第17章 色谱分析法概论17.1.1.17.1.1.色色谱谱法的来源和开展法的来源和开展混合物最有效的分混合物最有效的分别别、分析方法。、分析方法。俄国植物学家茨俄国植物学家茨维维特在特在19061906年运用的安装：年运用的安装：色色谱谱原型安装，如原型安装，如图图。色色谱法是一种分法是一种分别技技术色色谱法法层析法不析法不仅用于有色物用于有色物质分分别，且大量用于无色物且大量用于无色物质分分别。管内填充物，称管内填充物，称为固定相。固定相。另一相是携另一相是携带试样混合物流混合物流过此固定相的流此固定相的流体气体或液体，称体气体或液体，称为流流动相。相。17.1 概述概述3030年代年代 出出现现薄薄层层色色谱谱法法4040年代年代 纸纸色色谱谱法法 ( (塔板塔板实际实际) )5050年代年代 气相色气相色谱谱法法兴兴起，奠定了起，奠定了现现代色代色谱谱法的根法的根底，可底，可“在在线线分析。分析。 速率速率实际实际 6060年代气相色年代气相色谱谱- -质谱联质谱联用技用技术术7070年代高效液相色年代高效液相色谱谱法法(HPLC)(HPLC)的崛起的崛起, ,把色把色谱谱法又法又推推进进到一个新里程碑。到一个新里程碑。8080年代年代 液相色液相色谱联谱联用技用技术术、超、超临临界流体色界流体色谱谱9090年代年代 毛毛细细管管电电泳法泳法开展历程开展历程 (1)按两相分子的聚集形状分：按两相分子的聚集形状分：流流流流动动相相相相 固定相固定相固定相固定相 类类型型型型液相色液相色液相色液相色谱谱液体液体液体液体 固体固体固体固体 液液液液- -固色固色固色固色谱谱液体液体液体液体 液体液体液体液体 液液液液- -液色液色液色液色谱谱气体气体气体气体 固体固体固体固体 气气气气- -固色固色固色固色谱谱气体气体气体气体 液体液体液体液体 气气气气- -液色液色液色液色谱谱气相色气相色气相色气相色谱谱17.1.2.17.1.2.色谱法的分类色谱法的分类(2)按操作方式分按操作方式分类类：3按分按分别别机制分：机制分：平板色平板色平板色平板色谱谱 纸纸色色谱谱 薄薄层层色色谱谱 高分子薄膜色高分子薄膜色谱谱柱色柱色柱色柱色谱谱 填充柱色填充柱色谱谱 毛毛细细管柱色管柱色谱谱 分配色分配色谱谱：利用分配系数的不同：利用分配系数的不同 吸附色吸附色谱谱：利用物理吸附性能的差：利用物理吸附性能的差别别 离子交离子交换换色色谱谱：利用离子交：利用离子交换换原理原理 空空间间排阻色排阻色谱谱：利用排阻作用力的不同：利用排阻作用力的不同色色谱法法气相色气相色谱法法(GC)Gas Chromatography液相色液相色谱法法(LC)Liquid Chromatography超超临界流体色界流体色谱法法SFC柱色柱色谱法法气固色气固色谱气液色气液色谱平板色平板色谱法法柱色柱色谱法法毛毛细管管电泳法泳法纸色色谱法法薄薄层色色谱离子交离子交换液固液固液液液液空空间排阻排阻17.2 色谱过程与术语色谱过程与术语 当流当流动动相中携相中携带带的混合物流的混合物流经经固定相固定相时时，其与固定相，其与固定相发发生相互作用。生相互作用。随着流随着流动动相的挪相的挪动动，混合物在两相，混合物在两相间经过间经过反复多次的分配平衡，使得各反复多次的分配平衡，使得各组组分被固定相保管的分被固定相保管的时间时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。不同，从而按一定次序由固定相中流出。动画画两相及两相的相两相及两相的相对运运动构成了色构成了色谱法的根底法的根底17.2.1 17.2.1 色色谱过谱过程程 经经色色谱谱柱分柱分别别后的后的样样品品组组份份经过检测经过检测器器时时，所，所产产生的生的电电信信号号强强度度对时间对时间作作图图，所，所绘绘得曲得曲线线称称为为色色谱图谱图或流出曲或流出曲线线17.2.2 17.2.2 根本术语根本术语(P436)(P436)1. 1. 色色谱谱(1) (1) 基线基线基基线是在操作条件下，没有是在操作条件下，没有组份流出份流出时的流出曲的流出曲线基基线反映反映仪器的噪音随器的噪音随时间的的变化化稳定的理想基定的理想基线应该是一条程度直是一条程度直线基基线漂移漂移: :基基线在一段在一段时间内朝某一个方向内朝某一个方向变化化. .(2) (2) 峰高或峰面峰高或峰面积积 色色谱谱峰峰顶顶点与基点与基线线之之间间的垂直的垂直间间隔，以隔，以h表示，表示， 用来衡量色谱峰宽度的重要参数，有三种表示方法：1规范差 ()：正态分布曲线上两拐点间间隔的一半。反映组分分散程度。2峰底宽 (W)：W=4 3半峰宽 (W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2 =2.355 或W=1.699 W1/2(3) (3) 峰峰宽宽v保管保管时间和和调整保管整保管时间是色是色谱法的根本定性参数法的根本定性参数(1) 保管保管时间时间 tR ：试试样样从从进样进样开开场场到某个到某个组组份色份色谱谱峰峰顶顶点的点的时时间间间间隔，称隔，称为为保管保管时时间间；(3)调调整保管整保管时间时间 tR ：tR= tRt0 (2)死死时间时间 t0 ：不与：不与固定相作用的物固定相作用的物质质 如如空气空气 的保管的保管时间时间；2. 2. 保管保管值值 (4) 保管体保管体积积 VR ： VR = tRFcFc为为流流动动相流速，相流速，单单位：位：m L / min。 (5) 死体死体积积 V0 ： V0 = t0 Fc (6) 调调整保管体整保管体积积(VR)： V R = VR V0 VR 也是常用的色也是常用的色谱谱定性参定性参数之一数之一 又称Kovats指数，是一种重现性较好的定性参数。测定方法： 将正构烷烃作为规范，规定其保管指数为分子中碳原子个数乘以100如正己烷的保管指数为600。 其它物质的保管指数IX是经过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保管时间应在相邻两个正构烷烃的调整保管值之间如下图：(7)(7)保管指数保管指数 (I) (I)保管指数保管指数计算方法算方法例例 在在Apiezol L柱柱上上，柱柱温温100，用用正正庚庚烷及及正正辛辛烷为参参考考物物质对，测得得t0=30.0s，正正庚庚烷的的tR=204.0s，乙乙酸酸正正丁丁酯的的tR=340.0s及正辛及正辛烷的的tR=403.4s。阐明乙酸正丁明乙酸正丁酯在在Apiezol LApiezol L柱上的保管行柱上的保管行为相相当于当于7.7567.756个碳原子的正构个碳原子的正构烷烃的保管行的保管行为。Ix=100=775.63.3.分配系数与容量因子分配系数与容量因子(P439)(P439)(1)(1)分配系数分配系数 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度和压力下，组分在两相间分配到达平衡时的浓度单位：g / mL比，称为分配系数，用K 表示，即：分配系数是色分配系数是色谱分分别的根据。的根据。分配系数分配系数 K 的的讨论 一定温度下，一定温度下，组组分的分配系数分的分配系数K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；试样试样一定一定时时，K主要取决于固定相性主要取决于固定相性质质；某某组组分的分的K = 0时时，即不被固定相保管，最先流出。，即不被固定相保管，最先流出。K K有不同的概念：吸附色有不同的概念：吸附色谱谱法法为为吸附系数，离子交吸附系数，离子交换换色色谱谱法法为选择为选择性系数性系数 或称交或称交换换系数系数 ，凝胶色，凝胶色谱谱法法为为滲透参数滲透参数 容量因子是指，在一定温度下，容量因子是指，在一定温度下，组分在两相分在两相间分配到达平分配到达平衡衡时的的质量比：量比：I.分分配配系系数数与与容容量量因因子子都都是是与与组分分及及固固定定相相的的热力力学学性性质有关的常数，随分有关的常数，随分别柱温度、柱柱温度、柱压的改的改动而而变化。化。II.分分配配系系数数与与容容量量因因子子都都是是衡衡量量色色谱柱柱对组分分保保管管才才干干的参数，数的参数，数值越大，越大，该组分的保管分的保管时间越越长。III.容量因子可以由容量因子可以由实验测得。得。容量因子也称：容量因子也称： 分配比；分配比；质量分配系数；量分配系数；(2)(2)容量因子容量因子(3)(3)分配系数和容量因子的关系分配系数和容量因子的关系(4)(4)分配系数和容量因子与保管时间关系分配系数和容量因子与保管时间关系k值值相当于相当于组组分被固定相滞留的分被固定相滞留的时间时间和流和流动动相相经过经过系系统统所需所需时间时间的比的比值值tR与与K的关系：的关系： 结论结论：色：色谱谱分分别别前提前提各各组组分分配系数不等分分配系数不等 注：应选择适宜分别条件使得难分别的组分K不等4.4.分分别别参数参数(1) (1) 分分别别因子因子()()两种物两种物质调整保管整保管值之比，又称之比，又称为分配系数比分配系数比或或选择性系数性系数色色谱分分别中的几种情况如下中的几种情况如下图：分分别度度 Rs Rs ，又称分辨率：反映，又称分辨率：反映组分在色分在色谱柱分柱分别情况。情况。(2) (2) 分别度分别度 (Rs) (Rs)分分别度的表达式：度的表达式：R=0.8：两峰的分：两峰的分别别程度可达程度可达89%；R=1：分：分别别程度程度95.4%； 4 R=1.5：达：达99.7% 相相邻邻两峰完全分两峰完全分别别的的规规范范 。1)1)根根据据色色谱峰峰的的个个数数，可可以以判判别样品品中中所所含含组份份的的最少个数最少个数2)2)根根据据色色谱峰峰的的保保管管值( (或或位位置置，可可以以进展展定定性性分析分析3)3)根根据据色色谱峰峰下下的的面面积或或峰峰高高，可可以以进展展定定量量分分析析4)4)色色谱峰峰的的保保管管值及及其其区区域域宽度度，是是评价价色色谱柱柱分分别效能的根据效能的根据5)5)色色谱峰峰两两峰峰间的的间隔隔，是是评价价固固定定相相( (和和流流动相相) )选择能否适宜的根据能否适宜的根据小结：色谱流出曲线的物理意义组分保管分保管时间为何不同？色何不同？色谱峰峰为何何变宽？组分保管分保管时间：色：色谱过程的程的热力学要素控制；力学要素控制； 组分和固定液的构造和性分和固定液的构造和性质色色谱峰峰变宽：色：色谱过程的程的动力学要素控制；力学要素控制； 两相中的运两相中的运动阻力，分散阻力，分散17.3 色谱分别的根本实际色谱分别的根本实际塔板塔板实际速率速率实际 色谱实际需求处理的问题：色谱分别过程的热力学和动力学问题。影响分别及柱效的要素与提高柱效的途径，柱效与分别度的评价目的及其关系。1. 塔板塔板实际实际最早由最早由MartinMartin等人提出塔板等人提出塔板实际，把色，把色谱柱比柱比作一个精作一个精馏塔，沿用精塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描塔中塔板的概念来描画画组分在两相分在两相间的分配行的分配行为，同，同时引人引人实际塔塔板数作板数作为衡量柱效率的目的衡量柱效率的目的塔板实际的四个根本假设塔板实际的四个根本假设i色谱柱是由一系列延续、等距的程度塔板组成。在柱内每层塔板内部，组分可以在两相间迅速到达平衡。ii流动相进入色谱柱不是延续进展的，而是间歇式前进，每次前进为一个塔板体积。iii一切组分开场时存在于第1号塔板上，而且试样沿轴纵向分散可忽略。iv分配系数在一切塔板上是常数。 实际塔板高度和实际塔板数实际塔板高度和实际塔板数H=2/LH=2/Ln=L/Hn=16(tR/W)2n=(tR/ )2n=5.54(tR/W1/2)2实际塔板高度塔板高度(H)和和实际塔板数塔板数(n)都是柱效目的。都是柱效目的。u或或W1/2W1/2，H H ，柱效，柱效u用用tR替代替代tR计算塔板数，称算塔板数，称为有效有效实际塔板数塔板数(nef)；求得的塔板高度；求得的塔板高度为有效有效实际塔板高度塔板高度Hef从上两式可以看出：从上两式可以看出：1 1：色色谱峰峰W W越越小小，n n就就越越大大，而而H H就就越越小小，柱柱效效能能越越高。因此，高。因此，n n和和H H是描画柱效能的目的。是描画柱效能的目的。2 2：在在同同一一色色谱柱柱上上，不不同同组分分得得到到不不同同的的实际塔塔板板数数，同同一一组分分在在不不同同色色谱条条件件下下实际塔塔板板数数也也不不相等。相等。n=16(tR/w)2n=L/H2. 速率实际速率实际19561956年荷年荷兰兰学者范第姆特学者范第姆特 Van DeemterVan Deemter 等在研等在研讨讨气液气液色色谱时谱时，提出了色，提出了色谱过谱过程程动动力学力学实际实际速率速率实际实际。他他们们吸收了塔板吸收了塔板实际实际中板高的概念，并充分思索了中板高的概念，并充分思索了组组分在两相分在两相间间的分散和的分散和传质过传质过程，从而在程，从而在动动力学根底上力学根底上较较好地解好地解释释了影响板高的各种要素。了影响板高的各种要素。该实际该实际模型模型对对气气相、液相色相、液相色谱谱都适用。范第姆特都适用。范第姆特 Van DeemterVan Deemter 方程的方程的数学数学简简化式化式为为式中式中u u为流流动相的相的线速度；速度；A A，B B，C C为常数，分常数，分别代表代表涡流分散流分散项系数、系数、纵向分散向分散项系数、系数、传质阻抗阻抗项系数。系数。 现分分别表达各表达各项系数的物理意系数的物理意义。1涡流分散项的概念涡流分散项的概念 在填充色在填充色谱谱柱中，当柱中，当组组分随流分随流动动相向柱出口迁移相向柱出口迁移时时，流流动动相由于遭到固定相相由于遭到固定相颗颗粒妨碍，不断改粒妨碍，不断改动动流流动动方向，方向，使使组组分分子在前分分子在前进进中构成紊乱的中构成紊乱的类类似似“涡涡流的流流的流动动，故称故称涡涡流分散。流分散。 动画画涡流分散项的影响要素涡流分散项的影响要素1:1:涡涡流分散流分散项项与填充物的平均直径的大小和填充与填充物的平均直径的大小和填充不不规规那么因子有关，与流那么因子有关，与流动动相的性相的性质质、线线速度速度和和组组分性分性质质无关。无关。2:2:为为了减少了减少涡涡流分散，提高柱效，运用流分散，提高柱效，运用细细而均匀而均匀的的颗颗粒，并且填充均匀是非常必要的。粒，并且填充均匀是非常必要的。对对于空于空心毛心毛细细管，不存在管，不存在涡涡流分散。因此流分散。因此A A0 0。 A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子2 2纵向分散项的概念纵向分散项的概念 纵纵向向分分散散是是由由浓浓度度梯梯度度呵呵斥斥的的。组组分分从从柱柱入入口口参参与与，其其浓浓度度分分布布的的构型呈构型呈“塞子状。塞子状。 如如右右图图所所示示。它它随随着着流流动动相相向向前前推推进进，由由于于存存在在浓浓度度梯梯度度，“塞塞子子必必然然自自发发地地向向前前和和向向后后分分散散，呵呵斥斥谱带谱带展展宽宽。动画画 B = 2 Dg ：分散妨碍因子。填充柱色谱， 1.53 3内内内内标标法法法法内内标法法优点：点：进样量不超量量不超量时，反复性及操作条件，反复性及操作条件对结果无影响果无影响只需待只需待测组分和内分和内标物出峰，与其他物出峰，与其他组分能否出峰无关分能否出峰无关 适宜适宜测定微量定微量组分分内内标法缺陷：法缺陷： 制制样要求高；找适宜内要求高；找适宜内标物困物困难；知校正因子；知校正因子4 4 内内内内标对标对比法比法比法比法配制一系列不同配制一系列不同配制一系列不同配制一系列不同浓浓度的度的度的度的对对照液，并参与一照液，并参与一照液，并参与一照液，并参与一样样量的量的量的量的内内内内标标物，物，物，物，进进展分析，展分析，展分析，展分析，测测得得得得AiAi和和和和AsAs，以，以，以，以Ai /AsAi /As浓浓度度度度作作作作图图，得到，得到，得到，得到规规范曲范曲范曲范曲线线。A Ai i / /A As s内内内内标对标对比法知比法知比法知比法知浓浓度度度度样样品品品品对对照法照法照法照法配制等量参与内配制等量参与内配制等量参与内配制等量参与内标标物的物的物的物的样样品溶液和品溶液和品溶液和品溶液和对对照品溶液照品溶液照品溶液照品溶液内内标对比法特点：比法特点： 不需求校正因子不需求校正因子 进样量量对结果影响不大果影响不大 比较峰面峰面积的丈量的丈量2非正常峰非正常峰 不不对对称峰称峰 1对对于正常峰于正常峰 3 3自自自自动动动动求和求和求和求和 自自自自动积动积动积动积分分分分仪仪仪仪或色或色或色或色谱谱谱谱任任任任务务务务站站站站 ： 直接直接直接直接给给给给出出出出A A，h h，W1/2W1/2注注注注：当当当当色色色色谱谱操操操操作作作作条条条条件件件件一一一一定定定定时时，在在在在一一一一定定定定进进样样量量量量范范范范围围内内内内 不超不超不超不超载载，W1/2W1/2W1/2W1/2与与与与进样进样量无关量无关量无关量无关试样中各中各组分分质量与其色量与其色谱峰面峰面积成正比，即：成正比，即：W i = fi Ai 前往前往