基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的目的基因的获取取2.基因表达基因表达载体的构建体的构建3.将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞胞4.目的基因的目的基因的检测与与鉴定定知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻碍片断，它能阻碍RNARNA聚合酶的移动，聚合酶的移动，并使其从并使其从DNADNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(.(以模板转录然以模板转录然后脱落后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能编码蛋白，不能编码蛋白质。质。能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的基的基因结因结构构有调控遗传信息表达的核苷酸序列，有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区在该序列中，最重要的是位于编码区上游的上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNARNA聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定知识点二知识点二. .基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤一、获取目的基因1.获取目的基因的途径取目的基因的途径 A.A.从自然界已有的物种中分离从自然界已有的物种中分离 B.B.人工合成人工合成2.获取目的基因的方法取目的基因的方法 A.A.从基因文库中获取从基因文库中获取 B.B.利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 C.C.利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成目的基因主要是目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类: :按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。目的基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据： 见课本见课本P9提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库5.5.基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一（1 1）直接分离法）直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )CDNA合成过程 第一步，反第一步，反转录酶以以RNA为模板合成一条与模板合成一条与RNA互互补的的DNA单链，形成，形成RNA-DNA杂交分子。交分子。第二步，核酸第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的交分子中的RNA链降降解，使之解，使之变成成单链的的DNA。第三步，以第三步，以单链DNA为模板，在模板，在DNA聚合聚合酶的作用下的作用下合成另一条互合成另一条互补的的DNA链，形成双，形成双链DNA分子。分子。 5.5.基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA复制复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活剂激活剂) )条件：条件：条件：条件：缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物成引物前提：前提：前提：前提：利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前提前提:要有一段已知要有一段已知目的基因的脱目的基因的脱氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。 过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环预变性（预变性（增加增加DNADNA变性的概率变性的概率）2 2、具体过程、具体过程PCR(多聚酶链式反应)目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA (cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因) )反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法： 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使RNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链DNADNA，然后在酶的，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链DNADNA，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。表达和发挥作用。2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊位于基因的首端的一段特殊的的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结聚合酶识别和结合的部位，有了它才能合的部位，有了它才能驱动基因转录驱动基因转录出出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊位于基因的尾端的一段特殊的的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因的细胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体必需以表达载体的方式携带进去。的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞-植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力将目的基因导入受体细胞-动物细胞显微注射法显微注射法将目的基因导入受体细胞-微生物细胞nCa2+处理理 使使细胞胞处于一种能吸收周于一种能吸收周围环境中的境中的DNA-感受感受态细胞胞四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否插入目的基因（DNA分子分子杂交技交技术）是否是否转录（mRNA分子分子杂交技交技术）是否翻是否翻译（抗原抗原抗体抗体杂交技交技术）鉴定定:功能活性功能活性鉴定定抗性抗性鉴定定分别提取什么进行检测归纳步骤DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因取目的基因u从基因文从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达构建基因表达载体体u目的基因、启目的基因、启动子、子、终止子、止子、标记基因基因3.3.将目的基因将目的基因导入受体入受体细胞胞u农杆菌杆菌转化法、化法、显微注射法微注射法4.4.目的基因的目的基因的检测与与鉴定定u检测：是否插入、：是否插入、转录、翻、翻译基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤