Chapter3培养基培养基的成分培养基的成分培养基的配制培养基的配制培养基的筛选培养基的筛选n n培养基培养基(culturemedium)(culturemedium)的配制的配制是组培工作的核心。外植体之所以能沿着是组培工作的核心。外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化，其主要原因不同的组培途径生长、分化，其主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用。发育起着定向调控作用。n n在离体培养条件下，不同种植物在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在建立一项新的培养系统时，同。因此，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。有可能成功。 n n 事事事事实实实实上上上上，培培培培养养养养基基基基的的的的研研研研制制制制始始始始终终终终伴伴伴伴随随随随着着着着组组组组培培培培技技技技术术术术的的的的发发发发展展展展，整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：整个组培的发展史就是一部培养基的研制史： 1902190219021902 HaberlandtHaberlandtHaberlandtHaberlandt knopknopknopknop培培培培 养养养养 液液液液 SucSucSucSuc 失败失败失败失败 1934193419341934 WhiteWhiteWhiteWhite等等等等人人人人 无无无无机机机机有有有有机机机机（ V V V VB B B B） IAAIAAIAAIAA 脱脱脱脱分化分化分化分化 1957195719571957 SkoogSkoogSkoogSkoog&MillerMillerMillerMiller CYT/IAACYT/IAACYT/IAACYT/IAA 激激激激素素素素调调调调控控控控 再再再再分化分化分化分化 1958195819581958 StewardStewardStewardSteward 首首首首次次次次实实实实现现现现植植植植株株株株再再再再生生生生 里程碑里程碑里程碑里程碑 1965196519651965 VasilVasilVasilVasil 成成成成分分分分已已已已知知知知的的的的合合合合成成成成培培培培养养养养基基基基 单单单单CellCellCellCelln n培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如人的名字来命名，如人的名字来命名，如人的名字来命名，如WhiteWhiteWhiteWhite培养基，培养基，培养基，培养基，MurashigeMurashigeMurashigeMurashige和和和和SkoogSkoogSkoogSkoog培养培养培养培养基基基基( ( ( (简称简称简称简称MSMSMSMS培养基培养基培养基培养基) ) ) )，也有对某些成分进行改良称作改良培养，也有对某些成分进行改良称作改良培养，也有对某些成分进行改良称作改良培养，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。基。基。基。 一、培养基种类n n各种培养基都是建立在各种培养基都是建立在WhiteWhite和和GautheretGautheret培养基基础之上的。培养基培养基基础之上的。培养基数目之多到无法统计的地步。常用培数目之多到无法统计的地步。常用培养基不下几十种。养基不下几十种。二、培养基特点n n培养基：无机盐和离子浓度较高，比较稳培养基：无机盐和离子浓度较高，比较稳定的离子平衡溶液。养分数量和比例较合定的离子平衡溶液。养分数量和比例较合适，硝酸盐含量较其他培养基高，广泛应适，硝酸盐含量较其他培养基高，广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原生质体用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养。培养。nn5 5培养基：含有较低的铵，这个成分可能培养基：含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用，双子叶特对不少培养物生长有抑制作用，双子叶特别是木本植物适合于别是木本植物适合于B B5 5培养基。培养基。n n3.WhiteWhite：无机盐数量较低，适合于生根培：无机盐数量较低，适合于生根培养。养。n n培养基：适合于烟草叶肉原生质体培养。培养基：适合于烟草叶肉原生质体培养。n n培养基：有机成分较复杂，包括了所有的单培养基：有机成分较复杂，包括了所有的单糖和纤维素、呼吸代谢中的主要有机酸。广糖和纤维素、呼吸代谢中的主要有机酸。广泛应用于原生质体和细胞融合的研究。泛应用于原生质体和细胞融合的研究。nn6 6培养基：成分较简单，且培养基：成分较简单，且KNOKNO3 3和和(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4含含量高，应用于花药培养和组织培养。量高，应用于花药培养和组织培养。三、培养基成分1 1、基本培养基：提供组织生长的基础、基本培养基：提供组织生长的基础营养物质。营养物质。基本培养基无机有机基本培养基无机有机2 2、培养基的成分：、培养基的成分：培养基培养基= =无机有机激素固化剂其它无机有机激素固化剂其它n n1 1）无机成分）无机成分n n大量元素（或大量元素（或 100mg/L ）: n n N、 P、K、Ca、Mg、S S；n n微量元素（或微量元素（或100mg/L100mg/L）: :n n 铁铁(Fe)(Fe)、硼、硼(B)(B)、锰、锰(Mn)(Mn)、锌、锌(Zn)(Zn)、铜、铜(Cu)(Cu)、钼、钼(Mo)(Mo)、钴、钴(Co)(Co)、氯、氯(Cl)(Cl)。2）有机成分n有机成分（有机成分（organiccompoundorganiccompound）：指植物生长发育时必需的有机碳、指植物生长发育时必需的有机碳、氢、氮等物质。主要有糖、维生素、氢、氮等物质。主要有糖、维生素、肌醇、氨基酸等。肌醇、氨基酸等。糖（sugar）n n糖既可作为碳源，为培养的外植体糖既可作为碳源，为培养的外植体提供生长发育所需的碳骨架和能源外，提供生长发育所需的碳骨架和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。还具有维持培养基一定渗透压的作用。常用蔗糖，浓度为常用蔗糖，浓度为1 15%5%。维生素（vitamin）n n维生素类化合物在植物细胞里主要维生素类化合物在植物细胞里主要以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。对生长、分化等有很好的促进作用。使用量通常为。使用量通常为。肌醇（inositol）n n肌醇能帮助活性物质发挥作用，使肌醇能帮助活性物质发挥作用，使培养组织快速生长，促进胚状体及芽培养组织快速生长，促进胚状体及芽的形成。用量一般为的形成。用量一般为5050100mg/L100mg/L。氨基酸及有机添加物（aminoacidandorganicaddition）n n一种重要的有机氮源，除构成生物大一种重要的有机氮源，除构成生物大分子的基本组成外，还具有缓冲作用和调分子的基本组成外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外植体芽、节培养物体内平衡的功能，对外植体芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用。用。天然复合物n n大多含氨基酸、激素、酶等一些复大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。由于成分复杂，明显的促进作用。由于成分复杂，实验可重实验可重复性差，应尽量不用或少用。复性差，应尽量不用或少用。 但有时大胆启但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果用此类物质可能起到意想不到的效果。常用的有：常用的有：CHCH（水解酪蛋白）、（水解酪蛋白）、CMCM（椰子汁）（椰子汁）、MEME（麦芽浸提物）、（麦芽浸提物）、YEYE（酵母浸提物）、（酵母浸提物）、TJTJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯（番茄汁）、香蕉、马铃薯n n 1)1)1)1)椰椰椰椰乳乳乳乳（CMCMCMCM） 是是是是椰椰椰椰子子子子的的的的液液液液体体体体胚胚胚胚乳乳乳乳。它它它它是是是是使使使使用用用用最最最最多多多多、效效效效果果果果最最最最大大大大的的的的一一一一种种种种天天天天然然然然复复复复合合合合物物物物。一一一一般般般般使使使使用用用用浓浓浓浓度度度度在在在在10%20%10%20%10%20%10%20%，与与与与其其其其果果果果实实实实成成成成熟熟熟熟度度度度及及及及产产产产地地地地关关关关系系系系也也也也很很很很大大大大。它它它它在在在在愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织和和和和细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养中中中中有有有有促促促促进进进进作作作作用用用用。在在在在马马马马铃铃铃铃薯薯薯薯茎茎茎茎尖尖尖尖分分分分生生生生组组组组织织织织和和和和草草草草莓莓莓莓微微微微茎茎茎茎尖尖尖尖培培培培养养养养中中中中起起起起明明明明显显显显的的的的促促促促进进进进作作作作用用用用，但但但但茎尖组织的大小若超过茎尖组织的大小若超过茎尖组织的大小若超过茎尖组织的大小若超过1nun1nun1nun1nun时，椰乳就不发生作用。时，椰乳就不发生作用。时，椰乳就不发生作用。时，椰乳就不发生作用。n n2)2)2)2)香香香香蕉蕉蕉蕉（bananabananabananabanana） 用用用用量量量量为为为为150-200ml150-200ml150-200ml150-200mlL L L L。用用用用黄黄黄黄熟熟熟熟的的的的小小小小香香香香蕉蕉蕉蕉，加加加加入入入入培培培培养养养养基基基基后后后后变变变变为为为为紫紫紫紫色色色色。对对对对pHpHpHpH值值值值的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲作作作作用用用用大大大大。主主主主要要要要在在在在兰兰兰兰花花花花的的的的组组组组织织织织培养中应用，对发育有促进作用。培养中应用，对发育有促进作用。培养中应用，对发育有促进作用。培养中应用，对发育有促进作用。n n3)3)3)3)马马马马铃铃铃铃薯薯薯薯(potato)(potato)(potato)(potato) 去去去去掉掉掉掉皮皮皮皮和和和和芽芽芽芽后后后后，加加加加水水水水煮煮煮煮30min30min30min30min，再再再再经经经经过过过过过过过过滤滤滤滤，取取取取其其其其滤滤滤滤液液液液使使使使用用用用。用用用用量量量量为为为为150200g150200g150200g150200gL L L L。对对对对pHpHpHpH值值值值缓缓缓缓冲冲冲冲作作作作用用用用也也也也大大大大。添添添添加后可得到健壮的植株。加后可得到健壮的植株。加后可得到健壮的植株。加后可得到健壮的植株。n n4)4)4)4)水水水水解解解解酪酪酪酪蛋蛋蛋蛋白白白白（CHCHCHCH） 为为为为蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的水水水水解解解解物物物物，主主主主要要要要成成成成分分分分为为为为氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸，使使使使用用用用浓浓浓浓度度度度为为为为100200mg100200mg100200mg100200mgL L L L。受受受受酸酸酸酸和和和和酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用易易易易分分分分解解解解，使使使使用用用用时时时时要要要要注注注注意。意。意。意。n n5)5)5)5)其他其他其他其他酵母提取液酵母提取液酵母提取液酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)(YE)(0.01%-0.05%)(YE)(0.01%-0.05%)(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维，主要成分为氨基酸和维，主要成分为氨基酸和维，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液生素类；麦芽提取液生素类；麦芽提取液生素类；麦芽提取液(0.01%(0.01%(0.01%(0.01%0.5%)0.5%)0.5%)0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜、苹果和番茄的果汁、黄瓜、苹果和番茄的果汁、黄瓜、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。用，有时有效。用，有时有效。用，有时有效。 n n实验设想：目前已经组培成功的实验设想：目前已经组培成功的植物只有植物只有40004000余种，对一些难于培养的余种，对一些难于培养的植物种类，可否将其组织捣碎，分离汁植物种类，可否将其组织捣碎，分离汁液作为培养基的添加剂，以其有所突破液作为培养基的添加剂，以其有所突破？3）植物生长调节物质（plantgrowthregulator）n n对外植体愈伤组织的诱导和根、芽对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起重要和明显的调节作等器官分化，起重要和明显的调节作用。用。生长素类（auxin）n n促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导愈伤组织形成，促进生根。常用生导愈伤组织形成，促进生根。常用生长素有长素有IAAIAA、NAANAA、IBAIBA和和2,4-D2,4-D，作用，作用强弱依次为强弱依次为2,4-D2,4-DNAANAAIBAIBAIAAIAA。细胞分裂素（cytokinin）n促进细胞分裂，抑制衰老，由愈伤组促进细胞分裂，抑制衰老，由愈伤组织或器官上分化不定芽。常用的细胞分裂织或器官上分化不定芽。常用的细胞分裂素有激动素素有激动素(KT)(KT)、异戊烯基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤(2iP)(2iP)、6-6-苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤(BAP)(BAP)、玉米素、玉米素(Zt)(Zt)、噻重氮、噻重氮苯基脲苯基脲(TDZ)(TDZ)，作用强弱依次为，作用强弱依次为TDZTDZZtZt2iP2iPBAPBAPKTKT。其他类n n除了生长素和细胞分裂素外，赤霉除了生长素和细胞分裂素外，赤霉素（素（GAGA3 3）、脱落酸（）、脱落酸（ABAABA）、多效）、多效唑（唑（PP333PP333）和乙烯类等。）和乙烯类等。4）其他附加物n n琼脂：使培养基固化，防止培养物浸琼脂：使培养基固化，防止培养物浸入培养液中导致缺氧而死亡。使用浓入培养液中导致缺氧而死亡。使用浓度一般为度一般为1%1%。n n活性炭：吸附有毒、有害的化合物。活性炭：吸附有毒、有害的化合物。5）pH值n培养基的培养基的pHpH值在高温高压灭菌前值在高温高压灭菌前一般调至，一般调至，pHpH值高于时，培养基会值高于时，培养基会变硬，低于时，琼脂凝固效果不好。变硬，低于时，琼脂凝固效果不好。四、培养基的选择n n培养基基本培养基培养基基本培养基植物激素植物激素（物质基础（物质基础 ）（调控手（调控手段）段）生存生存发展发展n n培养基的选择在实质上讲就是设计营养培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现物质与激素（种类、用量）的最佳组合，实现离体细胞的生长、分化与植株再生。而最佳组离体细胞的生长、分化与植株再生。而最佳组合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效合的结论作出，需研制培养基配方并试验其效果。果。n n在建立一个新的实验体系时，为了能在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好研制出一种适合的培养基，最好先由一种已先由一种已被广泛使用的基本培养基被广泛使用的基本培养基( (如如MsMs培养基或培养基或B5B5培养基培养基) )开始开始。当通过一系列的实验，对这。当通过一系列的实验，对这种培养基的种培养基的物质种类、用量、比例关系物质种类、用量、比例关系作出作出适当调整后，即有可能得到一种能满足实验适当调整后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。选择最佳培养基，常用试需要的新培养基。选择最佳培养基，常用试验方法主要有验方法主要有单因子试验、多因子试验及广单因子试验、多因子试验及广谱实验谱实验等。等。1 1、单因子试验、单因子试验n n在试验中，培养基中其他成分都维持在试验中，培养基中其他成分都维持在一般水平上，只变动一个因子，通过试在一般水平上，只变动一个因子，通过试验可以找出这一因子对试验的影响和影响验可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。的程度。这种只研究一个因素的试验就是这种只研究一个因素的试验就是单因子试验单因子试验。n n例：以例：以MSMS为基本培养基，分别对为基本培养基，分别对BABA和和NAANAA作单作单因子分析：因子分析：MSMSBABA2 2 2 2NAANAAm m （、）（、）MS+BAMS+BAn n+NAA+NAA0.10.10.10.1（、）（、）局限性：探索范围难于把握，不能反映各种单因局限性：探索范围难于把握，不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响。子成分之间的组合效果与相互影响。 2 2、多因子试验、多因子试验n n对培养基中两个或两个以上因素对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验进行研究的试验称为多因子实验。n n试验可采用完全试验方案，也可试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案。完全试验方案具有均选用正交设计方案。完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。互搭配，构成了所有可能的处理组合。n n例如研究例如研究NAANAA和和6-BA6-BA的最佳浓度组的最佳浓度组合，每个因子各设合，每个因子各设5 5个浓度水平个浓度水平(0(0，5 5，10mg10mgL)L)，这两种因子各种浓度的所有，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有组合，就构成了一个具有2525项处理的试验。项处理的试验。2种激素种激素5种种浓度的度的实验组合合BABABABA（mg/Lmg/Lmg/Lmg/L）00.52.5500.52.5500.52.5500.52.5510101010NAA0123NAA0123NAA0123NAA012345454545(mg/L)0.5678(mg/L)0.5678(mg/L)0.5678(mg/L)0.56789109109109102.51112132.51112132.51112132.5111213141514151415141551617516175161751617181920181920181920181920102122231021222310212223102122232425242524252425n n完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多越复杂，消耗的精力、物力越多越复杂，消耗的精力、物力越多越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，。为了减少试验处理，。为了减少试验处理，。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用但又能准确全面地获得试验信息，通常采用但又能准确全面地获得试验信息，通常采用但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验正交试验正交试验正交试验。例如，采用正交设计，在使用例如，采用正交设计，在使用例如，采用正交设计，在使用例如，采用正交设计，在使用L9L9L9L9表时就可以安排表时就可以安排表时就可以安排表时就可以安排4 4 4 4个因个因个因个因子，子，子，子，3 3 3 3种水平的试验，一共做种水平的试验，一共做种水平的试验，一共做种水平的试验，一共做9 9 9 9种不同搭配的试验，其结种不同搭配的试验，其结种不同搭配的试验，其结种不同搭配的试验，其结果相当于做了果相当于做了果相当于做了果相当于做了27272727次种搭配的试验。在组织培养研究中，次种搭配的试验。在组织培养研究中，次种搭配的试验。在组织培养研究中，次种搭配的试验。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。n n例如：例如：例如：例如：A A A A、B B B B、C C C C、D D D D四个变动因子，四个变动因子，四个变动因子，四个变动因子，各有各有各有各有1 1 1 1、2 2 2 2、3 3 3 3三三三三种不同水平，则种不同水平，则种不同水平，则种不同水平，则可如图设计实验：可如图设计实验：可如图设计实验：可如图设计实验：对结果进行方差对结果进行方差对结果进行方差对结果进行方差分析与显著性分分析与显著性分分析与显著性分分析与显著性分析即可了解析即可了解析即可了解析即可了解4 4 4 4种种种种不同因子的影响不同因子的影响不同因子的影响不同因子的影响力。力。力。力。因子因子因子因子ABCABCABCABCD D D D序号序号序号序号 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 2 2 2 1 3 3 3 1 3 3 32122122122123 3 3 32232232232231 1 1 12312312312312 2 2 23133133133132 2 2 23213213213213 3 3 33323323323321 1 1 13 3、逐步添加和逐步排除的试验方法：、逐步添加和逐步排除的试验方法：n n在植物组织分化与再生的研究中，在没有在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种到这种加加减减加加减减的简单方法。的简单方法。 4 4 4 4、广谱实验法、广谱实验法、广谱实验法、广谱实验法n n在广谱实验法中，把培养基中所有组分分在广谱实验法中，把培养基中所有组分分在广谱实验法中，把培养基中所有组分分在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为为为为4 4 4 4大类：无机盐、有机营养物质大类：无机盐、有机营养物质大类：无机盐、有机营养物质大类：无机盐、有机营养物质( ( ( (蔗糖、氨基酸蔗糖、氨基酸蔗糖、氨基酸蔗糖、氨基酸和肌醇等和肌醇等和肌醇等和肌醇等) ) ) )、生长素、细胞分裂素。对每一类物质、生长素、细胞分裂素。对每一类物质、生长素、细胞分裂素。对每一类物质、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低选定低选定低选定低(L)(L)(L)(L)、中、中、中、中(M)(M)(M)(M)、和高、和高、和高、和高(H)3(H)3(H)3(H)3个浓度。个浓度。个浓度。个浓度。4 4 4 4类物质各类物质各类物质各类物质各3 3 3 3种浓度的自由组合即构成了一项包括种浓度的自由组合即构成了一项包括种浓度的自由组合即构成了一项包括种浓度的自由组合即构成了一项包括81818181个处理的个处理的个处理的个处理的实验。在这实验。在这实验。在这实验。在这81818181个处理中最好的一个可用个处理中最好的一个可用个处理中最好的一个可用个处理中最好的一个可用4 4 4 4个字母表个字母表个字母表个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为养物质的处理即可表示为养物质的处理即可表示为养物质的处理即可表示为MLMHMLMHMLMHMLMH。达到这个阶段，。达到这个阶段，。达到这个阶段，。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生长素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。n n科学安排研究顺序：科学安排研究顺序：基本培养基的选择：基本培养基的选择： 通常会以一种或几种已知的基本培养基通常会以一种或几种已知的基本培养基为起点，通过实验确定出合适的营养物质为起点，通过实验确定出合适的营养物质水平。水平。激素配比的选择：激素配比的选择： 通过单因子分析、多因子实验、正交实通过单因子分析、多因子实验、正交实验等方法确定出最佳激素配比模式。验等方法确定出最佳激素配比模式。糖浓度的选取：糖浓度的选取： 大多数植物大多数植物2或或3，少数，少数4；花药；花药培养时糖浓度要求较高，培养时糖浓度要求较高，715，其主，其主要作用在于调节基质渗透压。要作用在于调节基质渗透压。PH值的选取：值的选取： 植物组织对植物组织对PH值要求不高，一般，个值要求不高，一般，个别喜酸或喜碱，可结合植物的生长习性适别喜酸或喜碱，可结合植物的生长习性适当调整，也可通过单因子分析加以确定。当调整，也可通过单因子分析加以确定。n n5 5、综合因子的确定：、综合因子的确定：在各个单项因子的条件找到以在各个单项因子的条件找到以后，综合进行全面实验，并根据实验情况后，综合进行全面实验，并根据实验情况作出适当调整，即可确定出最佳培养基配作出适当调整，即可确定出最佳培养基配方。方。五、培养基的制备1.母液的配制n n优点：优点：1 1）可减少每次配制称量药）可减少每次配制称量药品的麻烦；品的麻烦；2 2）减少极微量药品在每次）减少极微量药品在每次称量时造成的误差。称量时造成的误差。（1）大量元素混合母液n n配制成配制成1010倍的母液倍的母液n n1 1）各化合物必须充分溶解后才能混合；）各化合物必须充分溶解后才能混合；n n2 2）混合时注意先后顺序，特别要将）混合时注意先后顺序，特别要将CaCa2+2+、MnMn2+2+、BaBa2+2+和和SOSO4 42-2-、POPO4 43-3-错开，以免产生错开，以免产生沉淀。沉淀。n n3 3）混合时要慢，边搅拌边混合。）混合时要慢，边搅拌边混合。（2）微量元素混合母液n n除了除了FeFe以外的以外的B B、MnMn、CuCu、ZnZn、MoMo、ClCl等盐类的混合溶液，因含量低，一等盐类的混合溶液，因含量低，一般配制成般配制成100100倍，也要注意顺序溶解后倍，也要注意顺序溶解后再混合，以免沉淀。再混合，以免沉淀。（3）铁盐母液n n将将FeSOFeSO4 47H7H2 2O O和和NaNa2 2-EDTA2H-EDTA2H2 2O O分分别置于别置于450ml450ml蒸馏水中，加热并不断搅蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解，然后将拌使之溶解，然后将2 2种溶液混合，把种溶液混合，把pHpH调到，加蒸馏水至调到，加蒸馏水至1L1L，可配成，可配成100100倍倍或或200200倍母液。倍母液。（4）有机化合物母液n n主要是维生素和氨基酸类物质，主要是维生素和氨基酸类物质，可配制成可配制成100100或或200200。（5）植物激素n n每种激素必须单独配制成母液，浓每种激素必须单独配制成母液，浓度为每毫升含、激素，用时根据需度为每毫升含、激素，用时根据需要取用，激素一般浓度表示方法为要取用，激素一般浓度表示方法为mg/mlmg/ml。2.培养基的配制n n1 1）融化琼脂）融化琼脂称出规定数量的琼脂和蔗糖，称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水到培养基最终体积的加水到培养基最终体积的2/32/3，加热使之，加热使之溶解。溶解。n n2 2）混合培养基中各成分，依次加入大量、）混合培养基中各成分，依次加入大量、微量、铁盐和有机成分。微量、铁盐和有机成分。n n3 3）加蒸馏水至培养基的最终容积。）加蒸馏水至培养基的最终容积。n n4 4）用）用pHpH计或计或pHpH试纸测试纸测pHpH值，并用或值，并用或NaOHNaOH进行调节。进行调节。n n5 5）分装）分装将配制好的培养基分装于将配制好的培养基分装于培养容器内，并用棉筛或封口膜封培养容器内，并用棉筛或封口膜封好瓶口。好瓶口。n n6 6）灭菌）灭菌用高温高压灭菌，一般在用高温高压灭菌，一般在121121下灭菌下灭菌151520min20min。n n7 7）放置备用）放置备用使培养基在室温下冷使培养基在室温下冷却，置冰箱中却，置冰箱中44保存。保存。Chapter4Chapter4外植体外植体植物体的各个部位，如根、茎、叶、植物体的各个部位，如根、茎、叶、花瓣、花药、胚珠、块茎、茎尖、维管组织、花瓣、花药、胚珠、块茎、茎尖、维管组织、髓部等。髓部等。植物种类不同，同一植物不同器官，植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应能力同一器官不同生理状态，对外界诱导反应能力及分化再生能力不同及分化再生能力不同 。一、外植体种类一、外植体种类1 1、植物基因型、植物基因型植物基因型不同，组织培养的难易程植物基因型不同，组织培养的难易程度不同，草本植物比木本植物易于通过组织培养度不同，草本植物比木本植物易于通过组织培养获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培养。养。选择适宜的外植物，首先要对材料的选择适宜的外植物，首先要对材料的选择有明确的目的，选取优良的或特殊的具有一选择有明确的目的，选取优良的或特殊的具有一定代表性的基因型，这样可提高成功率，增加其定代表性的基因型，这样可提高成功率，增加其实用价值。实用价值。2 2、外植体来源、外植体来源从田间或温室中生长健壮的无病虫害从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作外植体，的植株上选取发育正常的器官或组织作外植体，离体培养易于成功。离体培养易于成功。同一植物不同部位之间的再生能力差别同一植物不同部位之间的再生能力差别较大。较大。最好对所要培养的植物各部位的诱导最好对所要培养的植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选合适的、最易再及分化能力进行比较，从中筛选合适的、最易再生的部位作为最佳外植体。生的部位作为最佳外植体。茎尖是较好的外植体。茎尖是较好的外植体。3 3、外植体大小、外植体大小外植体的大小，应根据培养目外植体的大小，应根据培养目的而定。外植体过大，杀菌不彻底，易于的而定。外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小，离体培养难于成活。一般外污染；过小，离体培养难于成活。一般外植体大小在为宜。植体大小在为宜。4 4、取材季节、取材季节离体培养的外植体最好在植物生离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季长的最适时期取材，即在其生长开始的季节采样，若在生长末期或已经进入休眠期节采样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。应。5 5、外植体的生理状态和发、外植体的生理状态和发育年龄育年龄外植体的生理状态和发育年龄外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生。一直接影响离体培养过程中的形态发生。一般情况下，越幼嫩，年限越短的组织具有般情况下，越幼嫩，年限越短的组织具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。较高的形态发生能力，组织培养越易成功。（1 1）选择优良的种质）选择优良的种质无论是离体培养繁殖种苗，或者是无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。加其实用价值。 材料选取的原则材料选取的原则（2 2）选择健壮的植株）选择健壮的植株组织培养用的材料，最好从生长健组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织；要在晴天，最好是中午或下午取材或组织；要在晴天，最好是中午或下午取材料，绝不要在雨天、阴天或露水未干时取样。料，绝不要在雨天、阴天或露水未干时取样。因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的组织有自身消毒作用，再生能力强，比较容组织有自身消毒作用，再生能力强，比较容易培养成功。易培养成功。（3 3）选择最适的时期）选择最适的时期组织培养选择材料时，要注意植组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。这时比较容易形成愈伤组织。（4 4）选取适宜的大小）选取适宜的大小建立无菌材料时，取材的大小根建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在。难于成活。一般选取培养材料的大小，在。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。小。（5 5）选取适宜的消毒剂）选取适宜的消毒剂完全地杀死材料表面的微生物，完全地杀死材料表面的微生物，表面消毒的基本要求是既要杀死材料表表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面全部微生物，又要不伤害材料，选用面全部微生物，又要不伤害材料，选用适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间，适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间，灵活掌握和使用。灵活掌握和使用。二、外植体接种二、外植体接种外植体接种（外植体接种（explantinoculationexplantinoculation）：）：是把经过表面消毒后的植物材料在超净工作台上是把经过表面消毒后的植物材料在超净工作台上切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它 们转们转放到无菌培养基上的全部操作过程。放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操作过程整个接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。注意防止工作人员本身引起的污染。外植体接种操作外植体接种操作11）入无菌室前要用肥皂洗手，）入无菌室前要用肥皂洗手，去掉指甲中污物；去掉指甲中污物；22）入室时要穿上经过消毒的工）入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩、鞋子等；作服、帽子、口罩、鞋子等；33）操作前要用）操作前要用70%70%酒精擦洗工作人酒精擦洗工作人员手，操作中要经常用员手，操作中要经常用70%70%酒精擦手和台面。酒精擦手和台面。特别注意防止特别注意防止“双重传递双重传递”的污染，例如器械的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。被手污染后又污染培养基等。 44）在打开培养瓶、三角瓶或试管时，）在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，必须在酒精灯火焰处进行操内，解决这个问题，必须在酒精灯火焰处进行操作，可在打开前用火焰烧瓶口，盖瓶盖前将瓶口作，可在打开前用火焰烧瓶口，盖瓶盖前将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。然后盖上。 如果培养液接触了瓶口，则瓶口要如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到烧到 足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。5 5）每次重新操作前都要把工具在火）每次重新操作前都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。焰上消毒，避免交叉污染。 66）工作人员的呼吸也是污染的主要）工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。应禁止不必要的谈话并戴上口罩。7 7）由于空气中有灰尘，因此在操作）由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在般在使用前浸泡在95%95%酒精中，用时在火焰上酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。用具消毒。三、培养条件三、培养条件接种后的外植体应送到培养室去培接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pHpH值等。值等。1 1 1 1、光照、光照、光照、光照通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进加强光照，可以使小苗生长健壮，促进加强光照，可以使小苗生长健壮，促进加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养异养异养异养”向向向向“自自自自养养养养”转化，提高移植的成活率。转化，提高移植的成活率。转化，提高移植的成活率。转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照普通培养室要求每日光照普通培养室要求每日光照普通培养室要求每日光照12h-16h12h-16h12h-16h12h-16h，光照强度，光照强度，光照强度，光照强度1000lx-5000lx1000lx-5000lx1000lx-5000lx1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可。如果培养材料要求在黑暗中生长，可。如果培养材料要求在黑暗中生长，可。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。暗室中培养。暗室中培养。暗室中培养。2 2、温度、温度离体培养中对温度的调控要比光离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在生长温度，大多数植物最适温度在2323 C-C-3232 C C之间。培养室一般所用的温度是之间。培养室一般所用的温度是2525 C2C2 C C。低于。低于1515 C C或高于或高于3535 C C，对生，对生长都是不利的。长都是不利的。3 3、湿度、湿度组织培养中的湿度影响主要有两个方面，组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-70%-80%80%的相对湿度。的相对湿度。4 4、氧气、氧气植物组织培养中，外植体的呼吸植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。决通气的良好办法。四、外植体褐变四、外植体褐变1 1、概念、概念褐变（褐变（browningbrowning）是指外植体在培是指外植体在培养过程中，自身组织从表面向培养基释放出养过程中，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，一般主要是酶促褐变引起的。由于多酚氧一般主要是酶促褐变引起的。由于多酚氧化酶催化酚类化合物形成醌和水，醌再经化酶催化酚类化合物形成醌和水，醌再经非酶促聚合，因而形成深色物质，对外植非酶促聚合，因而形成深色物质，对外植体产生毒害。体产生毒害。2、褐变的原因、褐变的原因1 1）植物种类及基因型）植物种类及基因型不同种植物、同种植物不同类型、不同不同种植物、同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变。生褐变。2 2）外植体部位及生理状态）外植体部位及生理状态外植体部位及生理状态不同，接种后褐外植体部位及生理状态不同，接种后褐变的程度不同。幼龄材料一般比成龄材料褐变轻；变的程度不同。幼龄材料一般比成龄材料褐变轻；取材时期不同，褐变程度不同。取材时期不同，褐变程度不同。3、褐变的影响因素、褐变的影响因素3 3）外植体受伤害程度）外植体受伤害程度外植体受伤害程度可影响褐变，化学消外植体受伤害程度可影响褐变，化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。4 4）培养基成分及培养条件）培养基成分及培养条件初代培养时，培养基中无机盐浓度过高初代培养时，培养基中无机盐浓度过高可导致外植体褐变；激素使用不当，也会使组织可导致外植体褐变；激素使用不当，也会使组织培养材料褐变；培养基中的高培养材料褐变；培养基中的高pHpH明显加重褐变；明显加重褐变；培养条件不适加速褐变。培养条件不适加速褐变。5 5）培养时间过长）培养时间过长4 4、褐变的预防、褐变的预防1 1）选择适当的外植体选择适当的外植体2 2）对外植体进行预处理对外植体进行预处理3 3）选择适宜的培养基和培养条件选择适宜的培养基和培养条件4 4）添加褐变抑制剂和吸附剂添加褐变抑制剂和吸附剂5 5）连续转移连续转移五、外植体的玻璃化五、外植体的玻璃化现象及其预防措施现象及其预防措施玻璃化玻璃化是指组培苗出现叶、嫩梢呈是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。含量低的现象。 1 1、现象、现象2 2、玻璃化苗的危害性、玻璃化苗的危害性由于其组织畸形，吸收养料与光由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。料；加上生根困难，很难移栽成活。3 3、玻璃化的原因、玻璃化的原因玻璃化的起因是细胞生长过程中玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。光照时间、通风条件等。（1 1）激素浓度）激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。例高），易导致玻璃化苗的产生。 （2 2）琼脂浓度）琼脂浓度 培养基中琼脂浓度低时玻璃化培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。因此，琼脂的浓度一定要适当。 （3 3）温度）温度适宜的温度可以使试管苗生长适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。 （4 4）光照时间）光照时间 不同的植物对光照的要求不同，不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在正常。大多数植物在10h10h12h12h光照下都光照下都能生长良好，光照时数大于能生长良好，光照时数大于15h15h时，玻璃时，玻璃化苗的比例明显增加。化苗的比例明显增加。 （5 5） 通风条件通风条件试管苗生长期间，要求有足够的气试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。气体交换不良，易发生玻璃化。 （6 6）离子水平）离子水平 植物生长需要一定的矿物质营养，但植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生是，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。植物，玻璃化苗的比例就会增加。 4 4、预防玻璃化的措施、预防玻璃化的措施（1 1）适当控制培养基中无机营养成分）适当控制培养基中无机营养成分 大多数植物在大多数植物在MSMS培养基上生长良好，培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于玻璃化苗的比例较低，主要是由于MSMS培养基培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。璃化苗的比例。（2 2）适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度）适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 适适当当提提高高培培养养基基中中蔗蔗糖糖的的含含量量，可可降降低低培培养养基基中中的的渗渗透透势势，减减少少外外植植体体从从培培养养基基中中可可获获得得的的水水分分；而而适适当当提提高高培培养养基基中中琼琼脂脂的的含含量量，可可降降低低培培养养基基的的衬衬质质势势，造造成成细细胞胞吸吸水水阻阻遏遏，也也可可降降低低玻玻璃璃化化，如如将将琼琼脂脂浓浓度提高到度提高到1.1%1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。（3 3）适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度）适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 细细胞胞分分裂裂素素和和赤赤霉霉素素可可以以促促进进芽芽的的分分化化，但但是是为为了了防防止止玻玻璃璃化化现现象象，应应适适当当减减少少其其用用量量，或或增增加加生生长长素素的的比比例例。在在继继代代培培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。（4 4）增加自然光照，控制光照时间）增加自然光照，控制光照时间 在试验中发现，玻璃苗放在自然光在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以物以8h 8h 12h12h为宜；光照强度在为宜；光照强度在1000lx1000lx1800lx1800lx之间，就此可以满足植物生长的要求。之间，就此可以满足植物生长的要求。（5 5）控制好温度）控制好温度培养温度要适宜植物的正常生长发培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用400C400C热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。织芽的分化频率。（6 6）改善培养器皿的气体交换状况）改善培养器皿的气体交换状况如使用棉塞、滤纸片或通气好的如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。封口膜封口。（7 7）在培养基中添加其它物质）在培养基中添加其它物质在培养基中加入间苯三酚或根皮在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效地减轻或防治试管苷或其它添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化。苗玻璃化。添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生频添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生频添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生频添加马铃薯法可降低油菜的玻璃苗的产生频率；率；率；率；用多效唑或用多效唑或用多效唑或用多效唑或10mg/L10mg/L10mg/L10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石的矮壮素可减少重瓣丝石的矮壮素可减少重瓣丝石的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；竹试管苗玻璃化的发生；竹试管苗玻璃化的发生；竹试管苗玻璃化的发生；添加的聚乙烯醇也成为防治苹果砧木玻璃添加的聚乙烯醇也成为防治苹果砧木玻璃添加的聚乙烯醇也成为防治苹果砧木玻璃添加的聚乙烯醇也成为防治苹果砧木玻璃化的措施；化的措施；化的措施；化的措施；在培养基中加入在培养基中加入在培养基中加入在培养基中加入0.3%0.3%0.3%0.3%的活性炭还可降低玻璃的活性炭还可降低玻璃的活性炭还可降低玻璃的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。例如：例如：六、继代培养六、继代培养1.1.概念概念继代培养（继代培养（subculturesubculture）：组织培组织培养中，培养物培养一段时间后，为了防止培养中，培养物培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，将其及时转移到新鲜培养基中的过程就是将其及时转移到新鲜培养基中的过程就是继代培养时间的长短因植物材料不继代培养时间的长短因植物材料不同、培养方法和实验目的的不同而不同。一同、培养方法和实验目的的不同而不同。一般液体培养的继代时间短，般液体培养的继代时间短，1 1周左右继代周左右继代1 1次；次；固体培养继代时间长些，固体培养继代时间长些，2 24 4周继代周继代1 1次。次。2 2、体细胞无性系变异、体细胞无性系变异体细胞无性系变异（体细胞无性系变异（somaclonalsomaclonalvariationvariation）可能的原因：）可能的原因：从细胞水平上发现，体细胞培养的植株从细胞水平上发现，体细胞培养的植株染色体数目和结构发生改变，引起基因染色体数目和结构发生改变，引起基因 重排，重排，产生多倍体和非整倍体。染色体缺失、倒位、易产生多倍体和非整倍体。染色体缺失、倒位、易位、断裂等都是在细胞水平上导致无性系变异的位、断裂等都是在细胞水平上导致无性系变异的重要因素；重要因素；从分子水平上推测，可能是由从分子水平上推测，可能是由于遗传物质的分子结构发生了变化，引于遗传物质的分子结构发生了变化，引起了跳跃基因的出现，基因重排、基因起了跳跃基因的出现，基因重排、基因扩增或减少、扩增或减少、DNADNA排列顺序发生变化等。排列顺序发生变化等。七、试管苗的驯化与移栽七、试管苗的驯化与移栽1 1、试管苗生长的特点、试管苗生长的特点 1 1）试管苗的生态环境）试管苗的生态环境 组织培养中培育出来的苗通常称组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培养器皿中，与外界环境试管或三角瓶等培养器皿中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系统。这个隔离，形成了一个独特的生态系统。这个生态系统与外界环境条件相比具有以下生态系统与外界环境条件相比具有以下4 4大大差异，即高温、高湿、弱光和无菌。差异，即高温、高湿、弱光和无菌。（1 1）高温且恒温）高温且恒温在植物试管苗整个生长过程中，通在植物试管苗整个生长过程中，通常均采用恒温培养，即使某一阶段稍有变动，常均采用恒温培养，即使某一阶段稍有变动，温差也是极小的；并且在培养过程中，通常温温差也是极小的；并且在培养过程中，通常温度控制在度控制在25252 ，有的植物需将温度控制，有的植物需将温度控制得更高；而外界环境条件，温度处于不断变化得更高；而外界环境条件，温度处于不断变化之中，温度的调节完全是由自然界太阳辐射的之中，温度的调节完全是由自然界太阳辐射的日辐射量决定的，温差很大，而且一般不会达日辐射量决定的，温差很大，而且一般不会达到到25 2 。（2 2）高湿）高湿植物组织培养中试管或培养瓶内植物组织培养中试管或培养瓶内的水分移动有的水分移动有2 2条途径，一是试管苗吸收的水条途径，一是试管苗吸收的水分，从叶面气孔蒸腾；二是培养基向外蒸发，分，从叶面气孔蒸腾；二是培养基向外蒸发，而后水汽凝结又进入培养基。这种循环就是培而后水汽凝结又进入培养基。这种循环就是培养瓶内的水分循环，其循环的结果造成培养瓶养瓶内的水分循环，其循环的结果造成培养瓶内空气的相对湿度接近于内空气的相对湿度接近于100100，远远大于培，远远大于培养瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。养瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。可见培养瓶内的水分状态直接影响着试管苗的可见培养瓶内的水分状态直接影响着试管苗的生长和各种生理活性。生长和各种生理活性。（3 3）弱光）弱光组织培养中的光强与太阳光相比组织培养中的光强与太阳光相比一般很弱，故幼苗一般生长也较弱，经受一般很弱，故幼苗一般生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。不了太阳光的直接照射。（4 4 4 4）无菌）无菌）无菌）无菌试管苗所在环境的另一大特点是无菌。不试管苗所在环境的另一大特点是无菌。不试管苗所在环境的另一大特点是无菌。不试管苗所在环境的另一大特点是无菌。不仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中仅培养基无菌，而且试管苗也无菌。在移栽过程中试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注试管苗要经历由无菌向有菌的转换。这一点若不注意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试意，也会引起试管苗移栽过程中的死亡。另外，试管苗还处在一种特殊的气体环境中。以上这些特点管苗还处在一种特殊的气体环境中。以上这些特点管苗还处在一种特殊的气体环境中。以上这些特点管苗还处在一种特殊的气体环境中。以上这些特点都决定了试管苗移栽前持的环境条件与移栽后的外都决定了试管苗移栽前持的环境条件与移栽后的外都决定了试管苗移栽前持的环境条件与移栽后的外都决定了试管苗移栽前持的环境条件与移栽后的外界环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适界环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适界环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适界环境条件有极大的差异，只有有效地使试管苗适应这种差异，才能使之移栽成活，因而这就需要试应这种差异，才能使之移栽成活，因而这就需要试应这种差异，才能使之移栽成活，因而这就需要试应这种差异，才能使之移栽成活，因而这就需要试管苗有一定的驯化时期。管苗有一定的驯化时期。管苗有一定的驯化时期。管苗有一定的驯化时期。2 2、试管苗的特点、试管苗的特点 试管苗与常规苗相比具有如下试管苗与常规苗相比具有如下特点特点： 第第1 1，试管苗生长细弱，茎、叶表面角，试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达；质层不发达； 第第2 2，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿，试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用功能较差；体的光合作用功能较差； 第第3 3，试管苗的叶片气孔数目少，活性，试管苗的叶片气孔数目少，活性差；差； 第第4 4，试管苗根的吸收功能弱。，试管苗根的吸收功能弱。3 3、试管苗的驯化、试管苗的驯化 驯化的驯化的目的目的：在于提高试管苗对：在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高的能力，促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。试管苗的移栽成活率。驯化的驯化的原则原则：应从温度、湿度、：应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内，应和培养时的环境条件相似；始数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步适应的目的。从而达到逐步适应的目的。 驯化的驯化的驯化的驯化的方法方法方法方法：驯化一般在试管苗移栽前：驯化一般在试管苗移栽前：驯化一般在试管苗移栽前：驯化一般在试管苗移栽前进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即练苗，其具体进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即练苗，其具体进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即练苗，其具体进行，首先进行移栽前的驯化锻炼即练苗，其具体方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室方法是将长有完整试管苗的试管或三角瓶由培养室转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢转移到半遮荫的自然光下进行锻炼，在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度，并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相有菌，这样幼苗周围的环境就会逐步与自然环境相似。驯化一般进行似。驯化一般进行似。驯化一般进行似。驯化一般进行1 1 1 12 2 2 2周。周。周。周。4 4、试管苗的移栽、试管苗的移栽 试管苗的移栽往往和驯化同步。试管苗的移栽往往和驯化同步。移栽的方法有：常规移栽法、直接移栽法移栽的方法有：常规移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。和嫁接移栽法。 （1 1）常规移栽法）常规移栽法常规移栽法是指将试管苗在生长素常规移栽法是指将试管苗在生长素浓度高的培养基上诱导生根，当获得大量的不浓度高的培养基上诱导生根，当获得大量的不定根后，打开培养瓶注入少量自来水，在半遮定根后，打开培养瓶注入少量自来水，在半遮光下驯化光下驯化3d3d5d5d，然后取出洗去培养基，移栽，然后取出洗去培养基，移栽到无菌的混合土（如沙子：蛭石到无菌的混合土（如沙子：蛭石=1=1：1 1）中，）中，保持一定的温度和水分，当长出保持一定的温度和水分，当长出2 23 3片新叶时片新叶时就可将其移栽到田间或盆钵的方法。就可将其移栽到田间或盆钵的方法。（2 2）直接移栽法）直接移栽法直接移栽法是指直接将试管直接移栽法是指直接将试管苗移栽到盆钵的方法。苗移栽到盆钵的方法。 （3 3）嫁接移栽法）嫁接移栽法嫁接移栽法是指选取生长良好的嫁接移栽法是指选取生长良好的同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管同一植物的实生苗或幼苗作砧木，用试管苗作接穗进行嫁接的方法。苗作接穗进行嫁接的方法。据王连清等人对棉花的试管苗进据王连清等人对棉花的试管苗进行嫁接移栽的有关试验表明，试管苗的嫁行嫁接移栽的有关试验表明，试管苗的嫁接移栽法与常规移栽法相比具有许多优点，接移栽法与常规移栽法相比具有许多优点，其最主要的有以下几点：其最主要的有以下几点：表表4-14-1嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果试试管苗管苗管苗管苗种种种种类类 移栽方法移栽方法移栽方法移栽方法 移栽移栽移栽移栽 植株数植株数植株数植株数 成活成活成活成活 植株数植株数植株数植株数 成活率成活率成活率成活率（% % % %） 嫁接移栽法嫁接移栽法嫁接移栽法嫁接移栽法 35353535 33333333 94.2994.2994.2994.29 壮苗壮苗壮苗壮苗 常常常常规规移栽法移栽法移栽法移栽法 50505050 24242424 48.0048.0048.0048.00 直接移栽法直接移栽法直接移栽法直接移栽法 21212121 0 0 0 0 0.000.000.000.00 嫁接移栽法嫁接移栽法嫁接移栽法嫁接移栽法 30303030 21212121 70.0070.0070.0070.00 弱苗弱苗弱苗弱苗 常常常常规规移栽法移栽法移栽法移栽法 27272727 2 2 2 2 7.417.417.417.41 直接移栽法直接移栽法直接移栽法直接移栽法 15151515 0 0 0 0 0.000.000.000.00 5 5、影响试管苗移栽成活率的因素、影响试管苗移栽成活率的因素影响试管苗移栽成活率的因素有影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内因与外因。不同的植物和许多种，包括内因与外因。不同的植物和不同的试管苗种类对移栽的具体要求是不不同的试管苗种类对移栽的具体要求是不同的。同的。总的来说，提高试管苗移栽成活总的来说，提高试管苗移栽成活率的途径有以下几种。率的途径有以下几种。（1 1）试管苗的生理状况（选择壮苗）试管苗的生理状况（选择壮苗）试管苗的生理状况是影响移栽成试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。同一种植物的试管苗，活率的内在因素。同一种植物的试管苗，其壮苗比弱苗移栽后成活率高（如表其壮苗比弱苗移栽后成活率高（如表4-14-1）。）。（2 2）植物生长调节物质植物生长调节物质 一一般般来来说说生生长长素素因因为为能能促促进进生生根根，故故也也能能提提高高试试管管苗苗移移栽栽的的成成活活率率。但但是是，不不同同的植物有其适宜的生长素种类。的植物有其适宜的生长素种类。 如如在在月月季季的的试试验验中中发发现现，以以NAANAA诱诱导导生生根根和和提提高高移移栽栽成成活活率率效效果果最最好好；而而IAAIAA并并不不理理想想，当当IAAIAA的的浓浓度度超超过过1mg/L1mg/L时时，反反而而急急剧剧降降低移栽成活率。低移栽成活率。 细细胞胞分分裂裂素素一一般般会会抑抑制制根根的的生生长长，不利于移栽。不利于移栽。 如如在在月月季季的的试试验验中中表表明明，无无论论是是BABA或或2-ip2-ip对对生生根根和和移移栽栽都都有有抑抑制制效效应应，即即使使在在很低的浓度下也可发现。很低的浓度下也可发现。（3 3）无机盐浓度）无机盐浓度 试试验验结结果果表表明明，降降低低无无机机盐盐的的浓浓度对植物生根效果较好，有利于移栽成功。度对植物生根效果较好，有利于移栽成功。（4 4）活性炭）活性炭在生根培养基中加入少许活性炭，在生根培养基中加入少许活性炭，对某些月季的嫩茎生根有良好作用，尤其对某些月季的嫩茎生根有良好作用，尤其是采用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭，是采用酸、碱和有机溶剂洗过的活性炭，效果更佳。但活性炭对有些月季品种的促效果更佳。但活性炭对有些月季品种的促根生长无反应。根生长无反应。（5 5）环境因子）环境因子环境条件也影响试管苗移栽的效环境条件也影响试管苗移栽的效果，关键是控制好移栽前果，关键是控制好移栽前10d10d的光、温、湿。的光、温、湿。做好适当遮荫工作，避免太阳光直射，造做好适当遮荫工作，避免太阳光直射，造成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持成试管苗迅速失水而死亡。温度一般保持在在252530 为好。开始几天最好用烧杯为好。开始几天最好用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在85%以上。以上。（6 6）移栽过程中让试管苗从无菌向有菌逐渐）移栽过程中让试管苗从无菌向有菌逐渐过渡过渡试管苗出管后，要将其上面的培试管苗出管后，要将其上面的培养基洗净，以免杂菌滋长。对于移栽后成养基洗净，以免杂菌滋长。对于移栽后成活比较困难的植物，第一次移栽时最好选活比较困难的植物，第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。