别提取血清用于生化实验，其中有一只兔子是有免疫的，其它的是未免疫的，血清用于生化实验，其中有一只兔子是有免疫的，其它的是未免疫的，血清提取出后置于冰箱冷藏。血清提取出后置于冰箱冷藏。 （血清主要由水和各种化学成分组成（血清主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分就包括白蛋白、这些化学成分就包括白蛋白、1 、2 、- 球蛋白球蛋白,甘油三酯甘油三酯,总胆固醇总胆固醇,谷丙转氨酶。大量实验证明谷丙转氨酶。大量实验证明将血清密封放入将血清密封放入-10 冰箱中长时间保存冰箱中长时间保存,由于水分和这些化学成分没有由于水分和这些化学成分没有变化变化,因此新鲜血清和因此新鲜血清和-10 保存一年的血清醋酸纤维素薄膜电泳后的血保存一年的血清醋酸纤维素薄膜电泳后的血清白蛋白、清白蛋白、1 、2 、- 球蛋白的百分值无显著差异球蛋白的百分值无显著差异,两种血清的甘两种血清的甘油三酯油三酯,总胆固醇总胆固醇,谷丙转氨酶也无明显差异。完全能满足实验的要求。谷丙转氨酶也无明显差异。完全能满足实验的要求。这不仅不浪费血清这不仅不浪费血清,而且方便又节省实验经费）。而且方便又节省实验经费）。v猪肝：由生命与环境科学学院生化试验室提供。几天前从菜市场买来置猪肝：由生命与环境科学学院生化试验室提供。几天前从菜市场买来置于冰箱里保鲜处理，到要用时取出（同上，冷藏对谷丙转氨酶影响不大）于冰箱里保鲜处理，到要用时取出（同上，冷藏对谷丙转氨酶影响不大）。1.2 仪器与设备v1.2.1 凝胶柱及架凝胶柱及架v1.2.2 30、37水浴箱水浴箱v1.2.3 定时器定时器v1.2.4 微量进样器微量进样器v1.2.5 分光光度计分光光度计v1.2.6 透析袋透析袋v1.2.7 电炉电炉v1.2.8 电子天平电子天平v1.2.9 水浴锅水浴锅v1.2.10 离心机离心机 v1.2.11准确的加样器准确的加样器1.4 方法方法v1.4.1 血清胆固醇的定量测定：邻苯二甲醛法血清胆固醇的定量测定：邻苯二甲醛法v1.4.2 血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定：盐析球蛋白的分离与鉴定：盐析法分离提纯蛋白质、透析法脱盐与蛋白质浓缩、凝法分离提纯蛋白质、透析法脱盐与蛋白质浓缩、凝胶过滤层析、醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血胶过滤层析、醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白清清蛋白v1.4.3 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定：谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定：纸层析法、分光光度法测定血清丙转氨酶的活力纸层析法、分光光度法测定血清丙转氨酶的活力结果分析 2.1.1血清总胆固醇的含量血清总胆固醇的含量 图图1血清总胆固醇标准曲线血清总胆固醇标准曲线 图2 兔子血清总胆固醇含量 由图由图2可知免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多可知免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多 样品样品吸光度吸光度胆固醇含胆固醇含量量/mg/mg不免疫不免疫兔子兔子血清血清0.0980.09837.337.3免疫兔免疫兔子血子血清清0.0160.0161.6521.652凝胶层析洗脱结果 图图3 凝胶层析洗脱曲线图凝胶层析洗脱曲线图 由图由图3可知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，且蓝可知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，且蓝葡聚糖在第葡聚糖在第10管，即约流出管，即约流出197ml时时,达到溶质数最大达到溶质数最大,即浓度最大；重即浓度最大；重铬酸钾在第铬酸钾在第24管，即约流出管，即约流出473ml时达到溶质数最大时达到溶质数最大全血清、清蛋白和全血清、清蛋白和-球蛋白球蛋白 电泳结果电泳结果 纯化的纯化的-球蛋白样品为一条带球蛋白样品为一条带（-球蛋白位置），正常兔子血球蛋白位置），正常兔子血清样品为五条带（清蛋白、清样品为五条带（清蛋白、1、2、及及-球蛋白）球蛋白）上清液的迁移距离上清液的迁移距离=2.50cm -球蛋白的迁移距离球蛋白的迁移距离=1.57cm全血清中：全血清中：-球蛋白的迁移距离球蛋白的迁移距离=1.52cm -球蛋白的迁移距离球蛋白的迁移距离=2.10cm-球蛋白的迁移距离球蛋白的迁移距离=2.50cm 上清液的迁移距离上清液的迁移距离 =2.78cm图图4 全血清、清蛋白和全血清、清蛋白和-球蛋白电泳球蛋白电泳谱图谱图兔子血清中谷丙转氨酶的活力单位测定兔子血清中谷丙转氨酶的活力单位测定 图图5 A520nm下酶活力单位的标准曲线下酶活力单位的标准曲线对照照未免疫兔子未免疫兔子4 4号免疫兔子号免疫兔子分光度分光度0 00.0850.0850.1120.112GPTGPT单位（位（100ml100ml）0 066.1166.1196.1196.11由右表可知免疫由右表可知免疫兔子血清中酶活兔子血清中酶活力单位比未免疫力单位比未免疫的大的大 图图6 6 纸层析结果图纸层析结果图 22讨论与总结 血清成分的变化能够对血液质量产生重血清成分的变化能够对血液质量产生重要影响。因而对血清成分的分析具有非常重要影响。因而对血清成分的分析具有非常重要的意义。本实验通过邻苯二甲醛法定量测要的意义。本实验通过邻苯二甲醛法定量测定血清胆固醇的含量定血清胆固醇的含量,血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白球蛋白的分离与鉴定的分离与鉴定,血清谷丙转氨酶活性的鉴定及血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定活力测定,对兔子血清的成分进行分析。对兔子血清的成分进行分析。 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） 本实验采用邻苯二甲醛法，操作简便，即无须将样本实验采用邻苯二甲醛法，操作简便，即无须将样品中的胆固醇提取出来或除去样品中的蛋白质，灵敏、品中的胆固醇提取出来或除去样品中的蛋白质，灵敏、稳定。在实验中，应注意几个事项，如硫酸含量的高低稳定。在实验中，应注意几个事项，如硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量应对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量应非常准确；加好溶液混合完毕要静置非常准确；加好溶液混合完毕要静置10minutes左右左右,使更好的混合等等。胆固醇是细胞膜的重要成分，人体使更好的混合等等。胆固醇是细胞膜的重要成分，人体内内90的胆同醇存在于细胞中，如果没有胆固醇，细胞的胆同醇存在于细胞中，如果没有胆固醇，细胞就会死亡；胆固醇还是人体内许多重要生物活性物质的就会死亡；胆固醇还是人体内许多重要生物活性物质的合成材料，如胆汁、性激素合成材料，如胆汁、性激素(如睾酮、雌二醇如睾酮、雌二醇)、肾上腺、肾上腺素素(如皮质醇如皮质醇)和维生素和维生素D3等。本实验得出免疫兔子血等。本实验得出免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多，原因可能是免清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多，原因可能是免疫影响了胆汁、性激素、肾上激素等的含量，进而影响疫影响了胆汁、性激素、肾上激素等的含量，进而影响血清中胆固醇的含量，这需进一步研究。血清中胆固醇的含量，这需进一步研究。血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 通过本实验测定，免疫兔子血清中酶活力单位比未免通过本实验测定，免疫兔子血清中酶活力单位比未免疫的大。可能的原因是免疫的兔子本身发生病变或者疫的大。可能的原因是免疫的兔子本身发生病变或者是免疫使兔子的细胞膜通透性增高，从而引起血清中是免疫使兔子的细胞膜通透性增高，从而引起血清中谷丙转氨酶活性提高，具体原因需进一步研究。谷丙转氨酶活性提高，具体原因需进一步研究。 本实验误差来来源可能为：将测定管和对照管置于水本实验误差来来源可能为：将测定管和对照管置于水浴中与二硝基苯肼作用浴中与二硝基苯肼作用20分钟过程中反应未完全。氢分钟过程中反应未完全。氢氧化钠的加入量不够准确氧化钠的加入量不够准确,这道接影响对照管的光密这道接影响对照管的光密度度, 使酶的活力出现偏高。与显色剂反应的温度未能使酶的活力出现偏高。与显色剂反应的温度未能控制好。这时控制好。这时, 对照管光密度偏低对照管光密度偏低,而测定管从而测定管从“ 水水浴中取出后浴中取出后, 管内温度仍高于室温管内温度仍高于室温, 反应可能接近完反应可能接近完全全, 因此测得的酶活力偏高。因此测得的酶活力偏高。血清清蛋白与血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定球蛋白的分离与鉴定 分离蛋白质需要经过很多步骤，这要求实验中分离蛋白质需要经过很多步骤，这要求实验中要做好每一步，如盐析、透析等等。在洗脱步骤中要做好每一步，如盐析、透析等等。在洗脱步骤中用蓝葡聚糖和重铬酸钾代替蛋白质通过凝胶柱用蓝葡聚糖和重铬酸钾代替蛋白质通过凝胶柱,由结由结果知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶果知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，说明蓝葡聚糖的分子量比重铬酸钾大。柱，说明蓝葡聚糖的分子量比重铬酸钾大。 在纤维素薄膜电泳中在纤维素薄膜电泳中, 纯化的纯化的-球蛋白样品为一条带球蛋白样品为一条带,正常兔子全血清样品为五条带（清蛋白、正常兔子全血清样品为五条带（清蛋白、1、2、及及-球蛋白）。由于实验误差较大，因此全血清中球蛋白）。由于实验误差较大，因此全血清中的的-球蛋白和清蛋白的迁移距离和纯化的球蛋白和清蛋白的迁移距离和纯化的-球蛋白球蛋白和清蛋白相差很大。但是通过鉴定也使我们了解血和清蛋白相差很大。但是通过鉴定也使我们了解血清中蛋白质的种类。清中蛋白质的种类。参考文献v1中级医刊中级医刊2：107，1962v2 林书林书. 影响血清转氨酶活力测定因素的探讨影响血清转氨酶活力测定因素的探讨. 福州市传染福州市传染病院病院,1978, (9):407-410v3 黄天锡黄天锡. 那些疾病和原因出现转氨酶增高那些疾病和原因出现转氨酶增高. 右江民族医学右江民族医学院附院院附院,1998:35-37v4 叶晓健，田纪伟，高岱峰，李家顺，贾连顺，赵书平叶晓健，田纪伟，高岱峰，李家顺，贾连顺，赵书平. 脊髓半切伤大鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性变化的研脊髓半切伤大鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性变化的研究究.中国临床康复中国临床康复,2004,8(17) :3282-3283 v5 董宁池董宁池,潘雪峨潘雪峨,金润昭金润昭,郭旭芹郭旭芹,张兴张兴. 五种血清总胆固五种血清总胆固醇测定方法的比较醇测定方法的比较. 陕西医学检验陕西医学检验,1994,9(4)：24-25v6 童和、胡纹、刘音、朱元因童和、胡纹、刘音、朱元因. 人和动物血清谷丙转氨酶人和动物血清谷丙转氨酶活力的测定活力的测定. 铁道部劳动卫生研究所工业毒物研究室铁道部劳动卫生研究所工业毒物研究室, 2003：28-24v7 河南扶沟县人民医院肝炎防治研究小组河南扶沟县人民医院肝炎防治研究小组. 血清谷丙转氛血清谷丙转氛酶升高在病毒性肝炎保护诊断应用上的凡个问题酶升高在病毒性肝炎保护诊断应用上的凡个问题.新医学新医学,1978，9(12):586-587