酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化1 1、酶制剂的概念和种类、酶制剂的概念和种类（一）酶制剂（一）酶制剂含有酶的制品含有酶的制品定义：定义：多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶和脂肪酶种类：种类：A A、液体酶制剂、液体酶制剂治疗某些胃病的胃蛋白酶液治疗某些胃病的胃蛋白酶液B B、固体酶制剂、固体酶制剂2 2、直接使用、直接使用酶制酶制剂的不足剂的不足天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活剂等条件非常敏感，容易失活溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本了生产成本反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用难以在工业生产中广泛应用（二）固定化酶（二）固定化酶固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂又能发挥催化作用的酶制剂（三）固定化细胞（三）固定化细胞将细胞限制或定位于特定空间位将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术置的方法称为细胞固定化技术被限制或定位于特定空间位置被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞的细胞称为固定化细胞固定化技术：固定化技术：固定化细胞：固定化细胞：类型类型类型类型优点优点优点优点不足不足不足不足直接使直接使直接使直接使用酶用酶用酶用酶催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、低污染等低污染等低污染等低污染等对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产品质量品质量品质量品质量固定化固定化固定化固定化酶酶酶酶酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同又能与产物分离，同又能与产物分离，同又能与产物分离，同时，固定在载体上的时，固定在载体上的时，固定在载体上的时，固定在载体上的酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能得到的得到的得到的得到的固定化固定化固定化固定化细胞细胞细胞细胞成本低、操作容易、成本低、操作容易、成本低、操作容易、成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、对酶活性的影响更小、对酶活性的影响更小、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反可以催化一系列的反可以催化一系列的反可以催化一系列的反应、容易回收应、容易回收应、容易回收应、容易回收固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制受到限制受到限制受到限制（四）（四）（四）（四）直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点（五）（五）酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法1 1、物理吸附法：、物理吸附法： 将酶吸附到固体吸附剂表面的将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等多孔玻璃等2 2、包埋法、包埋法定义：定义：将酶包裹在多孔的载体中，包埋成将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型格子型或包埋成微胶囊型载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺维素和聚丙烯酰胺种类种类凝胶包埋法：凝胶包埋法：将个别酶分子包在高聚物格子将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，这样作可也可以直接包埋在珠状聚合物中，这样作可以使固定化酶机械强度提高以使固定化酶机械强度提高1010倍，并改进酶倍，并改进酶脱落的情况脱落的情况微囊化法：微囊化法：将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既可以使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻既可以使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来来交联法：通过双功能试剂，交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成将酶和酶联结成网状结构网状结构的方法的方法3 3、化学结合法：、化学结合法：定义：定义：将酶分子相互结合，或将其结合到将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式固定方式种类种类共价结合法：共价结合法：酶和载体以共价键酶和载体以共价键的形式结合的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有有氨基、羧基或羟基氨基、羧基或羟基等官能团等官能团（六）酶和细胞固定方法的选择（六）酶和细胞固定方法的选择酶适合采用化学结合和物理吸附法固定酶适合采用化学结合和物理吸附法固定细胞适合采用包埋法固定细胞适合采用包埋法固定1 1、方法、方法2 2、原因、原因细胞个大，酶分子很小细胞个大，酶分子很小个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出酶容易从包埋的材料中漏出二、实验操作二、实验操作（一）方法（一）方法1 1、包埋法固定化细胞、包埋法固定化细胞2 2、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞（二）制备固定化酵母细胞（二）制备固定化酵母细胞1 1、酵母细胞的活化、酵母细胞的活化 过程过程称取称取1g1g干酵母，放入干酵母，放入50ml50ml的小烧杯中，加的小烧杯中，加入蒸馏水入蒸馏水10ml10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置混合均匀，成糊状，放置1h1h左右，使其活化左右，使其活化注意事项注意事项A A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一物种单一B B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于活化就是让处于( )( )的微生物重新恢的微生物重新恢复正常的生活状态复正常的生活状态休眠状态休眠状态2 2、配置物质的量浓度为、配置物质的量浓度为0.05mol/L0.05mol/L的的CaClCaCl2 2溶液溶液 过程过程称取无水称取无水CaClCaCl2 2 0.83g0.83g，放入，放入200ml200ml的烧杯的烧杯中，加入中，加入150ml150ml的蒸馏水，使其充分溶解，的蒸馏水，使其充分溶解，待用待用注意事项注意事项溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果自来水中各种离子影响实验结果3 3、配制海藻酸钠溶液、配制海藻酸钠溶液称取称取0.7g0.7g海藻酸钠，放入海藻酸钠，放入50ml50ml小烧杯中，加入小烧杯中，加入10ml10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至至10ml10ml 过程过程注意事项注意事项加热时要用加热时要用 ，或者，或者 反复几次，直反复几次，直到海藻酸钠溶化为止到海藻酸钠溶化为止小火小火间断加热间断加热海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少的数目少4 4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中至注射器中 过程过程注意事项注意事项A A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌否则会因温度过高杀死酵母菌B B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察免影响实验结果的观察（5 5）固定化酵母细胞）固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的到配制好的CaClCaCl2 2溶液中，将形成的凝胶珠在溶液中，将形成的凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30min30min左右左右 过程过程注意事项注意事项A A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照珠，用作对照B B、海藻酸钠胶体在、海藻酸钠胶体在CaClCaCl2 2这种电解质的作用这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min30min左右左右（三）用固定化酵母细胞发酵（三）用固定化酵母细胞发酵将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2 23 3次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液1 1、过程、过程刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaCl2CaCl2溶液中浸泡一段时间，溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的也能表明制备的凝胶珠是成功的将将150ml150ml质量分数为质量分数为1010的葡萄糖溶液转移的葡萄糖溶液转移至至200ml200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于胞，置于25C25C下发酵下发酵24h24h2 2、注意事项、注意事项控制好发酵温度，一般是室温控制好发酵温度，一般是室温25 C25 C发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显长一些，效果明显可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果照实验结果（一）观察凝胶珠的颜色和形状（一）观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。要再作尝试。（二）观察发酵的葡萄糖溶液（二）观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味到产生了很多气泡，同时会闻到酒味课题成果评价课题成果评价