Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的分离纯化酶的分离纯化制作：郑穗平Contents of chapter 31、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法GoGoGoGo5、酶的组合分离纯化策略Go6、酶的浓缩、干燥与结晶Go细胞结构与酶分布3.1 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶酶的纯化过程，约可分为的纯化过程，约可分为三三个阶段个阶段：(1) (1) 粗粗蛋白质蛋白质 (crude (crude protein): protein): 采样采样 均均质质打破细胞打破细胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐盐析析沉淀沉淀法法；可以；可以粗略去除蛋白质以外的物粗略去除蛋白质以外的物质。质。(2) (2) 部分纯化部分纯化 (partially (partially purified): purified): 初步的纯化，初步的纯化，使用各钟使用各钟 柱柱层层析法析法。(3) (3) 均均质酶质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶目标酶的的进进一步精制纯化，可用一步精制纯化，可用制制备备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化不同阶段本章目录3.2 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理本章目录l酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 3.3 酶的提取酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶酶的主要提取方法的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 本章目录3.4 酶的分离方法酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go本章目录1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度溶解度降低降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等等电点沉淀法点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶有机溶剂沉淀法沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。 在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为KsKs分段盐析分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析分段盐析。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 本节目录2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机高速离心机的最大转速为（1）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装有些高速离心机装设有冷冻装置设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达 12)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心机按照其用途可以分为制备制备用超速离心机用超速离心机、分析用超速离心机分析用超速离心机和分析分析- -制备两用超速离心机制备两用超速离心机3种 蛋白质蛋白质分子在分子在离心离心時，時，其其 分子量、分子密度、分子量、分子密度、组成组成、形形状状 等，均等，均会影会影响响其沉降速率，其沉降速率，沉降係沉降係系数系数 即用來描述此沉降即用來描述此沉降性质性质； 其其单位为单位为 S (Svedberg unit)。每一每一种种的沉降的沉降系数与系数与其其分子密度或分子量成正分子密度或分子量成正比。比。 不同沉降不同沉降系数系数的的蛋蛋白质白质，可利用超高速，可利用超高速离离心心法，在密度梯度中作法，在密度梯度中作分離。分離。本节目录3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分的分类及其特性及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透20 (40,000) 压力差，100kPa 筛分 超滤UF 120 (10,000-40,000) 压力差，100kPa 筛分 纳滤NF 1 (1001000) 压力差，100) 压力差，1000kPa 优先吸附、溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用膜分离四种常用膜分离过程的截留特性程的截留特性本节目录4 4、层析分离、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的( (称为固定相称为固定相) )，另一个相则流过此固定相另一个相则流过此固定相( (称为流动相称为流动相) )并使各组分以不同速并使各组分以不同速度移动，从而达到分离度移动，从而达到分离。层析分离方法析分离方法 层析方法分离依据吸附吸附层析析利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混合物中各组分分离分配分配层析析利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各组分分离离子交离子交换层析析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力和力不同而达到分离目的凝胶凝胶层析析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相相对分子分子质量量不同而达到物质分离亲和和层析析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的一而又可逆的亲和力和力，使生物分子分离纯化层析聚焦析聚焦将酶等两性物质的等等电点特性点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法 分配层析分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析纸上层析分配薄层层析分配薄层层析分配气相层析分配气相层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分各种离子的亲和力不同而达到分离离目的的一种层析分离方法。离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂阳离子交换剂和阴阴离子交换剂离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 凝胶层析又称为凝胶过滤凝胶过滤，分子排阻层分子排阻层析析，分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小小分子物质向下移动的速度比大分子的速分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的析柱，而达到分离的目的。常用的凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物酶与底物,酶与竞争性抑制剂酶与竞争性抑制剂,酶与辅酶与辅助因子助因子,抗原与抗体抗原与抗体，酶酶RNARNA与互补的与互补的RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA与互补的与互补的DNADNA分子分子或片段或片段等之间等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析的四个要素亲和层析的四个要素常用的亲和介质及专一性配体根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析共价亲和层析疏水层析疏水层析金属离子亲和层析金属离子亲和层析免疫亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析 疏水层析与反相层析的基本原理疏水层析与反相层析的基本原理本节目录5 5、电泳分离、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。动的过程称为电泳。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳纸电泳 薄层电泳薄层电泳 薄膜电泳薄膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳 自由电泳自由电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身本身所带的净电荷量所带的净电荷量，同时受颗粒形状颗粒形状和颗粒大颗粒大小小的影响。此外，还受到电场强度电场强度、溶液溶液pH值值、离子强度离子强度及支持体的特性支持体的特性等外界条件的影响。 制备式电泳通常以不含制备式电泳通常以不含 SDS SDS 的原态的原态 disc-PAGEdisc-PAGE 进行，以便回收进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。本节目录6 6、萃取分离、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取有机溶剂萃取双水相萃取双水相萃取超临界萃取超临界萃取反胶束萃取反胶束萃取 各种双水相系各种双水相系统聚合物P 聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠某些超某些超临界流体的超界流体的超临界点和超界点和超临界密度界密度流体名称临界温度()临界压力(Mpa)临界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑气N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578本节目录3.5 酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略Resolution（分辨率）（分辨率）Speed（速度）（速度）Capacity（容量）（容量）Recovery（回收率）（回收率）设计分离纯化工艺的基本要求设计分离纯化工艺的基本要求本章目录3.6 3.6 酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60以下进行浓缩。在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥真空干燥冷冻干燥冷冻干燥喷雾干燥喷雾干燥气流干燥气流干燥吸附干燥吸附干燥结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶盐析结晶有机溶剂结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶透析平衡结晶 等电点结晶等电点结晶 本章目录