第第1616章章 植物原生质体融合技术植物原生质体融合技术Plant Protoplast Fusion What 基本原理基本原理 Why 技术应用技术应用 How 技术方法技术方法微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜液液 泡泡细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体植物植物细胞模式胞模式图细胞壁由三种主要成分构成胞壁由三种主要成分构成纤维素素25-50%、半半纤维素素53%和果胶和果胶5% What 基本原理基本原理 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 诱导原生质体融合形成杂种细胞诱导原生质体融合形成杂种细胞 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 从细胞团，愈伤组织到最后成株从细胞团，愈伤组织到最后成株 Why 技术应用技术应用植物原生质体融合的意义：克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件 How 技术方法技术方法第第1616章章 植物原生质体融合技术植物原生质体融合技术Plant Protoplast Fusion植物原生质体的制备植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的培养植物原生质体的融合植物原生质体的融合一、植物原生质体的制备一、植物原生质体的制备原生质体的概念及培养的意义原生质体的概念及培养的意义原生质体材料来源原生质体材料来源原生质体的分离原生质体的分离原生质体的纯化原生质体的纯化1 1、原生质体的概念及培养的意义、原生质体的概念及培养的意义概念：概念：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体意义：意义：（1）植物原生质体，具有再生完整植株的力。（2）为细胞融合研究提供了可能。有可能产生异源杂交新品种。（3）由于除去了细胞壁，降低了细胞的DNA酶活性，从而有助于外源DNA的进入。为再生成具有新性状的植物体提供有利条件。（4）是开展遗传理论研究的材料。植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位信息传递、能量转换信息传递、能量转换细胞壁合成机理细胞壁合成机理 膜的结构与功能膜的结构与功能核质关系核质关系杂交或自交不亲和的机理杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用细胞间的相互作用植物激素的作用机理植物激素的作用机理融合产生体细胞杂种融合产生体细胞杂种分离各种细胞器分离各种细胞器引入各种细胞器引入各种细胞器导入外源基因导入外源基因诱发突变体诱发突变体纯化后的叶肉原生质体纯化后的叶肉原生质体2 2、原生质体材料来源、原生质体材料来源 植物叶片植物叶片取材容易取材容易比比较容易用容易用酶解法分离解法分离 植物根尖组织植物根尖组织可由各种植物的种子萌可由各种植物的种子萌发后取得后取得 植物花粉植物花粉产生生单倍体原生倍体原生质体体 愈伤组织、悬浮培养的细胞愈伤组织、悬浮培养的细胞细胞壁容易解离胞壁容易解离3 3、原生质体的分离、原生质体的分离A、原生质体的分离方法原生质体的分离方法 机械分离法机械分离法先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。优点：优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。缺点：缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。 酶解分离法酶解分离法常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等优点：优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。缺点缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的活力。B、影响原生质体数量和活力的因素、影响原生质体数量和活力的因素1）不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构有差异细胞壁的组成和结构有差异2）渗透压稳定剂：渗透压稳定剂：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCl,MgSO4.7H2O)等3）质膜稳定剂：质膜稳定剂：如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等增加对质膜的稳定性4）酶液的酶液的pH值：值：一般在5）温度因子温度因子6）植物材料的生理状态：植物材料的生理状态：如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大C、分离原生质体所用的酶液和稳定剂、分离原生质体所用的酶液和稳定剂 烟草叶肉细胞：烟草叶肉细胞：0.5% Macerozyme R-10果胶酶+2% Onozuka R-10纤维素酶，0.7M 甘露醇。 烟草悬浮细胞：烟草悬浮细胞： 2% Driselase纤维素酶+2% Cellusase纤维素酶+ 0.5% Macerozyme果胶酶；海水。 胡萝卜悬浮培养的细胞：胡萝卜悬浮培养的细胞：2% Onozuka纤维素酶+0.5% Driselase纤维素酶+0.5% Rhoxyme半纤维素酶1% Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇+ 0.35M 山梨醇 甘蓝等的根细胞：甘蓝等的根细胞：4% Maicelase纤维素酶+2% Rhozyme半纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1% Pectolyase果胶酶 ；0.3M 葡萄糖4 4、原生质体的纯化、原生质体的纯化去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细胞器及其他碎片等杂质A、过滤法、过滤法B、漂浮法、漂浮法C、离心法、离心法例: 烟草叶肉细胞原生质体的分离1). 1). 材料的准备与消毒：材料的准备与消毒：2). 2). 酶解：酶解：3). 3). 纯化：纯化：4). 4). 原生质体的活力测定原生质体的活力测定1). 材料的准备与消毒选选取在温室中生取在温室中生长长两个月左右的烟草植株两个月左右的烟草植株从生从生长长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片经经自来水冲洗干自来水冲洗干净净后后放入放入70%70%乙醇中乙醇中进进行表面消毒行表面消毒然后再放入然后再放入2%2%次次氯氯酸酸钠钠溶液中溶液中处处理理1010分分钟钟接着用无菌水洗接着用无菌水洗涤涤3 34 4次，以充分除去消毒次，以充分除去消毒剂剂2). 酶解用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25252828 下经下经3-43-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）3). 纯化将酶解悬浮液通过将酶解悬浮液通过300-400300-400目网，以除去大的未消化的碎片目网，以除去大的未消化的碎片然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3 3次，使酶解液充分除去；次，使酶解液充分除去；最后用原生质体培养液离心一次最后用原生质体培养液离心一次分离、洗涤、纯化原生质体的试剂试剂试剂 分离分离 洗涤洗涤 纯化纯化KHKH2 2POPO4 4 27.2 mg 27.2 mg KNOKNO3 3 101 mg 101 mgCaClCaCl2 2.2H.2H2 2O 1480 mgO 1480 mgMgSOMgSO4 4.7H.7H2 2O 240 mgO 240 mgKI 0.16 mgKI 0.16 mgCuSOCuSO4 4.5H.5H2 2O 0.025mgO 0.025mg甘露醇甘露醇 13%13%纤维素酶纤维素酶 4%4%果胶酶果胶酶 0.4%0.4%蔗糖蔗糖 - - 21%- - 21%pH 5.6 5.6 5.6pH 5.6 5.6 5.6与与分分离离试试剂剂相相同同与与分分离离试试剂剂相相同同4).原生质体的活力测定形态：形态：把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可见到分离后缩小的原生把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。染色法：染色法：用用0.1%0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色用荧光素双醋酸酯（用荧光素双醋酸酯（FDAFDA）染色，在荧光显微镜下观察到带有荧光的是有活力的原生质体）染色，在荧光显微镜下观察到带有荧光的是有活力的原生质体FDA法的原理法的原理vFDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜自由出入细胞膜。v在在活活细胞中，细胞中，FDA被酯酶被酯酶裂解裂解，释放出有，释放出有极性的荧光素极性的荧光素。v荧光素荧光素不能自由穿越不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。质膜，在活细胞中积累。v荧光素在荧光素在死细胞中不能积累死细胞中不能积累。v在在UV照射下照射下，活细胞中的荧光素发出，活细胞中的荧光素发出绿色荧光绿色荧光。FDA荧光素荧光素活细胞活细胞死细胞死细胞请思考请思考活细胞活细胞死细胞死细胞FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为的母液，终浓度为0.01%原生质体分离纯化流程图原生质体分离纯化流程图第第1616章章 植物原生质体融合技术植物原生质体融合技术Plant Protoplast Fusion植物原生质体的制备植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的培养植物原生质体的融合植物原生质体的融合二、植物原生质体的培养二、植物原生质体的培养1 1、原生质体的培养方法、原生质体的培养方法2 2、原生质体培养程序、原生质体培养程序3 3、原生质体培养成功的技术关键、原生质体培养成功的技术关键固体培养法固体培养法原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察浅层液体培养法：浅层液体培养法：在培养皿或三角瓶中注入34ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养双层培养法双层培养法在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基1 1、原生质体的培养方法、原生质体的培养方法2 2、原生质体的培养程序、原生质体的培养程序细胞壁再生：细胞壁再生：体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。细胞分裂形成细胞团：细胞分裂形成细胞团：一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。器官形成植株再生：器官形成植株再生：从愈伤组织诱导发生胚状体发育3 3、原生质体培养成功的技术关键、原生质体培养成功的技术关键原生质体的活力原生质体的活力影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间原生质体密度原生质体密度起始密度一般为104-105 个/mL细胞壁再生速度细胞壁再生速度植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类原生质体培养的营养和环境原生质体培养的营养和环境培养基原生质体培养的环境：光照、温度、湿度第第1616章章 植物原生质体融合技术植物原生质体融合技术Plant Protoplast Fusion植物原生质体的制备植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的培养植物原生质体的融合植物原生质体的融合回顾：动物细胞融合技术简介回顾：动物细胞融合技术简介亲本的来源亲本的来源融合方法融合方法融合细胞的筛选融合细胞的筛选融合细胞的克隆融合细胞的克隆融合细胞的鉴定融合细胞的鉴定三、植物原生质体的融合三、植物原生质体的融合1 1、植物细胞融合的概念和意义、植物细胞融合的概念和意义2 2、植物细胞融合的程序、植物细胞融合的程序3 3、诱导细胞融合的方法及融合剂、诱导细胞融合的方法及融合剂4 4、细胞融合的影响因素、细胞融合的影响因素5 5、细胞杂种的选择和鉴定、细胞杂种的选择和鉴定1 1、植物细胞融合的概念和意义、植物细胞融合的概念和意义细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)概念：概念：又称细胞杂交(cell hybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。细胞融合的意义：细胞融合的意义：克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件2 2、植物细胞融合的程序、植物细胞融合的程序 原生质体分离的分离、纯化原生质体分离的分离、纯化 融合方法选择融合方法选择 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选愈伤组织形成器官分化植株再生愈伤组织形成器官分化植株再生杂种植物的鉴定杂种植物的鉴定3 3、诱导、诱导原生质体原生质体融合的方法及融合剂融合的方法及融合剂 盐类融合法 高Ca2+和高pH值融合 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 电融合法回顾：诱导动物细胞融合的方法回顾：诱导动物细胞融合的方法1 1、病毒诱导细胞融合、病毒诱导细胞融合2 2、化学融合剂诱导细胞融合、化学融合剂诱导细胞融合3 3、电融合法、电融合法A. 盐类融合法盐类融合法盐类融合剂种类盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合B. 高高Ca2+和高和高pH值融合值融合Ca2+浓度 0.05 mol/L具体做法具体做法( (以烟草为例以烟草为例) )取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37下保温0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；两种原生质体的融合率达到10%。C. 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间融合机制融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体D. PEG与高与高Ca2+和高和高pH值结合融合法值结合融合法先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合）再用培养液洗去高Ca2+和高pH值PEG诱导原生质体融合过程诱导原生质体融合过程E. 电融合法电融合法原理：原理：改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点：优点：对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。电融合基本过程1.将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中2.微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分3.平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体细胞电融合过程细胞电融合过程原生原生质体的融合体的融合过程包括程包括3个主要个主要阶段段：1)两个或多个原生两个或多个原生质体的体的质膜彼此靠近；膜彼此靠近；2)局部区域局部区域质膜膜紧密粘密粘连，彼此融合；，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。融合完成，形成球形的异核体或同核体。4 4、细胞融合的影响因素、细胞融合的影响因素PEGPEG诱导法：诱导法：PEG规格、纯度，作用时间电诱导法：电诱导法：原生质体密度交流电压 交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数 5 5、杂种细胞的选择和鉴定、杂种细胞的选择和鉴定A、融合体的类型、融合体的类型B、杂种细胞选择的方法、杂种细胞选择的方法C、细胞杂种的鉴定、细胞杂种的鉴定A、融合体的类型、融合体的类型自体融合：自体融合：发生在亲本原生质体自身异体融合异体融合谐和的细胞杂种谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体部分谐和的细胞杂种部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株异胞质体细胞杂种异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的嵌合细胞杂种嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物B、杂种细胞选择的方法、杂种细胞选择的方法互补选择法互补选择法( (遗传或抗性遗传或抗性) )：选择一个叶绿体缺失突变体，这一突变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织）可见标记法：可见标记法：凹穴培养皿分离法：根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别微吸管分离法：用一种向吸管根据可见标记吸取异核体，进行“看护培养”，以获得杂种植物生长特性选择法：生长特性选择法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。物理特性选择法：物理特性选择法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。其他方法：其他方法：如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。异硫异硫氰酸酸荧光素（光素（FITC）和）和异硫异硫氰酸酸罗丹明（丹明（RITC）分分别发出出绿色色和和红色色 荧光染料法光染料法两个两个亲本原生本原生质体在融合前用能体在融合前用能发不同不同颜色色荧光的光的荧光染料光染料进行染行染色。色。细胞分胞分类器辨器辨别和收集和收集发两种两种荧光的异核体。光的异核体。但但仪器价格昂器价格昂贵，不常用。，不常用。C、细胞杂种的鉴定、细胞杂种的鉴定（1 1）杂种植物形态特征、特性鉴定）杂种植物形态特征、特性鉴定（2 2）杂种植物的核型分析）杂种植物的核型分析（3 3）同工酶分析）同工酶分析（4) 4) 分子标记鉴定：分子标记鉴定： RFLPRFLP鉴定、鉴定、RAPDRAPD 标记鉴定标记鉴定18条染色体条染色体36条染色体条染色体几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子融合生物种类融合生物种类 细胞来源细胞来源 成功年代成功年代烟草两个种间 叶叶 1972甘蓝青菜 叶根 1972大豆马唐草 愈伤组织叶 1972矮牵牛龙面花 叶花瓣 1973 大麦花生 种子种子 1974大麦大豆 叶悬浮细胞 1974小麦矮牵牛 叶花瓣 1974玉米大豆 叶悬浮细胞 1974大豆野碗豆 悬浮细胞 悬浮细胞 1974大麦蚕豆 叶根 1975大豆草香木犀 悬浮细胞 叶 1976酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1976大豆烟草 悬浮细胞 叶 1976人胡萝卜 腹水癌细胞原生质体 1976番茄马铃薯 叶根尖 1978人小鼠 纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞 1978番茄番茄+马铃薯马铃薯1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato) 培育出的培育出的“泡马豆泡马豆”外型倾向于蕃茄，花叶果实具有杂种特点，外型倾向于蕃茄，花叶果实具有杂种特点，遗憾的是地下部分没有长出科学家们想象中的大土豆。遗憾的是地下部分没有长出科学家们想象中的大土豆。 THE END