染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀Chromatin immunoprecipitation第一页，共三十一页。基因型决定基因型决定(judng)表表型型第二页，共三十一页。破坏破坏(phui)了基因型也就改变了表型了基因型也就改变了表型第三页，共三十一页。但是，也有一些但是，也有一些(yxi)无法解释的现象无法解释的现象 在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况(qngkung)(qngkung)下，一些生物体的表型却发生了改变。下，一些生物体的表型却发生了改变。 第四页，共三十一页。什么什么(shn me)是表观遗传学是表观遗传学?是是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的变化及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的变化(binhu)并不涉及并不涉及DNA序列的突变。序列的突变。第五页，共三十一页。表观表观(bio un)遗传修饰遗传修饰 在不影响在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被称为影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被称为“表表观遗传修饰观遗传修饰”，并被认为是导致，并被认为是导致(dozh)遗传物质一致的孪生子遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。出现个体差异的主要原因。第六页，共三十一页。染色质重塑染色质重塑染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑造染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与其包绕与其包绕的的核心组蛋白核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变使得染色质结构之间亲和力的变化或相对位置的改变使得染色质结构变得较为松散，变得较为松散，DNA更易于暴露。染色质重塑就是通过这样的变更易于暴露。染色质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。化来调控基因的转录。在狭义上，染色质重塑专指由在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖于提供能量的、通过依赖于ATP的的染色质重塑复合物改变组蛋白与染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合的结合(jih)状态，在靠近核状态，在靠近核心组蛋白的心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使转录因子较易于接近表面建立特殊的构象，使转录因子较易于接近DNA的过程。的过程。 第七页，共三十一页。染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(jsh)的发展使染色质重塑研究得以进步的发展使染色质重塑研究得以进步第八页，共三十一页。实验实验(shyn)目的目的学习掌握学习掌握(zhngw)(zhngw)染色质免疫沉淀技术的基本原理与关染色质免疫沉淀技术的基本原理与关键的操作步骤。键的操作步骤。第九页，共三十一页。实验实验(shyn)原理原理第十页，共三十一页。实验实验(shyn)流程流程一、交联及染色质一、交联及染色质DNA剪切条件的优化剪切条件的优化1.准备准备(zhnbi)一瓶接近长满的一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓的甲醛至终浓度为度为1%，轻轻摇匀，在，轻轻摇匀，在37孵育孵育10分钟分钟。 甲醛的作用甲醛的作用 细胞的用量细胞的用量 交联条件对实验结果的影响交联条件对实验结果的影响2.弃培养液，用预冷至弃培养液，用预冷至4带蛋白酶抑制剂带蛋白酶抑制剂PMSF的的1PBS洗细胞两次，刮细洗细胞两次，刮细胞到一个胞到一个2ml离心管，离心管，2000rpm，4离心离心4min收集细胞。收集细胞。 第十一页，共三十一页。 甲醛的作用甲醛的作用 在各种交联试剂中，甲醛（在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白质质-DNA、蛋白质、蛋白质-RNA以及蛋白质以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，防止细胞蛋白质，形成生物复合体，防止细胞(xbo)内组内组分的重新分布。除此之外，分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为1%，在，在12-37作用作用30min。但是如果反应温度超过。但是如果反应温度超过30，本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交，本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想长度的理时不能获得理想长度的DNA片段及影响片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的蛋白质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。的甘氨酸终止。第十二页，共三十一页。细胞的用量细胞的用量 通常通常2.5108细胞足够进行细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量，采取次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量，采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（一般离心管中，培养液重悬，计数。（一般分装分装1107细胞于一个细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。管，用于免疫沉淀反应）。 交联条件对实验结果的影响交联条件对实验结果的影响 对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度(wnd)都需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则都需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长度会片段的平均长度会小于小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性，交联时间通常为阴性，交联时间通常为5分钟到分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。个小时，具体时间根据实验而定。 第十三页，共三十一页。3. 用用500l预热至室温带有蛋白酶抑制剂的预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬并裂裂解液重悬并裂解细胞解细胞(xbo)，冰浴，冰浴10分钟；分钟；4.超声波处理剪切染色质超声波处理剪切染色质DNA，使其形成，使其形成300-1000 bp即大即大约相当于约相当于2-5个核小体长度的片段；个核小体长度的片段； 超声条件对实验的影响及超声注意事项超声条件对实验的影响及超声注意事项 设置超声破碎的条件设置超声破碎的条件 酶消化与超声消化相比较的区别酶消化与超声消化相比较的区别第十四页，共三十一页。 超声条件对实验的影响及超声注意事项超声条件对实验的影响及超声注意事项 超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而这都会引起蛋白质变性，进而(jn r)影响影响ChIP的效率。所以在超的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 第十五页，共三十一页。 设置超声破碎的条件设置超声破碎的条件超声处理的条件通常可以设置为超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共秒每次，共3-4次，功率为次，功率为50W时时设置为最大功率的设置为最大功率的30%，采用，采用2mm超声头。不同超声头。不同(b tn)的超声处的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同同(b tn)的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组分基因组DNA断裂成断裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超声体大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。件用于后续实验。 第十六页，共三十一页。 酶消化与超声消化相比较的区别酶消化与超声消化相比较的区别Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和和DNA-蛋白复合物的损蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用冻样品。在研究组蛋白时，经常采用(ciyng)没经过甲醛固定的没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为）的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。和的样品。Millipore公司有商品化的公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的处理的ChIP试剂盒试剂盒（EZ-Enzyme）提供。）提供。 第十七页，共三十一页。Enzyme和和sonication处理结果比较处理结果比较(bjio)第十八页，共三十一页。 超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条件，比较超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条件，比较(bjio)剪切效果。按以下步骤操作比较剪切效果。按以下步骤操作比较(bjio)各种条件下的剪切效果：各种条件下的剪切效果：a. 将超声处理过的样品离心收集上清（将超声处理过的样品离心收集上清（ 4 13000rpm离心离心10分钟），加入分钟），加入10l 0.5 M EDTA、20l 1M Tris-HCl pH6.5、2l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，45 孵育孵育0.5-1 小时；小时；b. 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，中，1.2% 琼脂糖凝胶电泳检查。琼脂糖凝胶电泳检查。实验组实验组12345678超声次数超声次数3691136911超声功率超声功率15W15W15W15W25W25W25W25W此页内容不在正此页内容不在正常的常的ChIP步骤中步骤中第十九页，共三十一页。酚酚/氯仿氯仿(l fn)抽提步骤抽提步骤 按照按照1：1体积体积(tj)比加酚比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相至氯仿充分混匀后离心，取上层水相至新管，加入新管，加入1/10体积体积3M Nacl，2倍体积无水乙醇，大转数离心倍体积无水乙醇，大转数离心5min第二十页，共三十一页。5. 将超声处理过的样品在将超声处理过的样品在4 13000rpm离心离心10分钟收集上清，分钟收集上清，10倍稀释，将倍稀释，将其移入一新其移入一新(y xn)的的2ml EP管中；管中；6. 按照每按照每2ml稀释后液体加入稀释后液体加入75l的比例加入的比例加入蛋白蛋白A-琼脂糖琼脂糖/鲑精鲑精DNA (50%混悬混悬液液)，4摇动摇动30分钟，预处理，分钟，预处理，短暂离心短暂离心(700-1000rpm 4，小于，小于1分钟分钟)，收集上清液；收集上清液； Beads的选择的选择 Input的设置的设置7. 向向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体的抗体(20l)，4摇动过夜，摇动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜；阴性对照组不加抗体同样摇动过夜； 抗体的选择抗体的选择 对照的设置对照的设置 二、免疫沉淀染色质二、免疫沉淀染色质DNA片段片段(pin dun)第二十一页，共三十一页。 Beads的选择的选择(xunz) 利用目的蛋白质的特异抗体利用目的蛋白质的特异抗体(kngt)通过抗原通过抗原-抗体反应形成抗体反应形成DNA-蛋白质蛋白质-抗体复合物，然后使用抗体复合物，然后使用Agarose beads或或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫洗脱免疫沉淀复合物。沉淀复合物。Magna beads是近年来出现的一种新型是近年来出现的一种新型beads，它使，它使用方便，不像用方便，不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去了离心的步骤，节省不少时间。简单，而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新公司最新推出的推出的Magna ChIP试剂盒就是采用这种试剂盒就是采用这种Magna beads。 第二十二页，共三十一页。免疫免疫(miny)共沉淀和染色质免疫共沉淀和染色质免疫(miny)沉淀沉淀input设置设置在进行在进行(jnxng)免疫沉淀步骤前的样品免疫沉淀步骤前的样品第二十三页，共三十一页。染色质免疫沉淀抗体染色质免疫沉淀抗体(kngt)的选择的选择ChIP Validated第二十四页，共三十一页。 对照对照(duzho)的设置的设置 ChIP实验至少应设立实验至少应设立3种对照：种对照：未经免疫沉淀的超声处未经免疫沉淀的超声处理样本（理样本（input）；）；阳性对照。一般用组蛋白抗体或阳性对照。一般用组蛋白抗体或anti-RNA Polymerase II抗体这些比较抗体这些比较(bjio)保守的在所有细胞中都能结合保守的在所有细胞中都能结合基因的蛋白的抗体；基因的蛋白的抗体； 阴性对照。即用一种无关抗体（或相应阴性对照。即用一种无关抗体（或相应动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分别与交联染动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；色质样本进行免疫沉淀反应；选择不与目的蛋白质结合的基因组选择不与目的蛋白质结合的基因组区域作对照，即区域作对照，即“基因组对照基因组对照”。 另外，还应根据对另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实验对的不同的特殊应用设立不同的实验对照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合位点结照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定突变细胞合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定突变细胞株中目的蛋白质与基因组株中目的蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用野生型细胞株结合情况时，必须用野生型细胞株作对照等。作对照等。 第二十五页，共三十一页。8. 加加60l蛋白蛋白A-琼脂糖琼脂糖/鲑精鲑精DNA(50%混悬液混悬液)，4摇摇1小时；小时；9.短暂离心短暂离心(700-1000rpm，4，小于，小于1分钟分钟) 收集沉淀，分别用低盐免收集沉淀，分别用低盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiCl免疫复合物洗液洗涤沉淀各免疫复合物洗液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用一次，每种液体每次用1ml，摇动，摇动3-5分钟后短暂离心收集沉淀。然后用分钟后短暂离心收集沉淀。然后用同样的方法用同样的方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次缓冲液洗涤沉淀两次三、三、PCR鉴定结合鉴定结合(jih)于乙酰化组蛋白于乙酰化组蛋白H3的的DNA片段片段10. 向上步所得沉淀中加入向上步所得沉淀中加入250l洗脱液洗脱液(1% SDS, 0.1M NaHCO3)，震荡，室温孵，震荡，室温孵育育15分钟，离心收集上清；分钟，离心收集上清；第二十六页，共三十一页。11.加入加入10l 0.5M EDTA、20l 1M Tris-HCl pH6.5、和、和2l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，45孵育孵育0.5-1小时；小时；12.酚酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，取中，取1l作模板，按以作模板，按以下配方加样，下配方加样，PCR扩增实验组和对照组以及扩增实验组和对照组以及Input组的组的GAPDH启动子序列，启动子序列，扩增条件扩增条件951分钟，分钟，9530秒、秒、5530秒、秒、7230秒、秒、30个循环，个循环，725分分钟，钟，1.5%琼脂糖电泳检查结果。琼脂糖电泳检查结果。 此步此步DNA纯化可以选择纯化可以选择(xunz)适当的适当的DNA纯化试剂盒纯化试剂盒 PCR的策略的策略 第二十七页，共三十一页。PCR的策略的策略(cl) 引物的选择取决于实验目的。如若鉴定目的蛋白质特异结合的位点，除引物的选择取决于实验目的。如若鉴定目的蛋白质特异结合的位点，除了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点的引物外，至少还应设计一对扩增了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点的引物外，至少还应设计一对扩增的的DNA序列中没有目的蛋白质结合位点的对照引物。对于平均长度为序列中没有目的蛋白质结合位点的对照引物。对于平均长度为500bp的的DNA分子，它的大部分片段长度是分子，它的大部分片段长度是500-1000bp，以至远离真正的结合位点，以至远离真正的结合位点1000bp处的处的DNA序列很可能序列很可能(knng)被抗体共沉淀下来。所以，对照引物扩增被抗体共沉淀下来。所以，对照引物扩增的的DNA区域与实验引物扩增的区域与实验引物扩增的DNA区域之间的距离必须大于区域之间的距离必须大于1000bp。 引物的设计依据通用的引物设计原则。有时为提高扩增产物的特异性，可将引引物的设计依据通用的引物设计原则。有时为提高扩增产物的特异性，可将引物终浓度降低物终浓度降低5-10倍。大多数引物步需要纯化或特殊处理。由于实际上扩增效率倍。大多数引物步需要纯化或特殊处理。由于实际上扩增效率较低，扩增产物不应过长，以较低，扩增产物不应过长，以75-300bp为宜。为宜。 第二十八页，共三十一页。Co-IP和和ChIP的区别的区别(qbi)Co-IPChIP相互作用相互作用蛋白蛋白-蛋白蛋白蛋白蛋白-DNA检测对象检测对象蛋白质蛋白质DNA序列序列检测方法检测方法Western blot/质谱质谱PCR/芯片芯片裂解方式裂解方式裂解液裂解液超声；酶解超声；酶解固定剂固定剂不需要固定剂不需要固定剂甲醛甲醛对抗体的要求对抗体的要求比较高比较高更高（交联对抗原更高（交联对抗原表位的破坏）表位的破坏）第二十九页，共三十一页。第三十页，共三十一页。内容(nirng)总结染色质免疫沉淀。在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下，一些生物体的表型却发生了改变。这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。染色质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。学习(xux)掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关键的操作步骤。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实验对照第三十一页，共三十一页。