pp蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及pp常见问题分析常见问题分析张绍进张绍进1 Western BlotqqWestern Blot简介简介qqWestern Blot一般流程一般流程qqWestern Blot常见问题分析常见问题分析 Western BlotWestern Blot 简介：p印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。p而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western BlotWestern Blot 基本原理基本原理 Western BlotWestern Blot 优点优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原- -抗体反应抗体反应p 1-5ng 1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白 Western BlotWestern BlotWestern Blot应用应用q目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析 Western BlotWestern Blot Western Blot 流程流程l蛋白样品的制备蛋白样品的制备SDS-PAGESDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色 Western Blot?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂最常用的溶剂最常用的溶剂最常用的溶剂 。有机溶剂提取法有机溶剂提取法有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取 Western Blot蛋白样品的定量蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、LowryLowry法（法（法（法（FolinFolin- -酚试剂法）酚试剂法）酚试剂法）酚试剂法）、 BCABCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总：http:/bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.htmlhttp:/bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html Western Blot蛋白样品的变性蛋白样品的变性p2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：pDTT可临用前以可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。冻存。p按按1:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，95100加热加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量，总蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰溴酚兰20%甘油甘油ddH2O Western BlotSDS：p阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂p氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。p蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。p与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。性化。 Western Blot蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1 1）具有相同的形状，形状）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒像一个长椭圆棒（2 2）平均）平均1g 1g 蛋白质结合蛋白质结合1.4g SDS1.4g SDS（3 3）短轴对不同的蛋白质亚）短轴对不同的蛋白质亚基基-SDS-SDS胶束基本上是相同的胶束基本上是相同的（4 4）长轴的长度则与亚基分）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比子量的大小成正比 Western Blotq不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Western BlotSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的样和含有巯基乙醇的样品处理液，品处理液，SDSSDSSDSSDS是一种很强的是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它可以，它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTTDTT）可以可以断开二硫断开二硫键破坏蛋白质的四级结构键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与成单链分子。解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电荷充分结合形成带负电荷的蛋白质的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE基本原理】基本原理】基本原理】基本原理】 Western Blot凝胶成分凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液 Western BlotPAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂(crosslinker)(crosslinker)N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N(N,N-methylenebisacylamide-methylenebisacylamide，简称简称Bis)Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。度。是良好的电泳介质。 Western Blot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（催化剂：过硫酸胺或核黄素（APAP）；）；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)(free radicals)的的催化，使体系发生氧化还原作用催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-(catalyst-redoxredox systems) systems)来完来完成的。催化体系主要有化学催化（成的。催化体系主要有化学催化（APAPTEMEDTEMED）和光化学催化（核）和光化学催化（核黄素黄素TMTEDTMTED）体系。）体系。 Western Blot凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方及分离胶配方表：表：http:/bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html Western Blot不连续电泳：不连续电泳： 作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸系统甘氨酸系统。 Western Blot灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8% Western Blot灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 Western BlotStaking gelSeparating gel Western Blot转膜p要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法。p常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 Western Blot转移膜的选择转移膜的选择p最常用于最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤的转移膜主要是硝酸纤维素（维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙）膜和聚偏二氟乙烯烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龙膜、此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似膜的特点相似,主要用于主要用于核酸杂交。核酸杂交。p各种膜的详细特点介绍：各种膜的详细特点介绍：phttp:/www.bbioo.com/bio101/2008/21461_2.htm Western Blot湿转系统 Western Blot半干转移系统 Western Blot丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略） Western Blot封闭S S为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S S5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h）S SWestern Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司）S STween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。抗体与抗原的结合。 Western Blot一抗、二抗孵育p把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 Western Blot二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP) Western Blot膜解吸方法（膜的重复利用）膜解吸方法（膜的重复利用） p通过加热和去污剂进行解吸通过加热和去污剂进行解吸 原理：原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。p酸解吸酸解吸 原理：原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。 Western BlotWestern Blot结果分析p目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。pWestern Blot结果分析软件结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）绿色版（附动画演示教程）http:/bbs.bbioo.com/thread-44929-1-1.html Western BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析 Western BlotSDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳uu胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？uu凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入加入加入APAP和和和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀均匀均匀均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐 Western Blotuu条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑微笑微笑”或或或或“倒微笑倒微笑倒微笑倒微笑”条带？条带？条带？条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适合适合适合适SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳 Western Blot转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？uu单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“ “三三三三明治明治明治明治” ”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温 Western Blot转移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD10KD2.2.蛋白的等电点蛋白的等电点 93.3.SDSSDS浓度不合适浓度不合适4.4.凝胶太厚凝胶太厚 原原因因对对策策1.1.蛋白分子量蛋白分子量110KD0KD时，减时，减少转膜时间；使用小孔径少转膜时间；使用小孔径的膜的膜2.2.更换高更换高pHpH值值BufferBuffer3.3.在阴极在阴极bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 0.005 - 0.01% SDS 可提可提高转膜效率高转膜效率4.4.延长转膜时间延长转膜时间 Western Blot1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原原因因对对策策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度背景太高 Western Blot杂交信号很弱1.1.抗体保存不当抗体保存不当2.2.抗原不充足抗原不充足3.3.膜的漂洗过度膜的漂洗过度 原原因因对对策策1.1.抗体长期保存应在抗体长期保存应在7070，使用前做效价检测，使用前做效价检测2.2.增加蛋白上样量，做已知增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照标准量蛋白的对照3.3.减少漂洗的时间和次数减少漂洗的时间和次数 Western Blot1.1.一抗不是唯一特一抗不是唯一特异的异的2.2.二抗出现非特异二抗出现非特异结合结合 原因原因对对策策1.1.制备单克隆抗体或者重新选制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点取合成抗原多肽的位点2.2.设立不加一抗，只加二抗的设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有平行对照来检测二抗是否有非特异结合非特异结合出现非特异带 Western BlotFurther Readingsp生物秀生物秀Western Blotting专题专题phttp:/ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm pMillipore的蛋白印迹手册的蛋白印迹手册phttp:/bbs.bbioo.com/thread-45770-1-1.html pBio-Rad的的western Blotting操作手册操作手册phttp:/bbs.bbioo.com/thread-30154-1-1.html pWestern blot问题解答专帖问题解答专帖phttp:/bbs.bbioo.com/thread-40769-1-1.html谢谢大家！谢谢大家！42个人观点供参考，欢迎讨论