流式细胞技术与流式细胞仪流式细胞技术与流式细胞仪flow cytometry &Flow Cytometer(FCM) 主要内容主要内容p基本原理基本原理p基本结构基本结构p主要性能指标主要性能指标p临床应用临床应用流式细胞仪的发展简史流式细胞仪的发展简史p19341934年年MoldavanMoldavan 使悬浮的血红细胞从一个使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。仪的最初模型。p19471947年，年，GuckerGucker首次采用鞘流原理对气体首次采用鞘流原理对气体中的微粒进行计数。中的微粒进行计数。p19531953年，年，Crosland-TaylorCrosland-Taylor利用同一原理，利用同一原理，成功的设计了一种鞘流系统，配合光电技成功的设计了一种鞘流系统，配合光电技术对红细胞进行计数。术对红细胞进行计数。p19691969年年Van DillaVan Dilla 和和Los AlamosLos Alamos采用了采用了Crosland-TaylorCrosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。式细胞测量仪的基础。p19721972年年，数位研究者在斯坦佛大学研制了一台，数位研究者在斯坦佛大学研制了一台荧光激活细胞分选仪，它标志着流式细胞仪商荧光激活细胞分选仪，它标志着流式细胞仪商品化时代的真正到来。品化时代的真正到来。19741974年，年，BDBD公司正式投公司正式投产，商品名产，商品名FACS-1FACS-1TMTM. .p目前的主流生产商，目前的主流生产商，美国的美国的BDBD公司、公司、CoulterCoulter公司。公司。一、流式细胞仪的基本原理一、流式细胞仪的基本原理（一）流式细胞仪的分析原理（一）流式细胞仪的分析原理单细胞液柱单细胞液柱已标记的单细已标记的单细胞悬液和鞘液胞悬液和鞘液硅化管硅化管流动室流动室喷嘴喷嘴荧光检测系统和荧光检测系统和散射光感受系统散射光感受系统收集光信号收集光信号荧光染料被荧光染料被激发发光激发发光光电倍增管光电倍增管脉冲信号脉冲信号计算机系统计算机系统分析结果分析结果放大放大垂直相交垂直相交形成稳态形成稳态水平激光与之水平激光与之细胞组成细胞组成细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能细胞功能细胞功能大小大小大小大小细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆胞浆胞浆/ /核核核核- -特异性抗原特异性抗原特异性抗原特异性抗原粒度粒度粒度粒度细胞活性细胞活性细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子钙离子钙离子, PH, PH值值值值, , 膜电位膜电位膜电位膜电位酶活性酶活性酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流） 通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。（二）流式细胞仪的分选原理（二）流式细胞仪的分选原理细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电分选基本原理分选基本原理二、流式细胞仪的基本结构二、流式细胞仪的基本结构p流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统p激发光源及光束成形系统激发光源及光束成形系统p光学系统光学系统p信号检测和存储系统信号检测和存储系统p显示分析系统显示分析系统p细胞分选系统细胞分选系统（一）流动室（一）流动室p是是FCM的核心部件，由的核心部件，由石英玻璃制成，并在石石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径英玻璃中央开一个孔径为为 的长方形孔，供单个细的长方形孔，供单个细胞通过，检测区在该孔胞通过，检测区在该孔的中心或下方。的中心或下方。p流动室内充满了鞘流，流动室内充满了鞘流，其作用是将样品流环包。其作用是将样品流环包。鞘流原理鞘流原理p细胞悬液流过检测光束，约细胞悬液流过检测光束，约30%的细胞在的细胞在流动中明显偏离轴心，有向流速较慢的区流动中明显偏离轴心，有向流速较慢的区域聚焦的趋势。域聚焦的趋势。p阻塞管路阻塞管路p聚焦的细胞直接影响测量结果聚焦的细胞直接影响测量结果p由于细胞偏离轴心造成其移动时间延长，降低由于细胞偏离轴心造成其移动时间延长，降低检测速度。检测速度。p激光束无法对准照射在细胞中心激光束无法对准照射在细胞中心鞘流原理鞘流原理p流动的液体可分为流动的液体可分为稳流稳流(层流层流)和和湍流湍流两种状态两种状态p层流原理层流原理：液体流动状态有一个分界点，即雷诺数：液体流动状态有一个分界点，即雷诺数p 其定义为：在一个直径为其定义为：在一个直径为 的管子内，液体的流速的管子内，液体的流速为为v，密度为，密度为 ，黏滞系数为，黏滞系数为 ，p当当 时，液流处于层流状态；当时，液流处于层流状态；当 时，液流处于湍流状态。时，液流处于湍流状态。p流式细胞仪中要求标本处于层流状态。常把流速限流式细胞仪中要求标本处于层流状态。常把流速限制在制在10m/s10m/s以下。以下。鞘流原理鞘流原理p由此发展的鞘流技术，实现两种液体的同轴流动，由此发展的鞘流技术，实现两种液体的同轴流动，标本位于轴心稳定流动，外面包被有鞘液。标本位于轴心稳定流动，外面包被有鞘液。p鞘流处于湍流状态，围绕标本喷嘴高速流动，这鞘流处于湍流状态，围绕标本喷嘴高速流动，这样就使得标本流与鞘流形成稳定的同轴流动状态。样就使得标本流与鞘流形成稳定的同轴流动状态。p由于标本喷嘴处于流动室的中心，就使得标本流由于标本喷嘴处于流动室的中心，就使得标本流在鞘流包被下，恒定处于同轴流动的中心位置，在鞘流包被下，恒定处于同轴流动的中心位置，其精度可以稳定在几个微米之内。其精度可以稳定在几个微米之内。p标本流的位置的稳定可通过调整它与鞘液流速的标本流的位置的稳定可通过调整它与鞘液流速的比例来实现，一般比例在比例来实现，一般比例在1:501:50到到1 1：几百之间：几百之间。鞘流原理鞘流原理pBernoulli定律：当液体流经截面不同的管道时，定律：当液体流经截面不同的管道时，有有 ，S和和v分别是两个管道分别是两个管道的截面积和液体的流速。的截面积和液体的流速。鞘液流鞘液流动动方向方向Lower pressureThe Bernoulli EffectVelocity Gradient液流驱动系统液流驱动系统（二）激光光源（二）激光光源p流式细胞仪的激发光源通常采用激光，通常流式细胞仪的激发光源通常采用激光，通常用的激光包括用的激光包括氩离子激光氩离子激光（488nm）、He-Ne激光激光（633nm）和和半导体激光半导体激光（635nm)。p由于细胞快速流动，通过光照区的时间只有由于细胞快速流动，通过光照区的时间只有1微秒左右，且细胞所携带荧光物质被激发出微秒左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激光光的荧光信号强弱，与被照射的时间和激光光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。强度。(二二)激光光源激光光源p激光光源的宽度大于被测细胞，为零分辨激光光源的宽度大于被测细胞，为零分辨率信号。率信号。p狭缝扫描技术：狭缝扫描技术：（三）光学系统（三）光学系统p主要元件为滤光片，分长通滤光片、短通主要元件为滤光片，分长通滤光片、短通滤光片、带通滤光片。滤光片、带通滤光片。长波通双色长波通双色性反射镜：性反射镜：大于特定波大于特定波长的光通过长的光通过而将小于特定而将小于特定波长的光反射波长的光反射光学系统示意图光学系统示意图 细胞通过激光照射区时细胞通过激光照射区时 ，受激光激发，产生代表，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间胞为中心，向空间360360度立体角发射，产生散色光和荧度立体角发射，产生散色光和荧光信号。光信号。（四）信号检测系统（四）信号检测系统（四）信号检测系统（四）信号检测系统p散射光检测散射光检测p 前向光散射前向光散射（FSC, Forward Scatter ）p侧向光散射侧向光散射（SSC, Side Scatter ）p散射光不依赖任何细胞样品的制备技术散射光不依赖任何细胞样品的制备技术( (如染色如染色) )，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。光的波长相同。p荧光检测荧光检测(Fluoresence detector)p（1 1）前向散射光）前向散射光：激光束照射细胞时，光以激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度相对轴较小角度(0.5(0.510)10)向前方散射的信号向前方散射的信号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。细胞体积大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图p（2 2）侧向散射光：）侧向散射光：激光束照射细胞时，光以激光束照射细胞时，光以9090角散射的信号，侧向散射光对细胞膜、角散射的信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光示意图侧向散射光示意图 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。 此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 （3）荧光检测）荧光检测p荧光信号由被检细胞上标记的荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料特异性荧光染料受受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。p每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。p选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。的多个不同特征。p线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL1FL2FL2FL3FL3FL4FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类几种常见的荧光染料几种常见的荧光染料（1）荧光信号的面积和宽度）荧光信号的面积和宽度 p所谓荧光信号的面积是所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通采用对荧光光通量进行积分测量，一般对量进行积分测量，一般对DNA含量测量含量测量时，均采用面积时，均采用面积(FL2A)来计算。这是来计算。这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映更能准确反映DNA的含量。的含量。 p荧光信号的宽度荧光信号的宽度(如如FL2W)常用来区分常用来区分双联体细胞双联体细胞 （2）荧光补偿原理）荧光补偿原理双激光立体光路技术双激光立体光路技术参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散、双参数散点图点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维等高图、假三维等高图 、三、三参数散点图参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 （五）数据的显示与分析（五）数据的显示与分析FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、 参数参数p单参数直方图p双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图p三参数直方图p多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析: :REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式p GateGate设置：指在某一张选定参数的直方图上，设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。合的直方图只体现这群细胞的分布情况。p根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。多边形门、任意形状门和十字门。 设门分析技术设门分析技术 由一维参数由一维参数( (散射光或荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图单参数直方图单参数直方图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel )(channel )p双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。p双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度双参数直方图点图双参数直方图点图2. 二维等高图二维等高图p由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。p等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。p曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。p等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图二维等高图3. 假三维等高图假三维等高图（三）三参数直方图（三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析（六）细胞分选器（六）细胞分选器p细胞分选器由细胞分选器由水滴形成水滴形成、分选逻辑电路分选逻辑电路、水滴充电水滴充电和偏转电路和偏转电路组成。组成。p1.小水滴的形成小水滴的形成：液流从喷孔出来后，需要经过一：液流从喷孔出来后，需要经过一段距离才形成水滴。这段距离大概是段距离才形成水滴。这段距离大概是1020个波长个波长p喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。p2.逻辑电路：逻辑电路：为了分选细胞，需要细胞在经过测量为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时，区时，FCM判断出哪个细胞满足分选条件，并产生判断出哪个细胞满足分选条件，并产生一个逻辑信号；一个逻辑信号；p此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲，当满足分选条件的细胞形成水滴时，充电脉冲正好当满足分选条件的细胞形成水滴时，充电脉冲正好对它进行充电。对它进行充电。p3.水滴的充电与偏转水滴的充电与偏转：当水滴从流束上将要：当水滴从流束上将要断开时，给含有这个水滴的流束充电，则断开时，给含有这个水滴的流束充电，则水滴从流束上断开后变带有同极性的多余水滴从流束上断开后变带有同极性的多余表面电荷。表面电荷。p下落的液滴通过一个由平行板电极形成的下落的液滴通过一个由平行板电极形成的静电场，水滴在电场中发生偏转，偏转电静电场，水滴在电场中发生偏转，偏转电压一般为压一般为20006000v，对于高速分选偏转，对于高速分选偏转电压可达电压可达8000v。p分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。液中细胞的含量成正比。p分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。p分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。p分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。分选的技术要求分选的技术要求三、主要性能指标三、主要性能指标p灵敏度灵敏度：衡量仪器检测微弱荧光信号的重：衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，以能检测到的单个微球上最少标要指标，以能检测到的单个微球上最少标有有FITC或或PE荧光分子的数目表示。目前荧光分子的数目表示。目前FCM100.p分辨率：用变异系数来表示，一般分辨率：用变异系数来表示，一般FCM在在最佳状态时，最佳状态时，CV值值2%.p前向散射光检测灵敏度：可检测直径为的前向散射光检测灵敏度：可检测直径为的生物颗粒。生物颗粒。p分析速度：分析速度：30006000个个/秒秒 CV值约小，曲线分布约窄约集中，测量误差就约值约小，曲线分布约窄约集中，测量误差就约一般的一般的FCM在最佳状态时在最佳状态时CV值小于值小于2。FACSCalibur四、流式细胞仪应用的技术要求四、流式细胞仪应用的技术要求p制备单细胞悬液是进行流式细胞分析的第制备单细胞悬液是进行流式细胞分析的第一步一步p荧光染料的选择和标记细胞的方法是保证荧光染料的选择和标记细胞的方法是保证荧光信号产生的关键技术荧光信号产生的关键技术p操作技术的质量控制操作技术的质量控制p确保激光光路与样品流处于正交状态确保激光光路与样品流处于正交状态pPMT校准校准p绝对计数校准绝对计数校准五、临床应用五、临床应用p在免疫学中的应用在免疫学中的应用：被称为免疫学的基石，对：被称为免疫学的基石，对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。的手段和帮助。 p在血液学中的应用在血液学中的应用：血液细胞的分类、分型，：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广泛。用广泛。 p在艾滋病检测中的应用在艾滋病检测中的应用：流式细胞术用于：流式细胞术用于AIDS免疫功能的检测是最重要的检测手段。免疫功能的检测是最重要的检测手段。p在肿瘤学中的应用在肿瘤学中的应用p在药物学方面的应用在药物学方面的应用