肠道病毒感染病例标本的处理、细胞接种和观察湖南CDC脊灰实验室 张帆2008.5.8人肠道病毒简介和分类小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。小球形病毒（ 30 nm）， 20面体对称结构。衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4与内部RNA结合。与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。电镜下的病毒形态病毒特性肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感，75%酒精和5%来苏亦不能将其灭活，但对紫外线及干燥敏感。各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能灭活病毒。病毒在50 可被迅速灭活，但1mol浓度二价阳离子环境可提高病毒对热灭活的抵抗力，病毒在4 可存活1年，在- 20 可长期保存，在外环境中病毒可长期存活。人肠道病毒传播方式 粪-口途径传播: 唾液与粪便 呼吸道传播: 空气飞沫 接触传播:一般人肠道病毒在呼吸道飞沫中可存留约一至三周，而经胃肠道的粪便排泄可达到二至三个月以上。病毒的组织培养所有已知的人肠道病毒都可以在组织细胞培养或乳鼠中繁殖；大部分血清型可以在1种以上的人源传代细胞中生长；但是没有哪一种细胞可以支持所有的人肠道病毒生长；研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒）只能在乳鼠中繁殖。实验室检测方法临床怀疑：夏秋季，婴幼儿、皮疹、接触、脑膜炎实验室的检测方法包括：1)血清抗体的变化： 血清抗体4倍变化2)病毒培养及鉴定：理想（金标准）但费时费力，且部分肠病毒型别不易培养3)组织病理切片检查4)分子生物学检测，RT-PCR，RealTime PCR，分子杂交等5)快速抗原检测：芯片 病毒分离诊断肠道病毒感染的最主要手段，也是金标准。柯萨奇B组病毒和埃可病毒可以很容易地在细胞培养上生长。适合的标本有咽拭子、粪便标本，鼻拭子等，也可以从脑脊液中分离到病毒。一些柯萨奇A组病毒不容易通过细胞培养进行分离，可以通过乳鼠进行分离，但是操作比较复杂，一般实验室不常规使用这种方法。分子生物学的方法更适合这种病毒的诊断。 血清学方法自从细胞培养已经可以用做病毒分离后，血清学方法已经不经常使用了。中和实验，但是非常繁琐，因此，一般也不做这方面的实验。细胞培养分离方法1990年以前，大都都采用Vero、GMK细胞分离；1994年以后，人结肠癌上皮细胞（Caco-2）取代了Vero细胞；1998年人们开始用人肺系细胞（MRC-5）分离CoxA16等毒株，其敏感性与Caco-2细胞相当。目前，大都使用人源细胞如人喉癌上皮细胞（HEp-2）、人横纹肌肉瘤细胞（RD）用于病毒分离。RD细胞支持大多数柯萨奇A组病毒复制。对一些不能在细胞上生长的病毒，可用乳鼠接种分离病毒。但埃可病毒一般不引起乳鼠发病。标本的采集（一）粪便标本：采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（二）咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（三）血清标本：采集急性期（发病03d）和恢复期（发病1430d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（六）病例密切接触者的标本采集：选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。（七）健康对照的标本采集：选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。手足口病引起手足口病的主要为小RNA病毒科、肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、7、9、10 型， B组2、5型；埃可病毒（ECHO viruses）和肠道病毒71型（EV 71），其中以EV 71及Cox Al6型最为常见。 感染后引起 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡传染性极高病程约1周手足口病发病机理致病性与柯萨奇病毒类似，呈多样性，主要是无菌性脑炎、类脊髓灰质炎等中枢神经系统疾病感染后对同型病毒可产生持久免疫诊断困难，对可疑患者可采粪便、脑脊液等标本做病毒分离和中和试验尚无疫苗，预防以隔离为主用于病毒分离和鉴定标本的种类用于HFMD病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。用于AHC病毒分离的标本主要是结膜拭子或结膜刮取物。用于HFMD病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。用于AHC病毒分离的标本主要是结膜拭子或结膜刮取物。注意：虽然都是肠道病毒，但不同的病例采样的部位不同，不同的肠道病毒采用的组织培养也是不同的。标本的处理1、粪便标本的处理A）所需试剂和耗材：15ml或50ml耐氯仿离心管；1ml 或5ml吸氯仿用的玻璃吸管；5ml和10ml吸管；木制便签；外螺旋盖的冻存管（5ml）；直径大约23mm的玻璃珠；混有抗生素的完全PBS；完全PBS液中加入PS溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500g/ ml 氯仿（以乙醇作为稳定剂）。B)粪便标本处理操作步骤：生物安全柜中操作将离心管上标记标本号;每一管中加入10ml 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿;在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号一致），剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于-20。拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20分钟。将离心管上标记标本号;用冷冻离心机离心1500g*（约3500转）20分钟。将每一份标本上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理一次）。将一管粪便悬液冻存于-20作为备份，另一管存于4-8以备接种（用于当天接种细胞）。2、脑脊液标本的处理-通常直接用于病毒分离。3、疱疹液标本的处理-通常直接用于病毒分离。4、咽拭子标本的处理咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后4条件下10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，用滤器过滤除菌。5、眼结膜拭子标本的处理同咽拭子标本的处理。病毒分离标本接种和观察A）所需试剂和耗材：细胞培养管培养的RD细胞和HEp-2细胞；维持液（MM）；1ml和5ml的一次性塑料移液管B）操作步骤：显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成； 倒掉（GM），换上11.2ml（MM）；每一份标本同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）；每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；每支试管接种0.2ml标本悬液，培养温度要求36（对于AHC标本病毒分离，尤其是EV70，强烈建议降低培养温度，一般可为35）；使用倒置显微镜逐日观察并如实记录细胞培养管的变化，至少一周。包括记录：CPE（1+4+）： （1+，25%; 2+, 25%50%; 3+,50%75%; 4+, 75%100%）；细胞毒性反应;细胞老化或污染.关于肠道病毒CPE：即有特征性的肠道病毒致细胞病变效应，表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加， 折光性增强至细胞从管壁脱落。如果有特征性的肠道病毒CPE出现至观察到75%的细胞发生变化（3+ CPE），冻存于-20以备二次传代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定；第1代培养见可疑CPE至观察满7天后再继续冻融传代，待CPE稳定出现后-20或-70冻存以备进一步鉴定；如果7天之后没有CPE出现，需盲传2代继续观察。（注意：同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传代）；盲传2代后仍不出现CPE，则判定为阴性；注意：盲传不可超过3代。相关概念A：毒性反应：如果在接种后12d内细胞快速地凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。将这些已接种标本的试管冻存于-20，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，可重取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。可将已接种标本试管于-20冻存，融化后取0.2ml再接种到同一类型健康单层细胞，再观察7天。若盲传2代仍未产生CPE，即可确认此标本为阴性。HFMD结果解释1.RD细胞支持CA16和EV71的复制，但一般要经过2次以上传代才出现明显病变，若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒(如COXB及ECHO）分离率。2.从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。需满足以下2 个要求。才有诊断的参考价值：1）从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒;2）病毒分离率远高于正常人群。3.相同滴度的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CA16早。两者在HEp-2细胞中均不繁殖。需要注意的两个问题A额外的传代：在进行HFMD/AHC标本病毒分离过程中，为防止从病例中分离出的标本中有人肠道病毒漏检情况，此时接种过病毒的细胞悬液经过冻化后，可重新接种到新的健康单层细胞上以释放存在的病毒。在标本培养没有产生CPE的情况下，特别是发生毒性反应或污染时，使用新的健康细胞可能会产生可识别CPE。但病毒传代不要超过3次，因为每一次操作都会增加病毒交叉污染的机会，从而产生假阳性结果。B标本吸附到单层细胞上方法：先将细胞生长液倒掉，用无菌PBS清洗单层健康细胞，再接种0.2ml标本悬液使其先吸附到单层细胞上。吸附过程(1h)中轻摇并偶尔旋转使接种液分布均匀，以防止周围层细胞干燥。然后再加入1ml的维持液。优点：可检测到稍低浓度的病毒/ 减少标本的毒性反应/可使CPE提前出现。缺点：增加病毒（和可能的细菌）交叉污染的机会，因为此方法增加了开盖/关盖的次数。注意：当使用含有很高滴度病毒标本时交叉污染的可能性更大，所以此方法不可用于接种病毒分离物。正常的RD细胞(人胚胎横纹肌肉瘤细胞，形态学为纺锤形及巨型多核细胞）EV71T和CA16出现的CPE（接种后第7天）正常的Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞，形态学为上皮样细胞）CA24和EV70出现的CPE（接种后第7天）